NMDA受体Ⅰ及白细胞介素-1在癫痫机制中的作用
作者：吴希如 单巍松 张国荣
单位：北京医科大学第一医院儿科，北京 100034
关键词：受体；N-甲基-D-天冬氨酸；白细胞介素1；癫痫；病理生理学
990302 摘 要 应用北京医科大学培育的听源性癫痫易感大鼠P77PMC，以癫痫不易感大鼠Wistar为对照，系统研究了NMDA受体亚单位Ⅰ(NR-1)与白细胞介素-1(IL-1)在癫痫发生发展中的作用及相互关系。实验在整体、脑片、神经细胞培养及分子水平进行。所得较有意义的结果如下：(1)在听源性惊厥易感大鼠P77PMC整个发育过程中脑内NR-1 mRNA的表达，以及成年鼠脑内NMDA受体活性(MK-801结合)都高于对照组Wistar大鼠。惊厥后P77PMC脑内NR-1 mRNA的表达呈时间依赖性增加，惊厥后24 h比惊厥前增加111%～202%；NR-1反义寡核苷酸脑室注射(每μl10μg)可显著减轻P77PMC大鼠惊厥程度，并可对谷氨酸引起的体外神经细胞的损伤有保护作用,抑制谷氨酸导致的神经毒性作用。由此证实NR-1参与惊厥的发生发展，并与P77PMC大鼠的遗传性癫痫易感性关系密切。(2)在神经细胞培养中IL-1β可明显剂量依赖性地(1～25U.ml-1)提高NR-1 mRNA的表达，白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)可阻断此效应；IL-1β可剂量依赖性地提高NR-1受体活性,因此提示IL-1具有兴奋性神经调质的作用，其作用可能是通过直接或间接地促进脑内NR-1基因表达与受体功能。(3)应用缺陷型单纯疱疹病毒(HSV)pHSVLac载体(由哈佛大学Geller教授惠赠)构建含IL-1ra cDNA的pHSV-IL-1ra载体,进行转基因表达IL-1ra。侧脑室注射pHSV-IL-1ra假病毒(5×105pfu)可显著抑制P77PMC大鼠的惊厥发作。相关脑区有IL-1ra mRNA及蛋白的表达，可长达6周以上，说明HSV载体可有效地将IL-1ra基因转移入脑内。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R742.1-332
The effects of NMDA receptor-1 and interleukin-1 on
the pathogenesis of epilepsy
WU Xi-Ru， SHAN Wei-Song， ZHANG Guo-Rong
(Department of Pediatrics, the First Hospital,Beijing Medical University, Beijing 100034)
MeSH Receptors, N-methyl-D-aspartate Interleukin-1 Epilepsy/physiopathol
, 百拇医药
ABSTRACT Using audiogenic epilepsy prone rat P77PMC matched with epilepsy-resistant Wistar rat, we systematically studied the effects of NMDA receptor-I (NR-1) and interleukin-1 (IL-1) on the pathogenesis of epilepsy. Experiments were conducted in vivo, in brain slice, neuronal cell cultures, and at molecular levels. Some meaningful results were summarized as follows:(1) In P77PMC rat brain, NR-1 gene expression during development, and NMDA receptor activity (MK-801 binding) in adult rat were higher than that of control. After seizures, in adult P77PMC rat brain, NR-1 mRNA expression showed time-dependently up-regulation, above the basal level 111%-202% at 24 hours. Intracerebral ventricular (i.c.v) injection of NR-1 antisense oligonucleotide (10μg per μl) significantly reduced P77PMC rat audiogenic seizure severity. Pretreatment NR-1 oligonucleotide (2μmol.L-1) to neuronal cell cultures, inhibited neuronal glutamate damage. So we considered NR-1 participated in seizure pathogenesis, and closely related to the seizure susceptibility of P77PMC rat.(2) IL-1β can dose-dependently (1-25U.ml-1) increase NR-1 mRNA expression, and augment NR-1 activity in neuronal cell cultures; IL-1 receptor antagonist (IL-1ra) can reverse the effects of IL-1β. SoIL-1 acts as an excitatory neuromodulator, may be due to its direct or indirect effects on increasing NR-1 gene expression and NR function of the brain.(3) Using defective herpes simplex virus-1 (HSV-1) vector pHSVLac(kindly donated by Dr. Geller, Harvard University) successfully constructed recombinant pHSV-IL-1ra vector, to study experimental transgenic expression of IL-1ra. I.c.v. injection of pHSV-IL-1ra pseudovirus (5×105pfu) can significantly inhibit seizure attacks of P77PMC; the transgenic expression of IL-1ra mRNA and protein in related brain regions can be maintained longer than 6 weeks.
