白细胞介素1受体拮抗剂在人牙髓组织中的表达*
作者：陆怀秀 肖明振 牛忠英
单位：第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032
关键词：白细胞介素1受体拮抗剂；牙髓；炎症
牙体牙髓牙周病学杂志CHINESE JOURNAL OF CONSERVATIVE DENTISTRY1999年 第9卷 第1期 Vol 摘要 目的：了解正常人牙髓组织及炎性牙髓组织中白细胞介素1受体拮抗剂(IL-1ra)的表达，探讨它在牙髓组织正常防御和内毒素性牙髓炎中的作用机制。方法：用ABC免疫组织化学法检测IL-1ra在牙髓组织中的表达。结果：在正常牙髓组织中仅有少量血管内皮细胞、巨噬细胞表达IL-1ra，在炎症牙髓组织中IL-1ra染色呈阳性，主要表达细胞为中性粒细胞、浆细胞、淋巴细胞和血管内皮细胞。结论：内源性IL-1ra在牙髓炎症的发生发展中可能起着重要作用。
中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)01-00021-03
, 百拇医药
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999, 9(1)：21]
Expression of interleukin-1 receptor antagonist
in human pulpal tissue
Lu Huaixiu, Xiao Mingzhen, Niu Zhongying
School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
Abstract Aim:To assess the role of Interleukin-1 receptor antagonist(IL-1ra) in the pulpal inflammation. Methods:IL-1ra expression in pulpal tissue was detected by immunohistochemical method. Results:Only a few macrophages endothelial cells showed weak staining in normal pulpal tissue; large amount of IL-1ra positive neutrophils,plasmacytes,endothelial cells, lymphocytes were stained in inflammatory pulp. Conculsions:The findings further support the hypothesis that IL-1ra may play a role in pulpitis.
, 百拇医药
Key words IL-1ra；pulp；inflammation
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999, 9(1):21]
许多文献证实：细胞因子间量的失衡是炎症产生的主要原因，正常情况下人体细胞因子以网络的形式发挥作用，它们之间相互制约，相互协调，维护细胞因子之间量的稳定，这种平衡关系也是维持牙髓、牙周组织正常生理功能的重要条件。对于白细胞介素1受体拮抗剂(Interleukin-1 receptor antagonist，IL-1ra) 在炎症中的作用，及在一些炎症组织中表达已得到证实，并且许多学者认为，IL-1与IL-1ra之间的平衡是维持组织自身稳定的一个重要调节机制，这种平衡关系的打破将导致机体疾病发生[1]。目前，IL-1ra在牙髓炎症组织中是否表达研究甚少，本实验的目的是了解正常牙髓组织及牙髓炎症情况下IL-1ra的表达情况，探讨它在牙髓组织正常防御和牙髓炎中的作用，进一步为阐明牙髓炎的致病机理提供理论依据。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 主要试剂
鼠抗人α-IL-1ra McAb(北京医科大学免疫教研室)；ABC免疫组化染色试剂盒(sigma，USA)。
1.2 实验方法
取口腔颌面外科门诊患者因治疗需要拔除的健康第三磨牙或前磨牙为正常对照组，临床诊断为慢性牙髓炎需拔除的第三磨牙为炎症组，并通过组织学切片，HE染色作为病理学分组标准。
正常对照组7牙，慢性牙髓炎组9牙。炎症组的牙齿均因近中阻生，近中邻合面大面积缺损已近髓，探痛(+)，患者均有冷热痛症状，年龄在20～40岁之间，无明显全身疾患，近期未用过抗生素及免疫抑制剂。牙齿拔除后立即劈冠，取出冠髓，在40g/L多聚甲醛中固定4h，脱水，石蜡包埋，切片(5μm)，染色步骤如下：
