核糖体DNA聚合酶链反应诊断新生儿败血症
作者：310003 杭州，浙江医科大学儿童医院(第一作者现在314000嘉兴市第二医院儿科)
单位：滕懿群 孙眉月 尚世强 洪文澜 金益人 陈黎勤
关键词：DNA；核糖体；聚合酶链反应；败血病；婴儿；新生
中华儿科杂志/980711 【摘要】 目的 比较16SrDNA高度保守区引物聚合酶链反应(PCR)与血培养及非特异性诊断指标对新生儿败血症的诊断价值。方法 对131例拟诊为败血症的新生儿血标本进行细菌DNA检测。结果 131例中，PCR检测阳性56例，阳性率为43%，明显高于血培养的阳性率(血培养阳性23例，阳性率18%)。131例拟诊败血症中，发现23例确诊败血症及31例临床败血症，对这54例败血症(血培养阳性23例+临床败血症31例)作PCR检查，结果阳性48例，阴性6例；对131例中的77例“非败血症”病例，PCR检测阴性69例，阳性8例。对血培养阳性的23例进行PCR，结果阳性22例。以血培养作为确诊标准，PCR检测的敏感性为96%，并不受抗生素治疗的影响。30例阴性对照组DNA的PCR分析均为阴性。结论 在严格控制污染的条件下，细菌共同引物PCR技术能为新生儿败血症提供可靠的病原菌诊断依据。
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Clinical evaluation of 16SrDNA PCR in the diagnosis of neonatal septicemia
Teng Yiqun, Sun Meiyue, Shang Shiqiang, et al.
Children′s Hospital, Zhejiang Medical University, Hangzhou 310003
【Abstract 】 Objective To explore the sigrificance of polymerase chain reaction (PCR) amplification of 16SrDNA with highly conserved sequences in the diagnosis of neonatal septicemia in comparison to blood culture and other nonspecific tests, including leukocyte count, platelet count, ratio of immature neutrophil to total number of neutrophil, C-reactive protein and micro blood sedimentation. Methods The authors amplified bacterial DNA in blood specimens from 131 cases of suspected septicemia. Results There were 23 patients with definitive septicemia and 31 patients with clinical septicemia of the 131 suspected patients. Of the 131 cases, 56 were positive by PCR and the positive rate (43%) was significantly higher than that of blood culture (18%). Of 54 cases of septicemia, 48 were positive and 6 were negative by PCR; in 77 cases who were not diagnosed as septicemia, no 16SrDNA was amplified in 69 cases yet in the remaining 8 cases the PCR showed positive result. Of 23 cases of definitive septicemia, 22 cases were found positive. When blood culture was regarded as “gold standard”, the sensitivity of PCR was 96%. PCR amplification was not affected by antibiotics. No signal was observed when DNA from 30 controls was used as templates. Conclusion 16SrDNA PCR amplification, having high sensitivity and specificity, may become a reliable way for the etidogic diagnosis of neonatal septicemia when strict caution is taken to control contamination.