, 百拇医药
(J Beijing Med Univ, 1999,31:194-196)
国内外对癫痫发病相关因素的研究很多，重点为脑内兴奋与抑制的失衡，可以谷氨酸、γ-氨基丁酸及其受体为代表。对NMDA受体在脑发育、各种惊厥的发生发展、惊厥后神经可塑性调节、长程电增强形成等方面的作用已逐步由各种研究结果证实。但对以下问题尚少有研究报道：(1)NMDA受体活性及数量的改变与癫痫发生发展的因果关系；(2)遗传性癫痫易感动物发育中及惊厥前脑内的NMDA受体状态的研究；(3)在同一种癫痫动物模型，同时研究NMDA受体基因表达与受体功能；(4)利用反义NMDA受体寡核苷酸技术研究癫痫发生发展相关因素；(5)NMDA受体与其它相关因素同时研究。在我们既往的工作中[1]，也提出一些亟待深入的问题：(1)遗传性癫痫易感大鼠大脑皮层神经元对外源性NMDA更敏感，可诱发更高的c-fos mRNA表达，可见癫痫易感大鼠脑内NMDA受体必具备其特点；(2)白细胞介素-1(IL-1)可促进脑内[Ca2+]i的水平，并可通过c-fos/c-Jun调控兴奋性神经调质阿片肽的分泌。因此深入研究NMDA受体和IL-1各自在癫痫发生发展中的作用及二者间的相互作用是有意义的。
, 百拇医药
基于兴奋性氨基酸NMDA受体活性及表达增高是神经元兴奋性损伤及癫痫发病机制的关键环节，我们以听源性癫痫易感大鼠为模型，从发育、惊厥前后等不同阶段，在大鼠的整体水平及其脑片、各区域脑组织、大脑皮层神经元培养等不同水平(均严格配以正常对照)，以惊厥的行为分级、脑片神经元放电、mRNA表达水平等为主要参考指标作了如下探讨，(1)遗传性癫痫易感动物模型NMDA受体亚单位I(NR-1)在发育中脑内基因表达规律，以阐明NR-1与癫痫易感性形成的相互关系；(2)对惊厥前，惊厥后即刻，惊厥后不同时间NR-1基因表达及NMDA受体功能进行研究，以探讨NR-1在惊厥产生中的作用，了解惊厥如何调控NR-1基因表达及其受体功能，明确NR-1与惊厥发生和发展的相互关系，及其与癫痫易感性保持的关系。(3)反义NR-1作用机制：是否抑制NMDA受体 mRNA的转录与翻译？是否降低受体功能？从而揭示反义NR-1作用途径及环节。(4)研究IL-1与神经细胞兴奋性的关系，明确它的调质性质，阐明它在癫痫等惊厥性疾病中的具体作用机制，IL-1与NMDA受体相互关系以及白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)是否具有降低神经细胞兴奋性的作用；并将其基因通过病毒载体导入培养中的大脑皮层神经细胞和惊厥易感大鼠脑内，观察神经细胞兴奋性及大鼠惊厥程度的变化，进一步明确内源性IL-1与兴奋性毒性神经系统疾病的关系。
, 百拇医药
1 有关癫痫易感与不易感大鼠脑内NMDA受体的研究
1.1 发育中脑内NR-1 mRNA的表达
以Northern印迹杂交方法比较发育中遗传性癫痫易感大鼠P77PMC和癫痫不易感大鼠Wistar不同脑区NR-1基因表达特点，探讨其与惊厥易感性的关系。结果证实，两系大鼠发育中，大脑皮层、海马、下丘3个脑区的NR-1 mRNA表达趋势一致，并有共同规律，即出生后表达量逐渐增加，在发育的某一阶段达高峰，成年下降并稳定于某一水平；在整个发育过程中，P77PMC大鼠脑内NR-1 mRNA的表达量高于Wistar大鼠，并在某一阶段显著增高[2]。由此提示发育中P77PMC大鼠脑内NR-1基因表达增高可能是造成P77PMC大鼠“低惊厥阈值”及对听源性惊厥易感的原因之一。
1.2 惊厥前后脑内NR-1 mRNA的表达
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以遗传性癫痫易感大鼠P77PMC为研究对象，通过Northern印迹杂交检测NR-1 mRNA在惊厥后不同脑区表达，结果显示：P77PMC大鼠惊厥后大脑皮层、海马、皮层下、下丘NR-1 mRNA表达呈时间依赖性增加，4个脑区NR-1 mRNA惊厥后24 h较惊厥即刻分别增加了111%、113%、165%、202%。提示NMDA受体亚单位受惊厥活动控制，并参与惊厥的发生、发展及惊厥后突触结构的重建[3]。我们又用原位杂交技术探讨了遗传性癫痫易感大鼠P77PMC惊厥后不同时间NR-1基因表达情况，证明大脑皮层、海马齿状回、CA1、CA2、CA3及下丘NR-1 mRNA表达呈时间依赖性增加，下丘在惊厥后2 h即出现NR-1 mRNA高表达，而大脑皮层和海马各区至24 h达高峰[4]。听源性惊厥后这些区域NR-1 mRNA表达的上调可能与神经网络兴奋性增高及癫痫易感性的保持有关。相反，惊厥后脑中NR2A、NR2B mRNA表达却呈下调趋势，提示了下一步的研究内容。
1.3 脑内NMDA受体功能的研究