, 百拇医药
切片经二甲苯脱蜡系列乙醇至水3ml/L H2O2封闭内源酶 30min；PBS 5min×3；50ml/L正常羊血清孵育15min；鼠抗人IL-1ra单抗(1：100)4℃过夜；PBS 5min×2，生物素标记兔抗鼠IgG(1：100)37℃ 1h；PBS 5min×2；ABC复合物室温孵育 40min；PBS 5min×2；新鲜配制的DAB溶液染色，镜下控制显色强度，适时终止显色，苏木素复染细胞核；梯度乙醇脱水，二甲苯透明；中性树胶封片，镜下观察。
阳性对照：正常SD大鼠肝组织切片同步进行上述染色。
阴性对照：正常血清稀释液代替一抗，步骤与上述步骤相同。
2 结果
HE染色表明，人正常牙髓组织中，细胞成份以纤维细胞为主，散在分布一些巨噬细胞(图1)。慢性牙髓炎的牙髓组织中大量炎细胞浸润，以浆细胞、淋巴细胞为主，且有小血管扩张充血(图2)。
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图1 正常人牙髓组织, 图2 炎症人牙髓组织,HE染色 (40×3.6)
HE染色 (40×3.6)
免疫组化研究发现，正常牙髓组织中，仅少量巨噬细胞样细胞IL-1ra染色阳性，另外可见弱着色的血管内皮细胞(图3)。炎症性牙髓组织中，大量炎细胞浸润，高倍镜下病灶区可见淋巴细胞染色阳性，浆细胞强阳性染色(图4)；中性粒细胞强阳性染色(图5)；血管内皮细胞IL-1ra染色呈强阳性(图6)。
图3 正常人牙髓组织IL-1ra染色，巨噬细胞、血管内皮细胞染色阳性 (20×3.6)
图4 炎症人牙髓组织IL-1ra染色， 图5 炎症人牙髓组织IL- 图6 炎症人牙髓组织IL-1ra
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巨噬细胞、淋巴细胞染色阳性，浆 1ra染色，中性粒细胞染色 染色，血管内皮细
细胞呈强阳性染色 (40×3.6) 强阳性 (40×3.6) 胞染色强阳性 (40×3.6)
3 讨论
近年来，许多学者认为内源性IL-1与IL-1ra之间平衡失调是引起炎症的重要因素。IL-1与IL-1ra的表达细胞相同，已有许多研究表明，巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞等均表达IL-1和IL-1ra，这种既表达激活剂又表达拮抗剂现象表明组织有维持自身稳定的能力[2]。Hirsch[3]实验发现缺乏IL-1ra基因的突变小鼠对实验性内毒素血症致死性明显增加，并提出内源性IL-1ra的缺陷是致死和慢性炎症不愈的重要原因。Ishihara检测了龈沟液中IL-1α、IL-1β及IL-1ra的含量，表明龈沟液中IL-1活动指数即(IL-1α+IL-1β/IL-1ra)与牙周病进展程度密切相关[4]。但IL-1ra在牙髓组织中的作用如何，以及它在牙髓组织中是否表达研究甚少。
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本实验表明，在正常的牙髓组织中仅有少量巨噬细胞样细胞和血管内皮细胞表达IL-1ra，推测可能由于组织此时维持自身稳定，牙髓组织的防御系统未被启动。
在牙髓受到严重的内毒素(LPS)等外源性刺激或机体抵抗能力下降后，血管内单核巨噬细胞系统被激活，相应增加了分泌IL-1ra的量，中性粒细胞贴壁并游出，聚集，也可以分泌IL-1ra，抗原特异性B细胞受到抗原刺激后，发生活化，分化成熟为浆细胞，浆细胞合成分泌各类免疫球蛋白，参与体液免疫应答，保护机体免受侵害，表达IL-1ra也可能是抵抗炎症反应的一条途径。血管内皮细胞层是一个代谢活跃的组织，它不仅可以调节血管通透性，血管张力，而且是体内最大的代谢和内分泌器官，在炎症状态下也可合成分泌IL-1ra，以进一步维持牙髓组织自身稳定、下调炎症反应。并且，内源性IL-1ra能够抑制IL-1诱导产生的PGE2的量及一系列炎性因子的表达，而在牙髓炎症的发生发展过程中起着重要作用。
在多种炎性疾病中均证明，内源性IL-1ra对于维持组织自身内环境的平衡和稳定，保持机体健康至关重要，IL-1ra通过调节并且限制或中止IL-1产生一系列有害的生物学效应。Rebecca[5]的实验表明，在急性炎症中，IL-1ra比IL-1产生量多，大量的IL-1ra可以有效地阻滞IL-1结合IL-1受体，继而限制其产生一系列生物学作用，防止炎症的进一步扩展。实验性兔肠炎中，静滴一定量的抗IL-1ra血清，明显增加了兔的死亡率，并且在存活的兔肠组织中发现大量的炎性细胞浸润。Shanley[6]也证实给急性肺损伤的动物模型静脉滴入抗IL-1ra抗体，由于中和了内源性IL-1ra而致大量中性粒细胞、巨噬细胞流入肺泡，产生大量的IL-1，提高了致死率。