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【Key words】 DNA, ribosomal Polymerase chain reaetion Septicemia Infant, newborn
尽管抗生素和支持治疗的进展，新生儿败血症仍严重影响新生儿，尤其是早产儿的存活率，病死率约占15%～30%，并发脑膜炎的存活者中，30%～50%可发生各种后遗症[1]。至今尚缺乏快速、准确诊断败血症的方法。因此，如何早期诊断败血症一直是人们关注的研究课题。本研究对131份拟诊为败血症患儿的血标本检测了细菌DNA，并与血培养及非特异性诊断方法相对照，取得较好结果。
资料及方法
一、对象
1.病例组：1996年3月～1997年3月，具有败血症高危因素的131例拟诊为败血症住本院的新生儿。参照1987年全国新生儿学术会议制定的《新生儿败血症诊断标准修订方案》[2]，败血症分为血培养阳性的确诊败血症及临床败血症，临床败血症指具有临床症状及实验室检查中外周血白细胞(WBC)、血小板(PLT)、未成熟中性粒细胞与中性粒细胞总数之比值(I/T)、C-反应蛋白(CRP)、微量血沉(mESR)等5项非特异性诊断指标中至少两项阳性者。131例的血标本中，包括23例确诊败血症标本和31例临床败血症血标本。
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2.阴性对照组：同期住院的非感染性疾病患儿外周血标本30份。
二、方法
1.控制污染：标本采集过程中，专人操作，专用房间，每天紫外线消毒两次，每次1小时；操作台每天湿擦两次；操作者抽血前洗手，戴口罩；研究对象抽血前洗澡或洗净局部皮肤后以碘酊、洒精消毒，消毒范围直径>5 cm，待碘酊自然干燥后酒精脱碘两次；采血后更换针头，将血标本注入EP管和培养基内。
聚合酶链反应(PCR)操作过程中，所有器皿洗净后均经15磅、20分钟高压蒸汽灭菌；所用试剂均以0.22 μm孔径滤菌器过滤除菌并分装；标本在超净台上处理，使用一次性吸头；PCR扩增、产物分析在不同隔离区进行；标本操作室每天紫外线消毒两次，每次1小时。
2.标本采集：所有血标本均于患儿入院后治疗前采集，用高压蒸汽灭菌肝素化的1.5 ml EP管收集血标本0.5 ml，于-20℃冰箱中保存备用。
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3.外周血DNA制备：用本实验室建立的方法[3]。
4.PCR检测：自行设计16SrDNA高度保守区引物，由上海细胞生物所381型仪合成，引物序列为p15′TGCGGTTGGATCACCTCCT3′，P25′TCCCCACCTTCCTCCAGTT3′，扩增产物为371 bp。实验程序：总体积50 μl，取样本DNA 8 μl，加引物、4dNTPs、Tag酶等，50 μl液体石蜡覆盖，94℃1分钟，56℃1分钟，72℃1分钟，循环35次，72℃保留7分钟。Tag酶、4dNTPs，购于美国Promega公司。
5.扩增产物分析：取10 μl扩增产物在2%琼脂凝胶电泳，含溴化乙锭0.5 μg/ml，紫外灯下观察结果。每次实验均设阳性、阴性及空白对照。
6.CRP测定：采用免疫透射比浊法，用分光光度仪测定，>10.15 mg/L为异常。试剂盒购自温州伊利康生物技术有限公司。
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7.mESR测定：用肝素化的标准微量红细胞压积管，采集外周血75 μl，垂直放置1小时后，测量红细胞下降的高度，>15 mm/h为异常。
8.外周血常规WBC<5.0×109/L或3天后>20.0×109/L，PLT<100.0×109/L，I/T≥0.2为异常。
三、统计学方法
采用配对计数资料的χ2检验。
结果
一、病例组的临床诊断结果
131例拟诊败血症中，血培养阳性确诊为败血症23例；5项非特异性诊断指标≥2项阳性的临床败血症31例，故共计诊断为败血症者54例。血培养阴性及不符合临床败血症的“非败血症”77例。
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二、PCR分析结果
对54例败血症病例，PCR检测发现阳性48例，阴性6例。除败血症54例以外，其余77例PCR检测阴性69例，阳性8例。
三、PCR检测结果与血培养结果比较
收集到的131例血标本进行PCR扩增，共发现阳性56例，阳性率为43%；而血培养阳性23例，阳性率为18%。用配对计数资料的χ2检测，PCR与血培养结果进行比较，差异有显著意义(χ2=31.11，P<0.05)，示PCR法阳性率高于血培养(表1)。
表1 131例血标本PCR与血培养检测结果比较(例数) PCR检测
血培养检测
+
, 百拇医药
-
合计
+
22
34
56
-
1
74
75
