fas基因与bcl-2反义RNA转导胃癌耐药细胞的药敏上调效应
作者：肖 冰 时永全 赵燕秋 尤 涵 王佐佑 刘宪玲 尹 芳 乔太东 樊代明
单位：
关键词：药物筛选试验，抗肿瘤；肿瘤细胞，培养的；胃肿瘤/病理学；原癌基因蛋白质类；细胞凋亡
Transduction of fas gene or bclTransduction of fas gene or bcl-2 antisense RNA sensitizes cultured drug resistant gastric cancer cells to chemotherapeutic drugs
XIAO Bing, SHI Yong-Quan, ZHAO Yan-Qiu, YOU Han, WANG Zuo-You, LIU Xian-Ling, YIN Fang, QIAO Tai-Dong and FAN Dai-Ming
, http://www.100md.com
Department of Gastroenterology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi＇an 710032, Shaanxi Province, China
Subject headings drug screening assays, antitumor; tumor cells, cultured; stomach neoplasms/pathology; proto-oncogene proteins; apoptosis; Fas gene; bcl-2 gene
Abstract
AIM To compare the expression level of fas gene and bcl-2 gene in gastric cancer cells SGC7901 and in gastric cancer MDR cells SGC7901/ VCR, to transduce fas cDNA and bcl-2 antisense nucleic acid into SGC7901/ VCR cells respectively, and to observe the expression of two genes in transfectants and non-transfectants as well as their drug sensitivity.
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METHODS The eukaryotic expression vector pBK-fas and pDOR-anti bcl-2 was constructed, and then transfected into SGC7901/ VCR cells by lipofectamine, respectively. The expression of mRNA and protein in SGC7901/ VCR cells and SGC7901 cells and transfectants was detected using Northern blot and Western blot and the drug sensitivity of transfectants for VCR, CDDP and 5-FU was analysed with MTT assay.
RESULTS After gene transfection, 80 for fas or 120 for antisense bcl-2 drug-resistant clones were selected from 2×105 cells, the transfection efficiency was 0.04% and 0.06%, respectively. Two clones, SGC7901 fas/ VCR cells and SGC7901 anti-bcl-2/ VCR cells, were randomly selected for further incubation. Hybridization results showed that the expression level of fas mRNA and protein in SGC7901/ VCR cells was much lower, but the expression level of bcl-2 mRNA and protein was higher than that in SGC7901 cells, the expression level of fas mRNA and protein in SGC7901 fas/ VCR cells was higher, and the expression level of bcl-2 mRNA and protein was lower in SGC7901 anti bcl-2/ VCR cells than that in non-transfectants. MTT assay showed that transfectants were more sensitive to VCR, CDDP and 5-FU than non-transfectants.
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CONCLUSION bcl-2 gene displayed high expression and fas gene displayed low expression in drug resistant gastric cancer cells. Expression of bcl-2 protein was effectively blocked in SGC7901 anti bcl-2/ VCR cells by gene transfection, in contrast, the expression of fas mRNA and protein in SGC7901 fas/ VCR cells increased. Fas gene and bcl-2 antisense nucleic acid transfection sensitized drug resistant gastric cancer cells to chemotherapeutic drugs.
中国图书资料分类号 R 979.1
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摘 要
目的 比较fas基因和bcl-2基因在胃癌耐药细胞与非耐药细胞表达的差异，将fas基因和bcl-2反义核酸导入胃癌耐药细胞，并分析转导前后的细胞在mRNA与蛋白的表达水平，研究转导株与非转导株对化疗药物敏感性的区别.
方法 采用分子克隆技术将fas 基因和反义bcl-2片段分别插入真核表达载体pBK-CMV和pDOR-SV40的多克隆克隆位点之间，以脂质体介导法将两个重组表达载体分别转染受体细胞SGC7901/ VCR，G418筛选克隆细胞，Northern blot, Western blot检测耐药细胞与非耐药细胞以及转导细胞中fas基因和bcl-2基因mRNA及其蛋白的表达，MTT法药敏实验检测转导细胞与非转导细胞对VCR、顺铂、5-FU 的敏感性.
结果 真核表达载体pBK-fas cDNA和pDOR-bcl-2 cDNA转导胃癌耐药细胞后，分别从2×105细胞中筛选出大约80和120个抗性克隆，转导率各为0.4‰和0.6‰，随机各挑选2个克隆继续筛选与扩增培养，均获得了稳定的抗性细胞，我们将此命名为SGC7901 fas/ VCR cell和SGC7901 anti bcl-2/ VCR cell. 杂交结果表明，胃癌耐药细胞SGC7901/ VCR与非耐药细胞相比，bcl-2基因的表达明显较高，而fas基因表达极其微弱. 转导株SGC7901 fas/ VCR cell的fas mRNA及其蛋白水平的表达显著高于非转导株，SGC7901 anti bcl-2/ VCR cell中bcl-2蛋白的表达明显低于非转导株. 2株转导细胞对VCR、顺铂、5-FU的敏感性明显高于非转导株.
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结论 胃癌耐药细胞与非耐药细胞相比，bcl-2基因处于高表达状态，而fas基因处于极其低弱的表达状态. 通过脂质体介导的基因转染，有效地阻断了bcl-2蛋白在SGC7901 anti bcl-2/ VCR cell的表达，明显增强了fas mRNA及其蛋白在SGC7901 fas/ VCR cell的表达. bcl-2反义核酸和fas基因转导胃癌耐药细胞后，对化疗药物的敏感性明显增加.