, 百拇医药
尽管IL-1和IL-1ra的效应细胞是共同的，但是它们调节IL-1和IL-1ra的基因表达和蛋白合成却是不同的，有学者证实LPS可以诱导细胞产生IL-1β早于IL-1ra，并且机体内注射LPS后，产生IL-1β的量是IL-1ra的10～100倍，因而内源性的IL-1ra虽然可以限制炎症的严重性，但在重感染或急性炎症中，它的作用是很弱的。本实验结果也表明，虽然慢性牙髓炎中有大量的IL-1ra产生，但是内源性IL-1ra的量不足以拮抗IL-1β，因而炎症并不能被控制。另外有学者证明体内存在可溶性IL-1RI和IL-1RⅡ，也可以作为IL-1抑制剂，但是sIL-1RI与IL-1ra结合的能力高于IL-1α和IL-1β，而sIL-1RⅡ与IL-1β结合的能力更强，sIL-1RI的产生与调节抵消了一部分IL-1ra的抗炎作用，同时sIL-1RⅡ与IL-1β结合又起到一部分抑制炎症的作用[7]，由于细胞因子作用具有双重性、多样性、网络性的特点，推测细胞因子以这一复杂的作用机制影响牙髓组织，因而对牙髓炎症的发生发展与转归尚有待进一步研究。
, 百拇医药
* 国家自然科学基金资助项目(39470752)
参考文献
1 Gabay C, Smith MF,Eidlen D et al . IL-1 receptor antagonist (IL-1ra) is an acute-phase protein. J Clin Invest, 1997, 99:2930
2 Arend WP, Welgus HG, Thompson RC et al. Biological properties of recombinant human monocyte-derived interleukin-1 receptor antagonist. J Clin Invest, 1990, 85:1694
3 Hirsch E. Functions of interleukin-1 receptor antagonist ingene knockout and overproducing mice. Proc Natl Acad Svi USA, 1996, 93:11008
, http://www.100md.com
4 Ishihara Y,Nishihara T,Kuroyanagi T et al. Gingival crevicular interleukin-1 and interleukin-1 receptor antagonist levels in periodontally healthy and diseased sites. J Periodont Res, 1997, 32:524
5 Rebecca B, kurt B, Ulich TR. Cytokine expression in the placenta: the role of interleukin-1 and interleukin-1 and interleukin-1 receptor antagonist expression in chorioamnionitis and parturition. Arch pathol lab Med, 1994,118:52
, http://www.100md.com 6 Shanley TP, Peters JL, Jones ML et al. Regulatory effects of endogenous interleukin-1 receptor antagonist protein in immunoglobulin G immune complex-induced lung injury. J Clin Invest, 1996,97:963
7 Weckmann AL, Varela JA. Cytokine inhibitors in autoimmune disease. Semin Arthritis Rheum, 1996, 26(2):539
收稿日期：1998-05-27
修回日期：1998-09-12
, 百拇医药
单位：第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032
关键词：白细胞介素1受体拮抗剂；牙髓；炎症