合计
23
108
131
, 百拇医药
四、抗生素对血培养及PCR阳性检出率的影响
131例患儿中，有48例入院前已接受抗生素治疗。用配对计数资料的χ2检验，结果显示血培养与抗生素治疗有关(χ2=9.32，P<0.05)(表2)；而PCR检测受抗生素治疗影响较小(χ2=1.07，P>0.05)(表2)。
表2 抗生素治疗对血培养及PCR阳性检出率
影响比较(例数) 抗生素
血培养检测
PCR检测
+
-
合计
, 百拇医药
+
-
合计
已用
2
46
48
22
26
48
未用
21
62
83
, 百拇医药
34
49
83
合计
23
108
131
56
75
131
χ2值
9.32
1.07
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P值
<0.05
>0.05
五、PCR检测的特异性 30例阴性对照组血标本，经PCR检测细菌DNA，结果均为阴性。
六、PCR检测的敏感性
对23例血培养阳性标本，PCR检测阳性22例，以血培养作为败血症确诊标准，PCR检测的敏感性为96%。
讨论
PCR技术是近几年发展起来的分子生物学诊断方法，因操作简单、快速、敏感性高，在感染性疾病病原诊断方面得到迅速发展。为克服一般PCR仅检测单一菌株的限制，进入90年代以来，开始了用细菌16SrDNA高度保守区引物PCR，对标准菌株及儿科标本培养阳性分离菌株进行检测，尚未见用共同引物PCR对临床标本直接探测细菌DNA的报道[4～6]。本组研究对131例疑似败血症患儿血标本进行PCR检测，阳性率为43%，明显优于血培养。以血培养作为败血症确诊标准，PCR检测的敏感性达96%。对30例同期住院的非感染性疾病新生儿DNA的PCR分析结果均阴性，表明共同引物PCR具有高度的敏感性和特异性。本研究还发现抗生素可影响培养结果，而PCR检出结果与抗生素治疗比较，差异无显著意义，说明PCR能检测标本中存在的细菌DNA，而受抗生素治疗的影响较小。
, 百拇医药
本研究中确诊败血症及临床败血症共54例，6例PCR检测阴性。分析其原因，有可能为PCR反应体系中血红蛋白等抑制物存在较多，或抽提过程中细菌DNA的丢失，致成假阴性。但也不排除非特异性检查指标误诊的临床败血症，Philip[7]报道根据5项非特异性实验结果综合评价诊断的败血症病例，有13%为假阳性结果。
血培养阴性及不符合临床败血症的“非败血症”患儿77例中，PCR检测发现阳性8例。分析8例PCR检测与败血症诊断不符合的原因：(1)存在要求特殊培养，难于培养甚至根本不能用人工方法培养的细菌。本研究发现1例普通血培养阴性，L型培养见肠球菌L型生长。PCR从基因水平直接检测细菌DNA，大大增加可检测的细菌种类，能检测出普通培养阴性的漏诊病例。(2)非特异性检验指标有假阴性结果的可能。Philip报道，约存在7%的假阴性。本研究发现3例血培养阴性，非特异性检测指标亦未达2项阳性者，经临床证实并发化脓性脑膜炎，其中一例脑脊液培养出表皮葡萄球菌。因此，PCR检测“非败血症”病例8例阳性结果，很有可能提示为真正的败血症。(3)30例对照组PCR检测结果均阴性，表明检测的特异性高，但是也不完全排除污染的可能性，尤其是PCR试剂中所用酶的细菌DNA污染。
, 百拇医药
为提高诊断的可靠性，细菌共同引物PCR运用于临床时，本研究首先制定了严格的控制污染措施，标本采集过程和PCR操作过程各个环节强调了对污染的控制，包括所有试剂的过滤除菌，为新生儿败血症诊断提供科学的细菌感染依据。
细菌共同引物PCR，可直接检测细菌DNA，判断是否存在细菌感染，但尚不能说明感染的细菌种类，有待于今后在共同引物PCR扩增基础上，作进一步研究，如G+、G-探针检测、测序分析等对DNA产物进行分类鉴定，更好地指导临床治疗。
参考文献
1 孙眉月.新生儿败血症诊治进展.实用儿科临床杂志，1993，8：242-244.
2 吴仕孝.新生儿败血症诊断标准修订方案.中华儿科杂志，1988，26：163-164.
, 百拇医药
3 尚世强，洪文澜，石一复，等.应用聚合酶链反应检测各孕期孕妇弓形虫感染.中国优生优育，1996，7：168-170.
4 Wilson KH, Blitchington RB, Greene RC. Amplification of bacterial 16S ribosomal DNA with polymerase chain reaction. J Clin Microbiol, 1990, 28:1942-1946.
5 Greisen K, Locffelholz M, Purohit A, et al. PCR primers and probes for the 16S rDNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid. J Chin Microbiol, 1994, 32:335-351.