0 引言
化疗是治疗肿瘤的主要方法之一，但目前所选用的化疗药物和用药方案，难以达到满意的疗效，其重要的原因之一就是肿瘤细胞对抗癌药物产生了耐药现象. 要想提高化疗效果，就必须解决多药耐药的问题. 近年研究表明，肿瘤细胞凋亡信息的抑制、细胞寿命的延长是产生多药耐药的机制之一[1]. 因此，有人提出通过诱导或促进细胞凋亡来逆转肿瘤细胞的耐药现象. 我们将促进凋亡的fas基因和bcl-2反义RNA导入胃癌耐药细胞SGC7901/ VCR，并观察了目的基因在转导株的表达及分析了转导株对化疗药物的敏感性，可望为逆转胃癌细胞多药耐药现象的研究奠定基础.
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1 材料和方法
1.1 材料 胃癌耐药细胞SGC7901/ VCR及JM109菌株为本所保存的细胞与菌种，逆转录病毒载体pDOR-SV40和质粒表达载体pBK-CMV由第四军医大学基础部生化教研室崔大祥博士惠赠，pBluescript bcl-2 cDNA为本所保存质粒，pBluescript fas cDNA为日本Itoh教授惠赠. EcoRⅠ, BamHⅠ，SalⅠ，XhoⅠ，CIP， RNase A， T4 DNA连接酶，PMSF，Aprotinin，聚丙烯酰胺，ABC试剂盒，探针标记试剂盒及异硫氰酸胍等试剂均购于华美生物工程公司和Promega公司. Lipofectamine来源于Gibco BRL. MTT，蛋白酶k，DEPC,MOPS,G418，胎牛血清及硝酸纤维膜为Sigma产品. [α-32P]dATP购于北京亚辉公司，引物和寡核苷酸探针合成于上海Sangon生物制品公司. 鼠抗人bcl-2抗体和兔抗人fas抗体均购于北京东方公司.
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1.2 方法
1.2.1 重组载体的构建与鉴定 根据资料，1.9kb的bcl-2 cDNA在pBluesecript KS的EcoRⅠ位点之间，2.5kb的fas cDNA在pBluesecript KS质粒的XhoⅠ位点之间. 根据重组真核表达载体和反义核酸构建的方法，在酶切电泳证实原始质粒含有完整的fas cDNA和bcl-2 cDNA基础上，利用载体和基因序列中的位点，选择EcoRⅠ和BamHⅠ消化pBluesecript-bcl-2 cDNA，SalⅠ和EcoRⅠ消化pBluesecript-fas cDNA，冻融法回收0.622 kb的bcl-2 cDNA片段和1.83 kb的fas cDNA，在T4 DNA ligase作用下，分别与经相应的限制性内切酶消化的pDOR载体及pBK-CMV载体DNA连接(16℃,20 h)，转化JM109菌株制备的感受态细胞，常规培养. 随机挑选Amp抗性菌落及小量制备重组质粒，通过酶切及琼脂糖凝胶电泳，鉴定其连接效果与正确性. 根据fas cDNA序列分段设计3对引物，分别对pBK-fas cDNA重组子进行常规PCR扩增，并将PCR产物克隆至测序载体，随机引物法全自动测序，分析重组载体中目的基因的读框.
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1.2.2 基因转导与克隆筛选 按照lipofectamine介导法，取0.5 g/ L纯化的pDOR-bcl-2和pBK-fas cDNA各1 μL，用无血清的RPMI1640稀释成100 μL，并与lipofectamine 5 μL混合，室温静置10min，转染六孔板中处于对数生长期的SGC7901/ VCR细胞(2×105 cells/孔). 24 h后，G418(500 mg/ L)筛选转染细胞. 同时，设立pDOR和pBK空载体转导细胞以及非转导细胞作为对照. 克隆细胞形成后，逐个计数，随机挑选克隆，大量扩增抗性细胞.
1.2.3 Southern blot和Northern blot 收集生长状态良好的1×107细胞，按细胞裂解法和一步法分别提取基因组DNA和总RNA. 基因组DNA经EcoRⅠ消化后，普通琼脂糖电泳. 细胞总RNA经热变性后，甲醛变性凝胶电泳. 真空抽吸法转移DNA和RNA至硝酸纤维膜上. 以随机引物的方法制备同位素[α-32P]dATP标记的探针并进行预杂交、杂交及自动显影.
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1.2.4 Western blot 以三去污剂裂解细胞的方法制备细胞膜蛋白，取1/ 2进行SDS-PAGE分离蛋白条带，考马斯亮蓝显色及脱色，仔细分辨条带的差异. 另一半膜蛋白加样电泳后，100 V电转移过夜，SDS变性NC膜，常规ABC法结合抗体与显色.
1.2.5 药物敏感性实验 将转导细胞和非转导细胞按103～104 cells接种于96孔板，在200 μL含100 mL/ L小牛血清的RPMI1640培养液中，分别加入顺铂、5-FU，VCR已知临床血浆高峰浓度的0.1倍(1 μg,7 μg,0.1 μg)、1.0倍(10 μg,70 μg,1 μg)及10倍(100 μg,700 μg,10 μg)的剂量，培养3 d，加入MTT溶液(5 g/ L) 20 μL继续孵育4 h，弃上清，加入150 μL DMSO，振荡10min 以溶解结晶，酶联免疫检测仪上选择590nm波长测定各孔A(OD值).
, 百拇医药 2 结果
2.1 真核表达载体的构建 原始质粒分别经EcoRⅠ和XhoⅠ酶消化，分离出1.9 kb的bcl-2 cDNA和2.5 kb的fas cDNA(图1)，重组载体pDOR-bcl-2经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，获得0.622 kb的反向bcl-2片段和6.5 kb的载体，PBK-fas阳性重组子经EcoRⅠ与SalⅠ消化，可见1.8 kb的fas cDNA片段和4.5 kb的载体DNA. PBK-fas阳性菌落为模板的PCR产物电泳结果如图2所示，3对引物分别扩增出500 bp,850 bp,700 bp的片段，其大小各与引物之间的序列长度相符. PCR产物测序结果，经过校对与分析，与文献列出的序列完全一致，没有任何错误的读框.