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我们以3H-MK-801在NMDA受体激动剂作用下与突触膜结合情况，检测了遗传性惊厥易感大鼠P77PMC脑内的NMDA受体功能。结果显示1×10-6 mol.L-1谷氨酸或1×10-6 mol.L-1谷氨酸加1×10-6 mol.L-1甘氨酸可促进P77PMC大鼠大脑皮层、海马突触膜对3H-MK-801的结合，并显著高于对照。一些抗痫药及生物制剂可降低或促进3H-MK-801的结合。提示NMDA受体活性增高是遗传性癫痫易感大鼠产生惊厥的重要因素；进而提示了抗癫痫药的可能作用途径[5]。
1.4 NR-1反义寡核苷酸的作用
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1.4.1 对神经细胞兴奋性毒性的拮抗作用 为探讨NR-1在兴奋性神经毒性损伤中的作用，在大鼠大脑皮层细胞原代培养中，将细胞分为加入反义、正义NR-1寡核苷酸，脂质体及正常对照组(每组n=5)，分别给药，通过细胞计数、扫描电镜、受体放射分析技术观察神经元形态及功能。结果发现，反义NR-1寡核苷酸(2μmol)可抑制NMDA诱导的神经兴奋性毒性造成的神经元死亡,拮抗NMDA造成的神经元结构破坏,包括胞体破损和树突、轴突断裂等，对神经细胞的保护率为52%；并使神经细胞对3H-MK-801结合降低50%。提示反义NR-1寡核苷酸具有拮抗兴奋性毒性的作用,其机制与NMDA受体功能下调有关[6]。
1.4.2 对惊厥(整体及脑片)的作用 以NR-1反义寡核苷酸脑室内注射(每μl10 μg)至成年P77PMC大鼠，每日1次，注射3 d后，则大鼠的听源性癫痫程度评分显著低于对照组。当将该大鼠颞叶皮层脑片在体外人工脑脊液(低Mg2+)中孵育，以细胞外记录电极所记录之嗅皮层早期类惊厥放电及迟发反复放电的频率及幅度均显著低于对照脑片。由此提示NR-1可能参与并在癫痫易感大鼠癫痫的启动与扩展中起重要作用[6]。
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2 有关IL-1，IL-1ra与NMDA受体相互作用及对神经细胞保护作用的研究
2.1 IL-1，IL-1ra与大鼠神经细胞NMDA受体关系的研究
研究表明，IL-1β在1～25 U.ml-1范围内可剂量依赖性地提高NMDA受体的活性和明显促进培养中的胚胎大鼠大脑皮层神经元NR-1 mRNA的表达，并存在一定的剂量、时间效应关系。IL-1ra可抑制IL-1β的上述生物学效应。提示IL-1β具有兴奋性神经调质作用，在癫痫等惊厥性疾病的发病过程中可能起一定作用，IL-1ra对某些神经系统兴奋性疾病具有潜在的治疗价值[7]。
2.2 IL-1ra对谷氨酸诱导的神经兴奋毒性有保护作用
以培养的胚胎大鼠大脑皮层神经元为模型，用台盼蓝染色和扫描电镜观察了IL-1ra对谷氨酸诱导的培养神经细胞毒性的影响；用Northern印迹杂交观察了IL-1β对培养神经细胞NR-1 mRNA表达的影响。结果提示，IL-1ra(1 mg.L-1)可明显抑制谷氨酸(0.5 mmol.L-1)引起的神经细胞毒性作用；IL-1β在1～50 U.ml-1浓度内可剂量依赖地促进NR-1 mRNA表达，IL-1ra可阻断此效应[8]。由此提示，内源性IL-1参与了谷氨酸诱导神经细胞毒性的病理过程，其作用机制之一可能是促进了NR-1 mRNA的表达。
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3 有关IL-1ra的实验性转基因研究
应用缺陷型单纯疱疹病毒(HSV-1)载体pHSVLac(由哈佛大学Geller教授惠赠)构建含IL-1ra cDNA的重组pHSV-IL-1ra载体，再由HSV-ltsK株包装成假病毒颗粒，然后注入P77PMC听源性惊厥易感大鼠侧脑室(5×105pfu)，观察LacZ基因和IL-1ra在脑内表达情况及对P77PMC大鼠惊厥程度的影响，结果表明：(1)LacZ在脑内神经和非神经细胞可持续表达8周以上；(2)侧脑室注射pHSV-IL-1ra假病毒可明显抑制P77PMC大鼠的惊厥发作，原位杂交和免疫荧光染色发现脑膜和脉络丛上皮细胞及某些神经细胞有IL-1ra mRNA和蛋白质的表达，持续 6周以上。结果表明HSV载体可有效地将IL-1ra基因转入脑内，并能明显抑制P77PMC听源性惊厥发作[9]。
通过上述3部分的研究，我们从正、反两方面进一步明确了NR-1、IL-1与遗传性癫痫易感动物癫痫发生发展的关系。并证实内源性IL-1在脑内可通过促进NMDA受体的基因表达与活性而起到促进CNS神经兴奋的作用。我们构建了含IL-1ra cDNA的质粒型单纯疱疹病毒载体，将基因转移技术引入癫痫机制的研究。并可为进一步阐明癫痫发生机制及今后临床癫痫及CNS兴奋毒性相关疾病的治疗提供实验理论基础。在实验过程中又提出了一些尚待研究的问题，如P77PMC大鼠惊厥后脑内NMDA受体亚单位2A、2B的基因表达与NR-1相反，呈下调趋势，我们正在作进一步工作。