6 McCabe KM, Khan G, Yao Z, et al. Amplification of bacterial DNA using highly conserved sequences: Automated analysis and potential for molecular triage of sepsis. Pediatrics, 1995, 95:165-169.
7 Philip AGS. Neonatal sepsis and meningitis. Hall: Medical Publishers, 1985. 99-102., 百拇医药
单位：滕懿群 孙眉月 尚世强 洪文澜 金益人 陈黎勤
关键词：DNA；核糖体；聚合酶链反应；败血病；婴儿；新生
中华儿科杂志/980711 【摘要】 目的 比较16SrDNA高度保守区引物聚合酶链反应(PCR)与血培养及非特异性诊断指标对新生儿败血症的诊断价值。方法 对131例拟诊为败血症的新生儿血标本进行细菌DNA检测。结果 131例中，PCR检测阳性56例，阳性率为43%，明显高于血培养的阳性率(血培养阳性23例，阳性率18%)。131例拟诊败血症中，发现23例确诊败血症及31例临床败血症，对这54例败血症(血培养阳性23例+临床败血症31例)作PCR检查，结果阳性48例，阴性6例；对131例中的77例“非败血症”病例，PCR检测阴性69例，阳性8例。对血培养阳性的23例进行PCR，结果阳性22例。以血培养作为确诊标准，PCR检测的敏感性为96%，并不受抗生素治疗的影响。30例阴性对照组DNA的PCR分析均为阴性。结论 在严格控制污染的条件下，细菌共同引物PCR技术能为新生儿败血症提供可靠的病原菌诊断依据。
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Clinical evaluation of 16SrDNA PCR in the diagnosis of neonatal septicemia
Teng Yiqun, Sun Meiyue, Shang Shiqiang, et al.
Children′s Hospital, Zhejiang Medical University, Hangzhou 310003
【Abstract 】 Objective To explore the sigrificance of polymerase chain reaction (PCR) amplification of 16SrDNA with highly conserved sequences in the diagnosis of neonatal septicemia in comparison to blood culture and other nonspecific tests, including leukocyte count, platelet count, ratio of immature neutrophil to total number of neutrophil, C-reactive protein and micro blood sedimentation. Methods The authors amplified bacterial DNA in blood specimens from 131 cases of suspected septicemia. Results There were 23 patients with definitive septicemia and 31 patients with clinical septicemia of the 131 suspected patients. Of the 131 cases, 56 were positive by PCR and the positive rate (43%) was significantly higher than that of blood culture (18%). Of 54 cases of septicemia, 48 were positive and 6 were negative by PCR; in 77 cases who were not diagnosed as septicemia, no 16SrDNA was amplified in 69 cases yet in the remaining 8 cases the PCR showed positive result. Of 23 cases of definitive septicemia, 22 cases were found positive. When blood culture was regarded as “gold standard”, the sensitivity of PCR was 96%. PCR amplification was not affected by antibiotics. No signal was observed when DNA from 30 controls was used as templates. Conclusion 16SrDNA PCR amplification, having high sensitivity and specificity, may become a reliable way for the etidogic diagnosis of neonatal septicemia when strict caution is taken to control contamination.