牙体牙髓牙周病学杂志CHINESE JOURNAL OF CONSERVATIVE DENTISTRY1999年 第9卷 第1期 Vol 摘要 目的：了解正常人牙髓组织及炎性牙髓组织中白细胞介素1受体拮抗剂(IL-1ra)的表达，探讨它在牙髓组织正常防御和内毒素性牙髓炎中的作用机制。方法：用ABC免疫组织化学法检测IL-1ra在牙髓组织中的表达。结果：在正常牙髓组织中仅有少量血管内皮细胞、巨噬细胞表达IL-1ra，在炎症牙髓组织中IL-1ra染色呈阳性，主要表达细胞为中性粒细胞、浆细胞、淋巴细胞和血管内皮细胞。结论：内源性IL-1ra在牙髓炎症的发生发展中可能起着重要作用。
中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)01-00021-03
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[牙体牙髓牙周病学杂志，1999, 9(1)：21]
Expression of interleukin-1 receptor antagonist
in human pulpal tissue
Lu Huaixiu, Xiao Mingzhen, Niu Zhongying
School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
Abstract Aim:To assess the role of Interleukin-1 receptor antagonist(IL-1ra) in the pulpal inflammation. Methods:IL-1ra expression in pulpal tissue was detected by immunohistochemical method. Results:Only a few macrophages endothelial cells showed weak staining in normal pulpal tissue; large amount of IL-1ra positive neutrophils,plasmacytes,endothelial cells, lymphocytes were stained in inflammatory pulp. Conculsions:The findings further support the hypothesis that IL-1ra may play a role in pulpitis.
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Key words IL-1ra；pulp；inflammation
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999, 9(1):21]
许多文献证实：细胞因子间量的失衡是炎症产生的主要原因，正常情况下人体细胞因子以网络的形式发挥作用，它们之间相互制约，相互协调，维护细胞因子之间量的稳定，这种平衡关系也是维持牙髓、牙周组织正常生理功能的重要条件。对于白细胞介素1受体拮抗剂(Interleukin-1 receptor antagonist，IL-1ra) 在炎症中的作用，及在一些炎症组织中表达已得到证实，并且许多学者认为，IL-1与IL-1ra之间的平衡是维持组织自身稳定的一个重要调节机制，这种平衡关系的打破将导致机体疾病发生[1]。目前，IL-1ra在牙髓炎症组织中是否表达研究甚少，本实验的目的是了解正常牙髓组织及牙髓炎症情况下IL-1ra的表达情况，探讨它在牙髓组织正常防御和牙髓炎中的作用，进一步为阐明牙髓炎的致病机理提供理论依据。
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1 材料和方法
1.1 主要试剂
鼠抗人α-IL-1ra McAb(北京医科大学免疫教研室)；ABC免疫组化染色试剂盒(sigma，USA)。
1.2 实验方法
取口腔颌面外科门诊患者因治疗需要拔除的健康第三磨牙或前磨牙为正常对照组，临床诊断为慢性牙髓炎需拔除的第三磨牙为炎症组，并通过组织学切片，HE染色作为病理学分组标准。
正常对照组7牙，慢性牙髓炎组9牙。炎症组的牙齿均因近中阻生，近中邻合面大面积缺损已近髓，探痛(+)，患者均有冷热痛症状，年龄在20～40岁之间，无明显全身疾患，近期未用过抗生素及免疫抑制剂。牙齿拔除后立即劈冠，取出冠髓，在40g/L多聚甲醛中固定4h，脱水，石蜡包埋，切片(5μm)，染色步骤如下：