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* 自然科学基金(39670265，39600160，39370259)资助项目； 国家教委科技进步一等奖获奖课题。
参考文献
1 Wu XR, Wang ZH, Shan WS, et al. Molecular neurobiological approach to the pathogenesis of epilepsy: a preliminary study. Brain Dev, 1995, 17:73-76
2 单巍松，张国荣，张月华,等.P77PMC和Wistar大鼠发育中不同脑区NMDAR1 mRNA表达的差异.北京医科大学学报, 1997, 29(1): 35-37
3 单巍松，张国荣，张月华,等.遗传性惊厥易感性大鼠脑内NMDAR1基因表达.生物化学与生物物理进展，1997, 24(1)：52-56
, 百拇医药
4 单巍松，张国荣，梁英武，等.听源性惊厥易感大鼠脑内NMDA R1基因的表达.神经解剖杂志，1997, 13 (1): 19-24
5 单巍松，梁英武，张国荣,等.遗传性癫痫易感大鼠脑内NMDA受体功能的研究.中国药理学通报，1996, 12(4): 313-316
6 Shan WS, Wu XR, Zhang GR, et al. Effects of antisense oligodeoxynucleotides of NMDA R1 on suppression of seizures and protection of cortical neurons from excitotoxicity in vivo and in vitro. Chin Med J, 1997, 110(8): 579-583
7 张国荣，单巍松，梁英武,等.白细胞介素1与大鼠神经细胞NMDA受体关系的研究.中国免疫学杂志，1997, 13: 94-96
8 张国荣，单巍松，梁英武,等.IL-1ra对谷氨酸诱导神经细胞毒性的保护作用.北京医科大学学报，1997, 29(1): 38-39
9 Zhang GR, Shan WS, Wang ZH, et al. Attenuation of seizure in P77PMC rats with an HSV-vector expressing IL-1ra in brain. Sci China, 1998, 41(1): 93-98
(1999-01-15收稿), 百拇医药
单位：北京医科大学第一医院儿科，北京 100034
关键词：受体；N-甲基-D-天冬氨酸；白细胞介素1；癫痫；病理生理学
990302 摘 要 应用北京医科大学培育的听源性癫痫易感大鼠P77PMC，以癫痫不易感大鼠Wistar为对照，系统研究了NMDA受体亚单位Ⅰ(NR-1)与白细胞介素-1(IL-1)在癫痫发生发展中的作用及相互关系。实验在整体、脑片、神经细胞培养及分子水平进行。所得较有意义的结果如下：(1)在听源性惊厥易感大鼠P77PMC整个发育过程中脑内NR-1 mRNA的表达，以及成年鼠脑内NMDA受体活性(MK-801结合)都高于对照组Wistar大鼠。惊厥后P77PMC脑内NR-1 mRNA的表达呈时间依赖性增加，惊厥后24 h比惊厥前增加111%～202%；NR-1反义寡核苷酸脑室注射(每μl10μg)可显著减轻P77PMC大鼠惊厥程度，并可对谷氨酸引起的体外神经细胞的损伤有保护作用,抑制谷氨酸导致的神经毒性作用。由此证实NR-1参与惊厥的发生发展，并与P77PMC大鼠的遗传性癫痫易感性关系密切。(2)在神经细胞培养中IL-1β可明显剂量依赖性地(1～25U.ml-1)提高NR-1 mRNA的表达，白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)可阻断此效应；IL-1β可剂量依赖性地提高NR-1受体活性,因此提示IL-1具有兴奋性神经调质的作用，其作用可能是通过直接或间接地促进脑内NR-1基因表达与受体功能。(3)应用缺陷型单纯疱疹病毒(HSV)pHSVLac载体(由哈佛大学Geller教授惠赠)构建含IL-1ra cDNA的pHSV-IL-1ra载体,进行转基因表达IL-1ra。侧脑室注射pHSV-IL-1ra假病毒(5×105pfu)可显著抑制P77PMC大鼠的惊厥发作。相关脑区有IL-1ra mRNA及蛋白的表达，可长达6周以上，说明HSV载体可有效地将IL-1ra基因转移入脑内。
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中国图书资料分类法分类号 R742.1-332
The effects of NMDA receptor-1 and interleukin-1 on
the pathogenesis of epilepsy