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【Key words】 DNA, ribosomal Polymerase chain reaetion Septicemia Infant, newborn
尽管抗生素和支持治疗的进展，新生儿败血症仍严重影响新生儿，尤其是早产儿的存活率，病死率约占15%～30%，并发脑膜炎的存活者中，30%～50%可发生各种后遗症[1]。至今尚缺乏快速、准确诊断败血症的方法。因此，如何早期诊断败血症一直是人们关注的研究课题。本研究对131份拟诊为败血症患儿的血标本检测了细菌DNA，并与血培养及非特异性诊断方法相对照，取得较好结果。
资料及方法
一、对象
1.病例组：1996年3月～1997年3月，具有败血症高危因素的131例拟诊为败血症住本院的新生儿。参照1987年全国新生儿学术会议制定的《新生儿败血症诊断标准修订方案》[2]，败血症分为血培养阳性的确诊败血症及临床败血症，临床败血症指具有临床症状及实验室检查中外周血白细胞(WBC)、血小板(PLT)、未成熟中性粒细胞与中性粒细胞总数之比值(I/T)、C-反应蛋白(CRP)、微量血沉(mESR)等5项非特异性诊断指标中至少两项阳性者。131例的血标本中，包括23例确诊败血症标本和31例临床败血症血标本。
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2.阴性对照组：同期住院的非感染性疾病患儿外周血标本30份。
二、方法
1.控制污染：标本采集过程中，专人操作，专用房间，每天紫外线消毒两次，每次1小时；操作台每天湿擦两次；操作者抽血前洗手，戴口罩；研究对象抽血前洗澡或洗净局部皮肤后以碘酊、洒精消毒，消毒范围直径>5 cm，待碘酊自然干燥后酒精脱碘两次；采血后更换针头，将血标本注入EP管和培养基内。
聚合酶链反应(PCR)操作过程中，所有器皿洗净后均经15磅、20分钟高压蒸汽灭菌；所用试剂均以0.22 μm孔径滤菌器过滤除菌并分装；标本在超净台上处理，使用一次性吸头；PCR扩增、产物分析在不同隔离区进行；标本操作室每天紫外线消毒两次，每次1小时。
2.标本采集：所有血标本均于患儿入院后治疗前采集，用高压蒸汽灭菌肝素化的1.5 ml EP管收集血标本0.5 ml，于-20℃冰箱中保存备用。
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3.外周血DNA制备：用本实验室建立的方法[3]。
4.PCR检测：自行设计16SrDNA高度保守区引物，由上海细胞生物所381型仪合成，引物序列为p15′TGCGGTTGGATCACCTCCT3′，P25′TCCCCACCTTCCTCCAGTT3′，扩增产物为371 bp。实验程序：总体积50 μl，取样本DNA 8 μl，加引物、4dNTPs、Tag酶等，50 μl液体石蜡覆盖，94℃1分钟，56℃1分钟，72℃1分钟，循环35次，72℃保留7分钟。Tag酶、4dNTPs，购于美国Promega公司。
5.扩增产物分析：取10 μl扩增产物在2%琼脂凝胶电泳，含溴化乙锭0.5 μg/ml，紫外灯下观察结果。每次实验均设阳性、阴性及空白对照。
6.CRP测定：采用免疫透射比浊法，用分光光度仪测定，>10.15 mg/L为异常。试剂盒购自温州伊利康生物技术有限公司。
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7.mESR测定：用肝素化的标准微量红细胞压积管，采集外周血75 μl，垂直放置1小时后，测量红细胞下降的高度，>15 mm/h为异常。
8.外周血常规WBC<5.0×109/L或3天后>20.0×109/L，PLT<100.0×109/L，I/T≥0.2为异常。
三、统计学方法
采用配对计数资料的χ2检验。
结果
一、病例组的临床诊断结果
131例拟诊败血症中，血培养阳性确诊为败血症23例；5项非特异性诊断指标≥2项阳性的临床败血症31例，故共计诊断为败血症者54例。血培养阴性及不符合临床败血症的“非败血症”77例。
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二、PCR分析结果
对54例败血症病例，PCR检测发现阳性48例，阴性6例。除败血症54例以外，其余77例PCR检测阴性69例，阳性8例。
三、PCR检测结果与血培养结果比较
收集到的131例血标本进行PCR扩增，共发现阳性56例，阳性率为43%；而血培养阳性23例，阳性率为18%。用配对计数资料的χ2检测，PCR与血培养结果进行比较，差异有显著意义(χ2=31.11，P<0.05)，示PCR法阳性率高于血培养(表1)。
表1 131例血标本PCR与血培养检测结果比较(例数) PCR检测
血培养检测
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合计
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74
75
合计
23
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四、抗生素对血培养及PCR阳性检出率的影响
131例患儿中，有48例入院前已接受抗生素治疗。用配对计数资料的χ2检验，结果显示血培养与抗生素治疗有关(χ2=9.32，P<0.05)(表2)；而PCR检测受抗生素治疗影响较小(χ2=1.07，P>0.05)(表2)。
表2 抗生素治疗对血培养及PCR阳性检出率
影响比较(例数) 抗生素
血培养检测
PCR检测