2.2 转导株的建立 基因转导后，2×105转染细胞经G418筛选4 wk～5 wk，空载体和表达载体共转染的细胞培养孔内均逐渐出现抗性克隆，经计算发现，稳定克隆数在120左右，转导率在0.5‰以上. 而非转导株以同剂量的G418筛选2 wk，细胞即已完全死亡. 随机各挑选2个生长状态良好的阳性克隆，继续以抗性筛选的同时，进行扩增培养40 d～50 d，结果各筛选出一个稳定的抗性细胞株，即分别为SGC7901fas/ VCR cells和SGC7901 anti bcl-2/ VCR cells.
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2.3 目的基因的表达 Northern blot 显影见图3和图4. 以fas cDNA单链探针的杂交结果，胃癌细胞取3×106 cells的总RNA电泳转膜杂交，呈现微弱的显影，而胃癌耐药以相同细胞数的杂交显影更加微弱. bcl-2 cDNA单链探针的杂交，在胃癌细胞和胃癌耐药细胞均有很强的信号，尤其是耐药细胞表现更加突出. fas转导株1×106 cells的总RNA转膜杂交，具有很强的fas杂交信号，且细胞数量增加，信号增强. 反义bcl-2转导株以反义探针杂交时，其杂交信号明显强于非转导株，而以正向探针杂交时，杂交显影强度略低于非转导株. SDS-PAGE显色和Western blot结果见图5，fas转导株在Mr 36 000～40 000处比非转导株明显多出现一条电泳带，其大小与fas蛋白相对分子量相符. 非转导株在Mr 25 000处有一条较为浓厚的显色，其大小与bcl-2蛋白相对分子质量一致，而反义bcl-2转导株未见此条带. fas转导株和非转导株分别与fas抗体和bcl-2抗体的结合，在相应的位置也出现了印迹着色.
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图1 重组pBK-fas载体和反义核酸pDOR-bcl-2的酶切鉴定
a.pBluescript fas/XhoⅠ; b.pBluescript fas/EcoRⅠ+SalⅠ; c.pBK-fas/EcoRⅠ+SalⅠ; d.λDNA marker/ HindⅢ; e.pDOR bcl-2/ EcoRⅠ+BamHⅠ; f.pBluescript bcl-2/ EcoRⅠ+BamHⅠ; g.pBluescript bcl-2/ EcoRⅠ.
图2 PBK-fas PCR产物电泳
a.感受态细胞为模板的PCR; b.空载体转化菌株为模板的PCR; c.PCR marker; d.pBK-fas PCR产物1(500bp); e.pBK-fas PCR 产物2(850bp); f.pBK-fas PCR 产物3(700bp).
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图3 Northern blot with fas cDNA probe
a.SGC7901/ VCR/ 3×106 cells; b.空载体转导株/ 5×106 cells; c.SGC7901/ 3×106 cells; d.RNA marker; e.SGC7901 fas/ VCR/ 1×106 cells; f.SGC7901 fas/ VCR/ 2×106 cells; g.SGC7901 fas/ VCR/ 3×106 cells.
图4 Northern blot with bcl-2 probe
A.bcl-2反义探针， B.bcl-2正义探针
a.SGC7901/ 3×106 cells; b.空载体转导株/ 2×106 cells; c.SGC7901/ 3×106 cells; d.RNA marker; e.SGC7901 anti bcl-2/ VCR/ 2×106 cells; f.SGC7901 anti bcl-2/ VCR/ 3×106 cells; g.SGC7901 anti bcl-2/ VCR/ 4×106 cells.
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图5 SDS-PAGE和Western blot
A.fas转导株 B.bcl-2转导株
a.SGC7901/ VCR/ 3×106 cells; b.SGC7901/ 3×106 cells; c.蛋白高分子量标准参照物; d.SGC7901 fas/ VCR/ 1×106 cells; e.SGC7901 fas/ VCR/ 2×106 cells; f.SGC7901/ 1×106 cells; g.SGC7901 / 2×106 cells; h.SGC7901/ VCR/ 1×106 cells; i.SGC7901/ VCR/ 2×106 cells; j.蛋白中分子量标准参照物; k.SGC7901 anti bcl-2/ VCR/ 5×105 cells; l.SGC7901 anti bcl-2/ VCR/ 1×106 cells; m.SGC7901 anti bcl-2/ VCR/ 2×106 cells; n.SGC7901 anti bcl-2/ VCR/ 3×106 cells.
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2.4 药物敏感性实验结果 根据细胞存活率=(实验组A/ 对照组A)×100%，各组细胞的存活率比较如表1所示，转导细胞经顺铂、5-FU作用的存活率，在0.1倍、1.0倍及10倍的剂量均明显低于非转导株，尤其是fas基因转导株表现更加明显. 转导细胞经VCR作用后，与非转导株相比，虽然有一定的降低，但效果并不很明显.表1 化疗药物作用于转导株与非转导株的细胞存活率(%) (mg/ L)
Cells
n
CDDP
5-FU
VCR
5
50
, 百拇医药 500
35
350
3500
0.5
5
50
SGC7901 fas/ VCR
10
45.1a
40.5a
32.0
43.5a
, 百拇医药
38.6a
30.7a
55.0
46.7a
40.0a
SGC7901 anti bcl-2/ VCR
10
50.2a
45.1a
40.5
50.1a
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44.6a
39.5a
60.3
55.1a
49.2a
SGC7901/ VCR
10
70.2
61.3
52.0
71.1
62.2
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55.3
72.5
67.4
60.1
aP<0.05， vs SGC7901/ VCR cells group.