WU Xi-Ru， SHAN Wei-Song， ZHANG Guo-Rong
(Department of Pediatrics, the First Hospital,Beijing Medical University, Beijing 100034)
MeSH Receptors, N-methyl-D-aspartate Interleukin-1 Epilepsy/physiopathol
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ABSTRACT Using audiogenic epilepsy prone rat P77PMC matched with epilepsy-resistant Wistar rat, we systematically studied the effects of NMDA receptor-I (NR-1) and interleukin-1 (IL-1) on the pathogenesis of epilepsy. Experiments were conducted in vivo, in brain slice, neuronal cell cultures, and at molecular levels. Some meaningful results were summarized as follows:(1) In P77PMC rat brain, NR-1 gene expression during development, and NMDA receptor activity (MK-801 binding) in adult rat were higher than that of control. After seizures, in adult P77PMC rat brain, NR-1 mRNA expression showed time-dependently up-regulation, above the basal level 111%-202% at 24 hours. Intracerebral ventricular (i.c.v) injection of NR-1 antisense oligonucleotide (10μg per μl) significantly reduced P77PMC rat audiogenic seizure severity. Pretreatment NR-1 oligonucleotide (2μmol.L-1) to neuronal cell cultures, inhibited neuronal glutamate damage. So we considered NR-1 participated in seizure pathogenesis, and closely related to the seizure susceptibility of P77PMC rat.(2) IL-1β can dose-dependently (1-25U.ml-1) increase NR-1 mRNA expression, and augment NR-1 activity in neuronal cell cultures; IL-1 receptor antagonist (IL-1ra) can reverse the effects of IL-1β. SoIL-1 acts as an excitatory neuromodulator, may be due to its direct or indirect effects on increasing NR-1 gene expression and NR function of the brain.(3) Using defective herpes simplex virus-1 (HSV-1) vector pHSVLac(kindly donated by Dr. Geller, Harvard University) successfully constructed recombinant pHSV-IL-1ra vector, to study experimental transgenic expression of IL-1ra. I.c.v. injection of pHSV-IL-1ra pseudovirus (5×105pfu) can significantly inhibit seizure attacks of P77PMC; the transgenic expression of IL-1ra mRNA and protein in related brain regions can be maintained longer than 6 weeks.