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切片经二甲苯脱蜡系列乙醇至水3ml/L H2O2封闭内源酶 30min；PBS 5min×3；50ml/L正常羊血清孵育15min；鼠抗人IL-1ra单抗(1：100)4℃过夜；PBS 5min×2，生物素标记兔抗鼠IgG(1：100)37℃ 1h；PBS 5min×2；ABC复合物室温孵育 40min；PBS 5min×2；新鲜配制的DAB溶液染色，镜下控制显色强度，适时终止显色，苏木素复染细胞核；梯度乙醇脱水，二甲苯透明；中性树胶封片，镜下观察。
阳性对照：正常SD大鼠肝组织切片同步进行上述染色。
阴性对照：正常血清稀释液代替一抗，步骤与上述步骤相同。
2 结果
HE染色表明，人正常牙髓组织中，细胞成份以纤维细胞为主，散在分布一些巨噬细胞(图1)。慢性牙髓炎的牙髓组织中大量炎细胞浸润，以浆细胞、淋巴细胞为主，且有小血管扩张充血(图2)。
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图1 正常人牙髓组织, 图2 炎症人牙髓组织,HE染色 (40×3.6)
HE染色 (40×3.6)
免疫组化研究发现，正常牙髓组织中，仅少量巨噬细胞样细胞IL-1ra染色阳性，另外可见弱着色的血管内皮细胞(图3)。炎症性牙髓组织中，大量炎细胞浸润，高倍镜下病灶区可见淋巴细胞染色阳性，浆细胞强阳性染色(图4)；中性粒细胞强阳性染色(图5)；血管内皮细胞IL-1ra染色呈强阳性(图6)。
图3 正常人牙髓组织IL-1ra染色，巨噬细胞、血管内皮细胞染色阳性 (20×3.6)
图4 炎症人牙髓组织IL-1ra染色， 图5 炎症人牙髓组织IL- 图6 炎症人牙髓组织IL-1ra
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巨噬细胞、淋巴细胞染色阳性，浆 1ra染色，中性粒细胞染色 染色，血管内皮细
细胞呈强阳性染色 (40×3.6) 强阳性 (40×3.6) 胞染色强阳性 (40×3.6)
3 讨论
近年来，许多学者认为内源性IL-1与IL-1ra之间平衡失调是引起炎症的重要因素。IL-1与IL-1ra的表达细胞相同，已有许多研究表明，巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞等均表达IL-1和IL-1ra，这种既表达激活剂又表达拮抗剂现象表明组织有维持自身稳定的能力[2]。Hirsch[3]实验发现缺乏IL-1ra基因的突变小鼠对实验性内毒素血症致死性明显增加，并提出内源性IL-1ra的缺陷是致死和慢性炎症不愈的重要原因。Ishihara检测了龈沟液中IL-1α、IL-1β及IL-1ra的含量，表明龈沟液中IL-1活动指数即(IL-1α+IL-1β/IL-1ra)与牙周病进展程度密切相关[4]。但IL-1ra在牙髓组织中的作用如何，以及它在牙髓组织中是否表达研究甚少。
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本实验表明，在正常的牙髓组织中仅有少量巨噬细胞样细胞和血管内皮细胞表达IL-1ra，推测可能由于组织此时维持自身稳定，牙髓组织的防御系统未被启动。
在牙髓受到严重的内毒素(LPS)等外源性刺激或机体抵抗能力下降后，血管内单核巨噬细胞系统被激活，相应增加了分泌IL-1ra的量，中性粒细胞贴壁并游出，聚集，也可以分泌IL-1ra，抗原特异性B细胞受到抗原刺激后，发生活化，分化成熟为浆细胞，浆细胞合成分泌各类免疫球蛋白，参与体液免疫应答，保护机体免受侵害，表达IL-1ra也可能是抵抗炎症反应的一条途径。血管内皮细胞层是一个代谢活跃的组织，它不仅可以调节血管通透性，血管张力，而且是体内最大的代谢和内分泌器官，在炎症状态下也可合成分泌IL-1ra，以进一步维持牙髓组织自身稳定、下调炎症反应。并且，内源性IL-1ra能够抑制IL-1诱导产生的PGE2的量及一系列炎性因子的表达，而在牙髓炎症的发生发展过程中起着重要作用。
在多种炎性疾病中均证明，内源性IL-1ra对于维持组织自身内环境的平衡和稳定，保持机体健康至关重要，IL-1ra通过调节并且限制或中止IL-1产生一系列有害的生物学效应。Rebecca[5]的实验表明，在急性炎症中，IL-1ra比IL-1产生量多，大量的IL-1ra可以有效地阻滞IL-1结合IL-1受体，继而限制其产生一系列生物学作用，防止炎症的进一步扩展。实验性兔肠炎中，静滴一定量的抗IL-1ra血清，明显增加了兔的死亡率，并且在存活的兔肠组织中发现大量的炎性细胞浸润。Shanley[6]也证实给急性肺损伤的动物模型静脉滴入抗IL-1ra抗体，由于中和了内源性IL-1ra而致大量中性粒细胞、巨噬细胞流入肺泡，产生大量的IL-1，提高了致死率。