3 讨论
细胞凋亡是生物体一种与细胞有丝分裂相反的方式去调节细胞群体相对衡定的重要方式. 近年认为，细胞凋亡过程的抑制、凋亡调节基因的紊乱，可导致细胞凋亡抑制蛋白的增加或凋亡促进因子的减少，是肿瘤形成的另一重要机制. 通过诱导肿瘤细胞的凋亡，可以达到治疗肿瘤的目的. 目前使用的许多抗癌化疗药物主要是通过抑制或破坏细胞内DNA合成以及调节p53,c-myc,bcl-2,c-H-ras等凋亡相关基因，触发或诱导细胞凋亡，从而抑制或杀灭肿瘤细胞[2-4]. 但是，化疗药物不论通过怎样的机制起作用，多药耐药的现象严重影响了对肿瘤的治疗效果. 近年来，通过深入研究发现，导致肿瘤细胞发生多药耐药现象的机制，除了Pgp，MRP，LRP，TopoⅡ和GST/ GSH等耐药蛋白和酶的改变之外，细胞凋亡调控机制的紊乱也赋予肿瘤细胞对多种结构无关的化疗药物产生交叉抗性[1，5]. 耐药细胞修复DNA损伤和抵抗凋亡的能力明显增强[6]. 向非耐药细胞转导 bcl-xL基因，可诱导耐药细胞表型的出现，bcl-xL基因的高表达与Pgp的高表达呈直线相关，并对许多化疗药物产生高剂量的耐受，从而认为凋亡相关基因的表达状态决定了肿瘤细胞是否产生耐药现象[7]. 仓鼠卵巢纤维瘤耐药细胞LR73/ 20E与非耐药细胞相比，在高表达MDR和Pgp的同时，对细胞凋亡诱导剂colchicine极不敏感，但用耐药逆转剂verapamil处理耐药细胞LR73/ 20E后，敏感性明显增强，从而认为耐药细胞可拮抗凋亡[8]. 乳腺癌耐药细胞MCF-7/ ADR高表达bcl-2 mRNA及其蛋白，通过糖饥饿的方式不能诱导该细胞发生凋亡[9]. 白血病耐药细胞HL-60/ AR，HL-60/ VCR，HL-60/ TAX1000与非耐药细胞相比，在高表达Pgp，MRP的同时，也高表达bcl-2，bcl-xL，并可抑制化疗药物paclitaxel在胞内的聚集及其诱导凋亡的作用. 非耐药细胞转导bcl-2，bcl-xL基因后不影响化疗药物的胞内聚集，但可抑制细胞凋亡[10]. fas抗原和P53蛋白都可以促进细胞凋亡，但在耐药细胞中，fas和p53基因均处于低表达状态[1，11]. 可见，bcl-2基因的高表达及fas基因的低表达在耐药细胞拮抗凋亡与耐受化疗药物的作用中，扮演了重要的角色. bcl-2基因是凋亡抑制基因，虽然并不促进细胞的增殖，但可明显延长细胞的存活时间. bcl-2通过影响胞内细胞器的Ca2+通道以及ICE的表达与释放而抑制细胞凋亡[12],并与Bax,TNF,fas的结合与调节有关[13]. 通过反义核苷酸技术控制肿瘤细胞内bcl-2 mRNA的翻译，可有效抑制bcl-2基因的表达，延缓肿瘤的生长[14].
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fas基因产物是一种典型的Ⅰ型膜蛋白，属TNF和NGF受体家族成员. 细胞表面fas分子与它的配体分子fasL或抗fas抗体结合，可向细胞内传递死亡信号，使fas表达细胞在数小时内发生死亡[15]. 与相应的正常组织相比，恶性肿瘤细胞显示异常低下的fas表达水平，尤其发生转移的肿瘤几乎没有表达，而良性肿瘤的表达大多数类似于其来源的正常组织. 有人认为恶性肿瘤通过某种机制，可能抑制了fas的表达或将fas丢失，从而逃避机体内fasL的监控. 在耐药细胞中fas基因的表达更为缺乏[1]. 因此，向耐药细胞内转导可促进细胞凋亡的fas基因，或通过反义核酸技术阻断耐药细胞中bcl-2基因的表达，无疑有利于增强耐药细胞对化疗药物的敏感性，从而逆转耐药现象. 我国学者陈协群等人采用基因转染技术将bcl-2反义RNA导入白血病(CEM)细胞，观察了足叶乙甙对靶细胞的影响，结果表明：反义bcl-2基因瞬时表达能有效地降低CEM内源性bcl-2蛋白水平，并使其对足叶乙甙的细胞毒效应更为敏感，杀伤细胞伴有大量细胞凋亡小体与梯状脱氧核糖核酸片段形成.
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为了明确胃癌耐药细胞系SGC7901/ VCR中fas与bcl-2蛋白的表达及探讨fas基因和bcl-2反义核酸转导SGC7901/ VCR细胞的肿瘤抑制与耐药逆转效应，我们采用分子克隆技术，成功地构建了真核表达载体pBK-fas cDNA与pDOR-bcl-2 cDNA. 通过脂质体介导的转染技术，将两个重组表达载体分别转导耐药细胞后，通过抗性筛选，有效地建立了bcl-2阻断的和fas基因高表达的胃癌耐药细胞株，即SGC7901 anti bcl-2/ VCR cells和SGC7901 fas/ VCR cells. 分子杂交结果显示，胃癌耐药细胞SGC7901/ VCR有极其微量的fas mRNA及其蛋白表达. 但bcl-2呈现高表达状态. fas转导株的fas mRNA及其蛋白的表达明显高于非转导株. bcl-2转导株中，bcl-2 mRNA的表达略微受到抑制，而bcl-2蛋白水平的表达明显受到阻断. 药敏实验结果表明，fas基因和反义bcl-2转导细胞对顺铂、5-FU的敏感性均明显高于非转导株，对VCR的敏感性也有一定的提高. 从而说明，细胞凋亡的抑制在肿瘤细胞对化疗药物产生耐药现象的过程中具有重要的作用；诱导细胞凋亡，在一定程度上可以逆转这一耐药现象.
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第四军医大学西京医院全军消化病研究所 陕西省西安市 710032
肖冰，男，1962-09-11生，福建省三明市人，汉族. 1996年第一军医大学毕业，医学博士，消化内科主治医师，研究方向为肿瘤基因治疗及肿瘤相关基因的克隆.