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(J Beijing Med Univ, 1999,31:194-196)
国内外对癫痫发病相关因素的研究很多，重点为脑内兴奋与抑制的失衡，可以谷氨酸、γ-氨基丁酸及其受体为代表。对NMDA受体在脑发育、各种惊厥的发生发展、惊厥后神经可塑性调节、长程电增强形成等方面的作用已逐步由各种研究结果证实。但对以下问题尚少有研究报道：(1)NMDA受体活性及数量的改变与癫痫发生发展的因果关系；(2)遗传性癫痫易感动物发育中及惊厥前脑内的NMDA受体状态的研究；(3)在同一种癫痫动物模型，同时研究NMDA受体基因表达与受体功能；(4)利用反义NMDA受体寡核苷酸技术研究癫痫发生发展相关因素；(5)NMDA受体与其它相关因素同时研究。在我们既往的工作中[1]，也提出一些亟待深入的问题：(1)遗传性癫痫易感大鼠大脑皮层神经元对外源性NMDA更敏感，可诱发更高的c-fos mRNA表达，可见癫痫易感大鼠脑内NMDA受体必具备其特点；(2)白细胞介素-1(IL-1)可促进脑内[Ca2+]i的水平，并可通过c-fos/c-Jun调控兴奋性神经调质阿片肽的分泌。因此深入研究NMDA受体和IL-1各自在癫痫发生发展中的作用及二者间的相互作用是有意义的。
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基于兴奋性氨基酸NMDA受体活性及表达增高是神经元兴奋性损伤及癫痫发病机制的关键环节，我们以听源性癫痫易感大鼠为模型，从发育、惊厥前后等不同阶段，在大鼠的整体水平及其脑片、各区域脑组织、大脑皮层神经元培养等不同水平(均严格配以正常对照)，以惊厥的行为分级、脑片神经元放电、mRNA表达水平等为主要参考指标作了如下探讨，(1)遗传性癫痫易感动物模型NMDA受体亚单位I(NR-1)在发育中脑内基因表达规律，以阐明NR-1与癫痫易感性形成的相互关系；(2)对惊厥前，惊厥后即刻，惊厥后不同时间NR-1基因表达及NMDA受体功能进行研究，以探讨NR-1在惊厥产生中的作用，了解惊厥如何调控NR-1基因表达及其受体功能，明确NR-1与惊厥发生和发展的相互关系，及其与癫痫易感性保持的关系。(3)反义NR-1作用机制：是否抑制NMDA受体 mRNA的转录与翻译？是否降低受体功能？从而揭示反义NR-1作用途径及环节。(4)研究IL-1与神经细胞兴奋性的关系，明确它的调质性质，阐明它在癫痫等惊厥性疾病中的具体作用机制，IL-1与NMDA受体相互关系以及白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)是否具有降低神经细胞兴奋性的作用；并将其基因通过病毒载体导入培养中的大脑皮层神经细胞和惊厥易感大鼠脑内，观察神经细胞兴奋性及大鼠惊厥程度的变化，进一步明确内源性IL-1与兴奋性毒性神经系统疾病的关系。
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1 有关癫痫易感与不易感大鼠脑内NMDA受体的研究
1.1 发育中脑内NR-1 mRNA的表达
以Northern印迹杂交方法比较发育中遗传性癫痫易感大鼠P77PMC和癫痫不易感大鼠Wistar不同脑区NR-1基因表达特点，探讨其与惊厥易感性的关系。结果证实，两系大鼠发育中，大脑皮层、海马、下丘3个脑区的NR-1 mRNA表达趋势一致，并有共同规律，即出生后表达量逐渐增加，在发育的某一阶段达高峰，成年下降并稳定于某一水平；在整个发育过程中，P77PMC大鼠脑内NR-1 mRNA的表达量高于Wistar大鼠，并在某一阶段显著增高[2]。由此提示发育中P77PMC大鼠脑内NR-1基因表达增高可能是造成P77PMC大鼠“低惊厥阈值”及对听源性惊厥易感的原因之一。
1.2 惊厥前后脑内NR-1 mRNA的表达