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合计
已用
2
46
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合计
23
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χ2值
9.32
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P值
<0.05
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五、PCR检测的特异性 30例阴性对照组血标本，经PCR检测细菌DNA，结果均为阴性。
六、PCR检测的敏感性
对23例血培养阳性标本，PCR检测阳性22例，以血培养作为败血症确诊标准，PCR检测的敏感性为96%。
讨论
PCR技术是近几年发展起来的分子生物学诊断方法，因操作简单、快速、敏感性高，在感染性疾病病原诊断方面得到迅速发展。为克服一般PCR仅检测单一菌株的限制，进入90年代以来，开始了用细菌16SrDNA高度保守区引物PCR，对标准菌株及儿科标本培养阳性分离菌株进行检测，尚未见用共同引物PCR对临床标本直接探测细菌DNA的报道[4～6]。本组研究对131例疑似败血症患儿血标本进行PCR检测，阳性率为43%，明显优于血培养。以血培养作为败血症确诊标准，PCR检测的敏感性达96%。对30例同期住院的非感染性疾病新生儿DNA的PCR分析结果均阴性，表明共同引物PCR具有高度的敏感性和特异性。本研究还发现抗生素可影响培养结果，而PCR检出结果与抗生素治疗比较，差异无显著意义，说明PCR能检测标本中存在的细菌DNA，而受抗生素治疗的影响较小。
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本研究中确诊败血症及临床败血症共54例，6例PCR检测阴性。分析其原因，有可能为PCR反应体系中血红蛋白等抑制物存在较多，或抽提过程中细菌DNA的丢失，致成假阴性。但也不排除非特异性检查指标误诊的临床败血症，Philip[7]报道根据5项非特异性实验结果综合评价诊断的败血症病例，有13%为假阳性结果。
血培养阴性及不符合临床败血症的“非败血症”患儿77例中，PCR检测发现阳性8例。分析8例PCR检测与败血症诊断不符合的原因：(1)存在要求特殊培养，难于培养甚至根本不能用人工方法培养的细菌。本研究发现1例普通血培养阴性，L型培养见肠球菌L型生长。PCR从基因水平直接检测细菌DNA，大大增加可检测的细菌种类，能检测出普通培养阴性的漏诊病例。(2)非特异性检验指标有假阴性结果的可能。Philip报道，约存在7%的假阴性。本研究发现3例血培养阴性，非特异性检测指标亦未达2项阳性者，经临床证实并发化脓性脑膜炎，其中一例脑脊液培养出表皮葡萄球菌。因此，PCR检测“非败血症”病例8例阳性结果，很有可能提示为真正的败血症。(3)30例对照组PCR检测结果均阴性，表明检测的特异性高，但是也不完全排除污染的可能性，尤其是PCR试剂中所用酶的细菌DNA污染。
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为提高诊断的可靠性，细菌共同引物PCR运用于临床时，本研究首先制定了严格的控制污染措施，标本采集过程和PCR操作过程各个环节强调了对污染的控制，包括所有试剂的过滤除菌，为新生儿败血症诊断提供科学的细菌感染依据。
细菌共同引物PCR，可直接检测细菌DNA，判断是否存在细菌感染，但尚不能说明感染的细菌种类，有待于今后在共同引物PCR扩增基础上，作进一步研究，如G+、G-探针检测、测序分析等对DNA产物进行分类鉴定，更好地指导临床治疗。
参考文献
1 孙眉月.新生儿败血症诊治进展.实用儿科临床杂志，1993，8：242-244.
2 吴仕孝.新生儿败血症诊断标准修订方案.中华儿科杂志，1988，26：163-164.
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3 尚世强，洪文澜，石一复，等.应用聚合酶链反应检测各孕期孕妇弓形虫感染.中国优生优育，1996，7：168-170.
4 Wilson KH, Blitchington RB, Greene RC. Amplification of bacterial 16S ribosomal DNA with polymerase chain reaction. J Clin Microbiol, 1990, 28:1942-1946.
5 Greisen K, Locffelholz M, Purohit A, et al. PCR primers and probes for the 16S rDNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid. J Chin Microbiol, 1994, 32:335-351.
6 McCabe KM, Khan G, Yao Z, et al. Amplification of bacterial DNA using highly conserved sequences: Automated analysis and potential for molecular triage of sepsis. Pediatrics, 1995, 95:165-169.
7 Philip AGS. Neonatal sepsis and meningitis. Hall: Medical Publishers, 1985. 99-102., 百拇医药