通讯作者 樊代明，710032，第四军医大学西京医院全军消化病研究所，陕西省西安市长乐西路15号.
Correspondence to:FAN Dai-Ming, Department of Gastroenterology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi＇an 710032, Shaanxi Province, China
Tel. +86·29·3232971-72863(O)
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收稿日期 1998-06-06
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关键词：药物筛选试验，抗肿瘤；肿瘤细胞，培养的；胃肿瘤/病理学；原癌基因蛋白质类；细胞凋亡
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Abstract
AIM To compare the expression level of fas gene and bcl-2 gene in gastric cancer cells SGC7901 and in gastric cancer MDR cells SGC7901/ VCR, to transduce fas cDNA and bcl-2 antisense nucleic acid into SGC7901/ VCR cells respectively, and to observe the expression of two genes in transfectants and non-transfectants as well as their drug sensitivity.
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METHODS The eukaryotic expression vector pBK-fas and pDOR-anti bcl-2 was constructed, and then transfected into SGC7901/ VCR cells by lipofectamine, respectively. The expression of mRNA and protein in SGC7901/ VCR cells and SGC7901 cells and transfectants was detected using Northern blot and Western blot and the drug sensitivity of transfectants for VCR, CDDP and 5-FU was analysed with MTT assay.
RESULTS After gene transfection, 80 for fas or 120 for antisense bcl-2 drug-resistant clones were selected from 2×105 cells, the transfection efficiency was 0.04% and 0.06%, respectively. Two clones, SGC7901 fas/ VCR cells and SGC7901 anti-bcl-2/ VCR cells, were randomly selected for further incubation. Hybridization results showed that the expression level of fas mRNA and protein in SGC7901/ VCR cells was much lower, but the expression level of bcl-2 mRNA and protein was higher than that in SGC7901 cells, the expression level of fas mRNA and protein in SGC7901 fas/ VCR cells was higher, and the expression level of bcl-2 mRNA and protein was lower in SGC7901 anti bcl-2/ VCR cells than that in non-transfectants. MTT assay showed that transfectants were more sensitive to VCR, CDDP and 5-FU than non-transfectants.
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CONCLUSION bcl-2 gene displayed high expression and fas gene displayed low expression in drug resistant gastric cancer cells. Expression of bcl-2 protein was effectively blocked in SGC7901 anti bcl-2/ VCR cells by gene transfection, in contrast, the expression of fas mRNA and protein in SGC7901 fas/ VCR cells increased. Fas gene and bcl-2 antisense nucleic acid transfection sensitized drug resistant gastric cancer cells to chemotherapeutic drugs.
中国图书资料分类号 R 979.1
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摘 要
目的 比较fas基因和bcl-2基因在胃癌耐药细胞与非耐药细胞表达的差异，将fas基因和bcl-2反义核酸导入胃癌耐药细胞，并分析转导前后的细胞在mRNA与蛋白的表达水平，研究转导株与非转导株对化疗药物敏感性的区别.
方法 采用分子克隆技术将fas 基因和反义bcl-2片段分别插入真核表达载体pBK-CMV和pDOR-SV40的多克隆克隆位点之间，以脂质体介导法将两个重组表达载体分别转染受体细胞SGC7901/ VCR，G418筛选克隆细胞，Northern blot, Western blot检测耐药细胞与非耐药细胞以及转导细胞中fas基因和bcl-2基因mRNA及其蛋白的表达，MTT法药敏实验检测转导细胞与非转导细胞对VCR、顺铂、5-FU 的敏感性.
结果 真核表达载体pBK-fas cDNA和pDOR-bcl-2 cDNA转导胃癌耐药细胞后，分别从2×105细胞中筛选出大约80和120个抗性克隆，转导率各为0.4‰和0.6‰，随机各挑选2个克隆继续筛选与扩增培养，均获得了稳定的抗性细胞，我们将此命名为SGC7901 fas/ VCR cell和SGC7901 anti bcl-2/ VCR cell. 杂交结果表明，胃癌耐药细胞SGC7901/ VCR与非耐药细胞相比，bcl-2基因的表达明显较高，而fas基因表达极其微弱. 转导株SGC7901 fas/ VCR cell的fas mRNA及其蛋白水平的表达显著高于非转导株，SGC7901 anti bcl-2/ VCR cell中bcl-2蛋白的表达明显低于非转导株. 2株转导细胞对VCR、顺铂、5-FU的敏感性明显高于非转导株.
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结论 胃癌耐药细胞与非耐药细胞相比，bcl-2基因处于高表达状态，而fas基因处于极其低弱的表达状态. 通过脂质体介导的基因转染，有效地阻断了bcl-2蛋白在SGC7901 anti bcl-2/ VCR cell的表达，明显增强了fas mRNA及其蛋白在SGC7901 fas/ VCR cell的表达. bcl-2反义核酸和fas基因转导胃癌耐药细胞后，对化疗药物的敏感性明显增加.
0 引言
化疗是治疗肿瘤的主要方法之一，但目前所选用的化疗药物和用药方案，难以达到满意的疗效，其重要的原因之一就是肿瘤细胞对抗癌药物产生了耐药现象. 要想提高化疗效果，就必须解决多药耐药的问题. 近年研究表明，肿瘤细胞凋亡信息的抑制、细胞寿命的延长是产生多药耐药的机制之一[1]. 因此，有人提出通过诱导或促进细胞凋亡来逆转肿瘤细胞的耐药现象. 我们将促进凋亡的fas基因和bcl-2反义RNA导入胃癌耐药细胞SGC7901/ VCR，并观察了目的基因在转导株的表达及分析了转导株对化疗药物的敏感性，可望为逆转胃癌细胞多药耐药现象的研究奠定基础.