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以遗传性癫痫易感大鼠P77PMC为研究对象，通过Northern印迹杂交检测NR-1 mRNA在惊厥后不同脑区表达，结果显示：P77PMC大鼠惊厥后大脑皮层、海马、皮层下、下丘NR-1 mRNA表达呈时间依赖性增加，4个脑区NR-1 mRNA惊厥后24 h较惊厥即刻分别增加了111%、113%、165%、202%。提示NMDA受体亚单位受惊厥活动控制，并参与惊厥的发生、发展及惊厥后突触结构的重建[3]。我们又用原位杂交技术探讨了遗传性癫痫易感大鼠P77PMC惊厥后不同时间NR-1基因表达情况，证明大脑皮层、海马齿状回、CA1、CA2、CA3及下丘NR-1 mRNA表达呈时间依赖性增加，下丘在惊厥后2 h即出现NR-1 mRNA高表达，而大脑皮层和海马各区至24 h达高峰[4]。听源性惊厥后这些区域NR-1 mRNA表达的上调可能与神经网络兴奋性增高及癫痫易感性的保持有关。相反，惊厥后脑中NR2A、NR2B mRNA表达却呈下调趋势，提示了下一步的研究内容。
1.3 脑内NMDA受体功能的研究
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我们以3H-MK-801在NMDA受体激动剂作用下与突触膜结合情况，检测了遗传性惊厥易感大鼠P77PMC脑内的NMDA受体功能。结果显示1×10-6 mol.L-1谷氨酸或1×10-6 mol.L-1谷氨酸加1×10-6 mol.L-1甘氨酸可促进P77PMC大鼠大脑皮层、海马突触膜对3H-MK-801的结合，并显著高于对照。一些抗痫药及生物制剂可降低或促进3H-MK-801的结合。提示NMDA受体活性增高是遗传性癫痫易感大鼠产生惊厥的重要因素；进而提示了抗癫痫药的可能作用途径[5]。
1.4 NR-1反义寡核苷酸的作用
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1.4.1 对神经细胞兴奋性毒性的拮抗作用 为探讨NR-1在兴奋性神经毒性损伤中的作用，在大鼠大脑皮层细胞原代培养中，将细胞分为加入反义、正义NR-1寡核苷酸，脂质体及正常对照组(每组n=5)，分别给药，通过细胞计数、扫描电镜、受体放射分析技术观察神经元形态及功能。结果发现，反义NR-1寡核苷酸(2μmol)可抑制NMDA诱导的神经兴奋性毒性造成的神经元死亡,拮抗NMDA造成的神经元结构破坏,包括胞体破损和树突、轴突断裂等，对神经细胞的保护率为52%；并使神经细胞对3H-MK-801结合降低50%。提示反义NR-1寡核苷酸具有拮抗兴奋性毒性的作用,其机制与NMDA受体功能下调有关[6]。
1.4.2 对惊厥(整体及脑片)的作用 以NR-1反义寡核苷酸脑室内注射(每μl10 μg)至成年P77PMC大鼠，每日1次，注射3 d后，则大鼠的听源性癫痫程度评分显著低于对照组。当将该大鼠颞叶皮层脑片在体外人工脑脊液(低Mg2+)中孵育，以细胞外记录电极所记录之嗅皮层早期类惊厥放电及迟发反复放电的频率及幅度均显著低于对照脑片。由此提示NR-1可能参与并在癫痫易感大鼠癫痫的启动与扩展中起重要作用[6]。
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2 有关IL-1，IL-1ra与NMDA受体相互作用及对神经细胞保护作用的研究
2.1 IL-1，IL-1ra与大鼠神经细胞NMDA受体关系的研究
研究表明，IL-1β在1～25 U.ml-1范围内可剂量依赖性地提高NMDA受体的活性和明显促进培养中的胚胎大鼠大脑皮层神经元NR-1 mRNA的表达，并存在一定的剂量、时间效应关系。IL-1ra可抑制IL-1β的上述生物学效应。提示IL-1β具有兴奋性神经调质作用，在癫痫等惊厥性疾病的发病过程中可能起一定作用，IL-1ra对某些神经系统兴奋性疾病具有潜在的治疗价值[7]。
2.2 IL-1ra对谷氨酸诱导的神经兴奋毒性有保护作用
以培养的胚胎大鼠大脑皮层神经元为模型，用台盼蓝染色和扫描电镜观察了IL-1ra对谷氨酸诱导的培养神经细胞毒性的影响；用Northern印迹杂交观察了IL-1β对培养神经细胞NR-1 mRNA表达的影响。结果提示，IL-1ra(1 mg.L-1)可明显抑制谷氨酸(0.5 mmol.L-1)引起的神经细胞毒性作用；IL-1β在1～50 U.ml-1浓度内可剂量依赖地促进NR-1 mRNA表达，IL-1ra可阻断此效应[8]。由此提示，内源性IL-1参与了谷氨酸诱导神经细胞毒性的病理过程，其作用机制之一可能是促进了NR-1 mRNA的表达。