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尽管IL-1和IL-1ra的效应细胞是共同的，但是它们调节IL-1和IL-1ra的基因表达和蛋白合成却是不同的，有学者证实LPS可以诱导细胞产生IL-1β早于IL-1ra，并且机体内注射LPS后，产生IL-1β的量是IL-1ra的10～100倍，因而内源性的IL-1ra虽然可以限制炎症的严重性，但在重感染或急性炎症中，它的作用是很弱的。本实验结果也表明，虽然慢性牙髓炎中有大量的IL-1ra产生，但是内源性IL-1ra的量不足以拮抗IL-1β，因而炎症并不能被控制。另外有学者证明体内存在可溶性IL-1RI和IL-1RⅡ，也可以作为IL-1抑制剂，但是sIL-1RI与IL-1ra结合的能力高于IL-1α和IL-1β，而sIL-1RⅡ与IL-1β结合的能力更强，sIL-1RI的产生与调节抵消了一部分IL-1ra的抗炎作用，同时sIL-1RⅡ与IL-1β结合又起到一部分抑制炎症的作用[7]，由于细胞因子作用具有双重性、多样性、网络性的特点，推测细胞因子以这一复杂的作用机制影响牙髓组织，因而对牙髓炎症的发生发展与转归尚有待进一步研究。
, 百拇医药
* 国家自然科学基金资助项目(39470752)
参考文献
1 Gabay C, Smith MF,Eidlen D et al . IL-1 receptor antagonist (IL-1ra) is an acute-phase protein. J Clin Invest, 1997, 99:2930
2 Arend WP, Welgus HG, Thompson RC et al. Biological properties of recombinant human monocyte-derived interleukin-1 receptor antagonist. J Clin Invest, 1990, 85:1694
3 Hirsch E. Functions of interleukin-1 receptor antagonist ingene knockout and overproducing mice. Proc Natl Acad Svi USA, 1996, 93:11008
, http://www.100md.com
4 Ishihara Y,Nishihara T,Kuroyanagi T et al. Gingival crevicular interleukin-1 and interleukin-1 receptor antagonist levels in periodontally healthy and diseased sites. J Periodont Res, 1997, 32:524
5 Rebecca B, kurt B, Ulich TR. Cytokine expression in the placenta: the role of interleukin-1 and interleukin-1 and interleukin-1 receptor antagonist expression in chorioamnionitis and parturition. Arch pathol lab Med, 1994,118:52
, http://www.100md.com 6 Shanley TP, Peters JL, Jones ML et al. Regulatory effects of endogenous interleukin-1 receptor antagonist protein in immunoglobulin G immune complex-induced lung injury. J Clin Invest, 1996,97:963
7 Weckmann AL, Varela JA. Cytokine inhibitors in autoimmune disease. Semin Arthritis Rheum, 1996, 26(2):539
收稿日期：1998-05-27
修回日期：1998-09-12
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