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1 材料和方法
1.1 材料 胃癌耐药细胞SGC7901/ VCR及JM109菌株为本所保存的细胞与菌种，逆转录病毒载体pDOR-SV40和质粒表达载体pBK-CMV由第四军医大学基础部生化教研室崔大祥博士惠赠，pBluescript bcl-2 cDNA为本所保存质粒，pBluescript fas cDNA为日本Itoh教授惠赠. EcoRⅠ, BamHⅠ，SalⅠ，XhoⅠ，CIP， RNase A， T4 DNA连接酶，PMSF，Aprotinin，聚丙烯酰胺，ABC试剂盒，探针标记试剂盒及异硫氰酸胍等试剂均购于华美生物工程公司和Promega公司. Lipofectamine来源于Gibco BRL. MTT，蛋白酶k，DEPC,MOPS,G418，胎牛血清及硝酸纤维膜为Sigma产品. [α-32P]dATP购于北京亚辉公司，引物和寡核苷酸探针合成于上海Sangon生物制品公司. 鼠抗人bcl-2抗体和兔抗人fas抗体均购于北京东方公司.
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1.2 方法
1.2.1 重组载体的构建与鉴定 根据资料，1.9kb的bcl-2 cDNA在pBluesecript KS的EcoRⅠ位点之间，2.5kb的fas cDNA在pBluesecript KS质粒的XhoⅠ位点之间. 根据重组真核表达载体和反义核酸构建的方法，在酶切电泳证实原始质粒含有完整的fas cDNA和bcl-2 cDNA基础上，利用载体和基因序列中的位点，选择EcoRⅠ和BamHⅠ消化pBluesecript-bcl-2 cDNA，SalⅠ和EcoRⅠ消化pBluesecript-fas cDNA，冻融法回收0.622 kb的bcl-2 cDNA片段和1.83 kb的fas cDNA，在T4 DNA ligase作用下，分别与经相应的限制性内切酶消化的pDOR载体及pBK-CMV载体DNA连接(16℃,20 h)，转化JM109菌株制备的感受态细胞，常规培养. 随机挑选Amp抗性菌落及小量制备重组质粒，通过酶切及琼脂糖凝胶电泳，鉴定其连接效果与正确性. 根据fas cDNA序列分段设计3对引物，分别对pBK-fas cDNA重组子进行常规PCR扩增，并将PCR产物克隆至测序载体，随机引物法全自动测序，分析重组载体中目的基因的读框.
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1.2.2 基因转导与克隆筛选 按照lipofectamine介导法，取0.5 g/ L纯化的pDOR-bcl-2和pBK-fas cDNA各1 μL，用无血清的RPMI1640稀释成100 μL，并与lipofectamine 5 μL混合，室温静置10min，转染六孔板中处于对数生长期的SGC7901/ VCR细胞(2×105 cells/孔). 24 h后，G418(500 mg/ L)筛选转染细胞. 同时，设立pDOR和pBK空载体转导细胞以及非转导细胞作为对照. 克隆细胞形成后，逐个计数，随机挑选克隆，大量扩增抗性细胞.
1.2.3 Southern blot和Northern blot 收集生长状态良好的1×107细胞，按细胞裂解法和一步法分别提取基因组DNA和总RNA. 基因组DNA经EcoRⅠ消化后，普通琼脂糖电泳. 细胞总RNA经热变性后，甲醛变性凝胶电泳. 真空抽吸法转移DNA和RNA至硝酸纤维膜上. 以随机引物的方法制备同位素[α-32P]dATP标记的探针并进行预杂交、杂交及自动显影.
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1.2.4 Western blot 以三去污剂裂解细胞的方法制备细胞膜蛋白，取1/ 2进行SDS-PAGE分离蛋白条带，考马斯亮蓝显色及脱色，仔细分辨条带的差异. 另一半膜蛋白加样电泳后，100 V电转移过夜，SDS变性NC膜，常规ABC法结合抗体与显色.
1.2.5 药物敏感性实验 将转导细胞和非转导细胞按103～104 cells接种于96孔板，在200 μL含100 mL/ L小牛血清的RPMI1640培养液中，分别加入顺铂、5-FU，VCR已知临床血浆高峰浓度的0.1倍(1 μg,7 μg,0.1 μg)、1.0倍(10 μg,70 μg,1 μg)及10倍(100 μg,700 μg,10 μg)的剂量，培养3 d，加入MTT溶液(5 g/ L) 20 μL继续孵育4 h，弃上清，加入150 μL DMSO，振荡10min 以溶解结晶，酶联免疫检测仪上选择590nm波长测定各孔A(OD值).
, 百拇医药 2 结果
2.1 真核表达载体的构建 原始质粒分别经EcoRⅠ和XhoⅠ酶消化，分离出1.9 kb的bcl-2 cDNA和2.5 kb的fas cDNA(图1)，重组载体pDOR-bcl-2经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，获得0.622 kb的反向bcl-2片段和6.5 kb的载体，PBK-fas阳性重组子经EcoRⅠ与SalⅠ消化，可见1.8 kb的fas cDNA片段和4.5 kb的载体DNA. PBK-fas阳性菌落为模板的PCR产物电泳结果如图2所示，3对引物分别扩增出500 bp,850 bp,700 bp的片段，其大小各与引物之间的序列长度相符. PCR产物测序结果，经过校对与分析，与文献列出的序列完全一致，没有任何错误的读框.
2.2 转导株的建立 基因转导后，2×105转染细胞经G418筛选4 wk～5 wk，空载体和表达载体共转染的细胞培养孔内均逐渐出现抗性克隆，经计算发现，稳定克隆数在120左右，转导率在0.5‰以上. 而非转导株以同剂量的G418筛选2 wk，细胞即已完全死亡. 随机各挑选2个生长状态良好的阳性克隆，继续以抗性筛选的同时，进行扩增培养40 d～50 d，结果各筛选出一个稳定的抗性细胞株，即分别为SGC7901fas/ VCR cells和SGC7901 anti bcl-2/ VCR cells.