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3 有关IL-1ra的实验性转基因研究
应用缺陷型单纯疱疹病毒(HSV-1)载体pHSVLac(由哈佛大学Geller教授惠赠)构建含IL-1ra cDNA的重组pHSV-IL-1ra载体，再由HSV-ltsK株包装成假病毒颗粒，然后注入P77PMC听源性惊厥易感大鼠侧脑室(5×105pfu)，观察LacZ基因和IL-1ra在脑内表达情况及对P77PMC大鼠惊厥程度的影响，结果表明：(1)LacZ在脑内神经和非神经细胞可持续表达8周以上；(2)侧脑室注射pHSV-IL-1ra假病毒可明显抑制P77PMC大鼠的惊厥发作，原位杂交和免疫荧光染色发现脑膜和脉络丛上皮细胞及某些神经细胞有IL-1ra mRNA和蛋白质的表达，持续 6周以上。结果表明HSV载体可有效地将IL-1ra基因转入脑内，并能明显抑制P77PMC听源性惊厥发作[9]。
通过上述3部分的研究，我们从正、反两方面进一步明确了NR-1、IL-1与遗传性癫痫易感动物癫痫发生发展的关系。并证实内源性IL-1在脑内可通过促进NMDA受体的基因表达与活性而起到促进CNS神经兴奋的作用。我们构建了含IL-1ra cDNA的质粒型单纯疱疹病毒载体，将基因转移技术引入癫痫机制的研究。并可为进一步阐明癫痫发生机制及今后临床癫痫及CNS兴奋毒性相关疾病的治疗提供实验理论基础。在实验过程中又提出了一些尚待研究的问题，如P77PMC大鼠惊厥后脑内NMDA受体亚单位2A、2B的基因表达与NR-1相反，呈下调趋势，我们正在作进一步工作。
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* 自然科学基金(39670265，39600160，39370259)资助项目； 国家教委科技进步一等奖获奖课题。
参考文献
1 Wu XR, Wang ZH, Shan WS, et al. Molecular neurobiological approach to the pathogenesis of epilepsy: a preliminary study. Brain Dev, 1995, 17:73-76
2 单巍松，张国荣，张月华,等.P77PMC和Wistar大鼠发育中不同脑区NMDAR1 mRNA表达的差异.北京医科大学学报, 1997, 29(1): 35-37
3 单巍松，张国荣，张月华,等.遗传性惊厥易感性大鼠脑内NMDAR1基因表达.生物化学与生物物理进展，1997, 24(1)：52-56
, 百拇医药
4 单巍松，张国荣，梁英武，等.听源性惊厥易感大鼠脑内NMDA R1基因的表达.神经解剖杂志，1997, 13 (1): 19-24
5 单巍松，梁英武，张国荣,等.遗传性癫痫易感大鼠脑内NMDA受体功能的研究.中国药理学通报，1996, 12(4): 313-316
6 Shan WS, Wu XR, Zhang GR, et al. Effects of antisense oligodeoxynucleotides of NMDA R1 on suppression of seizures and protection of cortical neurons from excitotoxicity in vivo and in vitro. Chin Med J, 1997, 110(8): 579-583
7 张国荣，单巍松，梁英武,等.白细胞介素1与大鼠神经细胞NMDA受体关系的研究.中国免疫学杂志，1997, 13: 94-96
8 张国荣，单巍松，梁英武,等.IL-1ra对谷氨酸诱导神经细胞毒性的保护作用.北京医科大学学报，1997, 29(1): 38-39
9 Zhang GR, Shan WS, Wang ZH, et al. Attenuation of seizure in P77PMC rats with an HSV-vector expressing IL-1ra in brain. Sci China, 1998, 41(1): 93-98
(1999-01-15收稿), 百拇医药