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2.3 目的基因的表达 Northern blot 显影见图3和图4. 以fas cDNA单链探针的杂交结果，胃癌细胞取3×106 cells的总RNA电泳转膜杂交，呈现微弱的显影，而胃癌耐药以相同细胞数的杂交显影更加微弱. bcl-2 cDNA单链探针的杂交，在胃癌细胞和胃癌耐药细胞均有很强的信号，尤其是耐药细胞表现更加突出. fas转导株1×106 cells的总RNA转膜杂交，具有很强的fas杂交信号，且细胞数量增加，信号增强. 反义bcl-2转导株以反义探针杂交时，其杂交信号明显强于非转导株，而以正向探针杂交时，杂交显影强度略低于非转导株. SDS-PAGE显色和Western blot结果见图5，fas转导株在Mr 36 000～40 000处比非转导株明显多出现一条电泳带，其大小与fas蛋白相对分子量相符. 非转导株在Mr 25 000处有一条较为浓厚的显色，其大小与bcl-2蛋白相对分子质量一致，而反义bcl-2转导株未见此条带. fas转导株和非转导株分别与fas抗体和bcl-2抗体的结合，在相应的位置也出现了印迹着色.
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图1 重组pBK-fas载体和反义核酸pDOR-bcl-2的酶切鉴定
a.pBluescript fas/XhoⅠ; b.pBluescript fas/EcoRⅠ+SalⅠ; c.pBK-fas/EcoRⅠ+SalⅠ; d.λDNA marker/ HindⅢ; e.pDOR bcl-2/ EcoRⅠ+BamHⅠ; f.pBluescript bcl-2/ EcoRⅠ+BamHⅠ; g.pBluescript bcl-2/ EcoRⅠ.
图2 PBK-fas PCR产物电泳
a.感受态细胞为模板的PCR; b.空载体转化菌株为模板的PCR; c.PCR marker; d.pBK-fas PCR产物1(500bp); e.pBK-fas PCR 产物2(850bp); f.pBK-fas PCR 产物3(700bp).
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图3 Northern blot with fas cDNA probe
a.SGC7901/ VCR/ 3×106 cells; b.空载体转导株/ 5×106 cells; c.SGC7901/ 3×106 cells; d.RNA marker; e.SGC7901 fas/ VCR/ 1×106 cells; f.SGC7901 fas/ VCR/ 2×106 cells; g.SGC7901 fas/ VCR/ 3×106 cells.
图4 Northern blot with bcl-2 probe
A.bcl-2反义探针， B.bcl-2正义探针
a.SGC7901/ 3×106 cells; b.空载体转导株/ 2×106 cells; c.SGC7901/ 3×106 cells; d.RNA marker; e.SGC7901 anti bcl-2/ VCR/ 2×106 cells; f.SGC7901 anti bcl-2/ VCR/ 3×106 cells; g.SGC7901 anti bcl-2/ VCR/ 4×106 cells.
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图5 SDS-PAGE和Western blot
A.fas转导株 B.bcl-2转导株
a.SGC7901/ VCR/ 3×106 cells; b.SGC7901/ 3×106 cells; c.蛋白高分子量标准参照物; d.SGC7901 fas/ VCR/ 1×106 cells; e.SGC7901 fas/ VCR/ 2×106 cells; f.SGC7901/ 1×106 cells; g.SGC7901 / 2×106 cells; h.SGC7901/ VCR/ 1×106 cells; i.SGC7901/ VCR/ 2×106 cells; j.蛋白中分子量标准参照物; k.SGC7901 anti bcl-2/ VCR/ 5×105 cells; l.SGC7901 anti bcl-2/ VCR/ 1×106 cells; m.SGC7901 anti bcl-2/ VCR/ 2×106 cells; n.SGC7901 anti bcl-2/ VCR/ 3×106 cells.
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2.4 药物敏感性实验结果 根据细胞存活率=(实验组A/ 对照组A)×100%，各组细胞的存活率比较如表1所示，转导细胞经顺铂、5-FU作用的存活率，在0.1倍、1.0倍及10倍的剂量均明显低于非转导株，尤其是fas基因转导株表现更加明显. 转导细胞经VCR作用后，与非转导株相比，虽然有一定的降低，但效果并不很明显.表1 化疗药物作用于转导株与非转导株的细胞存活率(%) (mg/ L)
Cells
n
CDDP
5-FU
VCR
5
50
, 百拇医药 500
35
350
3500
0.5
5
50
SGC7901 fas/ VCR
10
45.1a
40.5a
32.0
43.5a
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38.6a
30.7a
55.0
46.7a
40.0a
SGC7901 anti bcl-2/ VCR
10
50.2a
45.1a
40.5
50.1a
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44.6a
39.5a
60.3
55.1a
49.2a
SGC7901/ VCR
10
70.2
61.3
52.0
71.1
62.2
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55.3
72.5
67.4
60.1
aP<0.05， vs SGC7901/ VCR cells group.
3 讨论
细胞凋亡是生物体一种与细胞有丝分裂相反的方式去调节细胞群体相对衡定的重要方式. 近年认为，细胞凋亡过程的抑制、凋亡调节基因的紊乱，可导致细胞凋亡抑制蛋白的增加或凋亡促进因子的减少，是肿瘤形成的另一重要机制. 通过诱导肿瘤细胞的凋亡，可以达到治疗肿瘤的目的. 目前使用的许多抗癌化疗药物主要是通过抑制或破坏细胞内DNA合成以及调节p53,c-myc,bcl-2,c-H-ras等凋亡相关基因，触发或诱导细胞凋亡，从而抑制或杀灭肿瘤细胞[2-4]. 但是，化疗药物不论通过怎样的机制起作用，多药耐药的现象严重影响了对肿瘤的治疗效果. 近年来，通过深入研究发现，导致肿瘤细胞发生多药耐药现象的机制，除了Pgp，MRP，LRP，TopoⅡ和GST/ GSH等耐药蛋白和酶的改变之外，细胞凋亡调控机制的紊乱也赋予肿瘤细胞对多种结构无关的化疗药物产生交叉抗性[1，5]. 耐药细胞修复DNA损伤和抵抗凋亡的能力明显增强[6]. 向非耐药细胞转导 bcl-xL基因，可诱导耐药细胞表型的出现，bcl-xL基因的高表达与Pgp的高表达呈直线相关，并对许多化疗药物产生高剂量的耐受，从而认为凋亡相关基因的表达状态决定了肿瘤细胞是否产生耐药现象[7]. 仓鼠卵巢纤维瘤耐药细胞LR73/ 20E与非耐药细胞相比，在高表达MDR和Pgp的同时，对细胞凋亡诱导剂colchicine极不敏感，但用耐药逆转剂verapamil处理耐药细胞LR73/ 20E后，敏感性明显增强，从而认为耐药细胞可拮抗凋亡[8]. 乳腺癌耐药细胞MCF-7/ ADR高表达bcl-2 mRNA及其蛋白，通过糖饥饿的方式不能诱导该细胞发生凋亡[9]. 白血病耐药细胞HL-60/ AR，HL-60/ VCR，HL-60/ TAX1000与非耐药细胞相比，在高表达Pgp，MRP的同时，也高表达bcl-2，bcl-xL，并可抑制化疗药物paclitaxel在胞内的聚集及其诱导凋亡的作用. 非耐药细胞转导bcl-2，bcl-xL基因后不影响化疗药物的胞内聚集，但可抑制细胞凋亡[10]. fas抗原和P53蛋白都可以促进细胞凋亡，但在耐药细胞中，fas和p53基因均处于低表达状态[1，11]. 可见，bcl-2基因的高表达及fas基因的低表达在耐药细胞拮抗凋亡与耐受化疗药物的作用中，扮演了重要的角色. bcl-2基因是凋亡抑制基因，虽然并不促进细胞的增殖，但可明显延长细胞的存活时间. bcl-2通过影响胞内细胞器的Ca2+通道以及ICE的表达与释放而抑制细胞凋亡[12],并与Bax,TNF,fas的结合与调节有关[13]. 通过反义核苷酸技术控制肿瘤细胞内bcl-2 mRNA的翻译，可有效抑制bcl-2基因的表达，延缓肿瘤的生长[14].
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fas基因产物是一种典型的Ⅰ型膜蛋白，属TNF和NGF受体家族成员. 细胞表面fas分子与它的配体分子fasL或抗fas抗体结合，可向细胞内传递死亡信号，使fas表达细胞在数小时内发生死亡[15]. 与相应的正常组织相比，恶性肿瘤细胞显示异常低下的fas表达水平，尤其发生转移的肿瘤几乎没有表达，而良性肿瘤的表达大多数类似于其来源的正常组织. 有人认为恶性肿瘤通过某种机制，可能抑制了fas的表达或将fas丢失，从而逃避机体内fasL的监控. 在耐药细胞中fas基因的表达更为缺乏[1]. 因此，向耐药细胞内转导可促进细胞凋亡的fas基因，或通过反义核酸技术阻断耐药细胞中bcl-2基因的表达，无疑有利于增强耐药细胞对化疗药物的敏感性，从而逆转耐药现象. 我国学者陈协群等人采用基因转染技术将bcl-2反义RNA导入白血病(CEM)细胞，观察了足叶乙甙对靶细胞的影响，结果表明：反义bcl-2基因瞬时表达能有效地降低CEM内源性bcl-2蛋白水平，并使其对足叶乙甙的细胞毒效应更为敏感，杀伤细胞伴有大量细胞凋亡小体与梯状脱氧核糖核酸片段形成.
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为了明确胃癌耐药细胞系SGC7901/ VCR中fas与bcl-2蛋白的表达及探讨fas基因和bcl-2反义核酸转导SGC7901/ VCR细胞的肿瘤抑制与耐药逆转效应，我们采用分子克隆技术，成功地构建了真核表达载体pBK-fas cDNA与pDOR-bcl-2 cDNA. 通过脂质体介导的转染技术，将两个重组表达载体分别转导耐药细胞后，通过抗性筛选，有效地建立了bcl-2阻断的和fas基因高表达的胃癌耐药细胞株，即SGC7901 anti bcl-2/ VCR cells和SGC7901 fas/ VCR cells. 分子杂交结果显示，胃癌耐药细胞SGC7901/ VCR有极其微量的fas mRNA及其蛋白表达. 但bcl-2呈现高表达状态. fas转导株的fas mRNA及其蛋白的表达明显高于非转导株. bcl-2转导株中，bcl-2 mRNA的表达略微受到抑制，而bcl-2蛋白水平的表达明显受到阻断. 药敏实验结果表明，fas基因和反义bcl-2转导细胞对顺铂、5-FU的敏感性均明显高于非转导株，对VCR的敏感性也有一定的提高. 从而说明，细胞凋亡的抑制在肿瘤细胞对化疗药物产生耐药现象的过程中具有重要的作用；诱导细胞凋亡，在一定程度上可以逆转这一耐药现象.
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第四军医大学西京医院全军消化病研究所 陕西省西安市 710032
肖冰，男，1962-09-11生，福建省三明市人，汉族. 1996年第一军医大学毕业，医学博士，消化内科主治医师，研究方向为肿瘤基因治疗及肿瘤相关基因的克隆.
通讯作者 樊代明，710032，第四军医大学西京医院全军消化病研究所，陕西省西安市长乐西路15号.
Correspondence to:FAN Dai-Ming, Department of Gastroenterology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi＇an 710032, Shaanxi Province, China
Tel. +86·29·3232971-72863(O)
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收稿日期 1998-06-06
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