SLE患者外周血T细胞C-myc蛋白的表达及其与ANA的关系
作者：陈 琦 殷志伟
单位：苏州医学院病理生理学教研室,苏州，215007
关键词：系统性红斑狼疮；C-myc蛋白；抗核抗体；T淋巴细胞
苏州医学院学报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE SUZHOU1999年 第19卷 第8期 Vol 摘要 应用流式细胞仪测定了16例系统性红斑狼疮(SLE)患者及正常人外周血新鲜分离的T淋巴细胞C-myc蛋白的表达；并采用间接免疫荧光法检测患者血浆中的抗核抗体(ANA)的含量。结果显示，SLE患者T细胞C-myc蛋白水平较正常人明显增高(P<0.01)，且活动期明显高于非活动期(P<0.01)；活动期血浆ANA含量明显高于非活动期(P<0.01)，且外周血T细胞C—myc蛋白水平与血浆ANA含量呈正相关(r=0.7668,P<0.01)。结果提示，在SLE发病过程中存在C-myc蛋白的异常表达，C-myc蛋白在SLE发病过程中起重要作用。
, 百拇医药
中图法分类 R593.24
The Expression of C-myc Protein on Peripheral T Cells of SLE Patients and the Correlation between C-myc and ANA
Chen qi, Yin Zhiwei
Department of Pathophysiology, Suzhou Medical college, Suzhou, 215007
Abstract The expression of c-myc protein on the T cells in patients with SLE and on that in the healthy control was measured by flow cytometry analysis. Level of serum in SLE patients C-myc was significantly higher than that in the controls(P<0.01). The difference of the level of C-myc expression between active and inactive SLE was significant (P<0.01). The results also show that the level of serum ANA in active SLE patients increased significantly (P<0.01). By the analysis of the correlation between the level of C-myc expression on T cells and the level of ANA in serum, a positive correlation was demonstrated in SLE. This observation suggests that the expression of C-myc protein is abnormal in pathogenic progress of SLE. C-myc protein is important for the pathogenesis of SLE.
, 百拇医药
Key words SLE patients; C-myc protein; ANA; T cell
系统性红斑狼疮(SLE)是一种自身免疫性疾病，其主要免疫学特征是淋巴细胞功能异常，产生大量自身抗体[1]，如抗核抗体(ANA)等。但SLE免疫细胞异常的原因尚未阐明。近来国外有研究[2]认为，C-myc基因可能会引起淋巴细胞异常活化和凋亡，从而在SLE的免疫和免疫调节中起重要作用。为此，我们采用流式细胞仪检测SLE患者及正常人外周血T淋巴细胞C-myc蛋白的表达程度，并对患者T淋巴细胞C-myc阳性百分率与血浆ANA含量间的相关性进行分析，旨在探讨C-myc在SLE的表达以及与ANA的关系，为SLE免疫发病机理提供实验依据，并为SLE的治疗提供新的线索。
1 材料和方法
1.1 对象：SLE患者为我院附属一院皮肤科病人，全部符合美国风湿病协会(ARA)1982年修订的诊断标准。活动期和非活动期的判断均参照我室陈家福采用的标准[3]。其中活动期8例，均为女性，年龄18～50岁；非活动期8例，均为女性，年龄22～48岁；正常对照组8例，均为女性，年龄20～42岁。为苏州市中心血库健康献血员。各组年龄、性别齐同。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 T细胞的制备：取5ml外周静脉血(每ml含25U肝素抗凝)，用Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液分离出外周血单个核细胞(PBMC)。参照文献等[4]介绍的尼龙棉柱分离法分离出T细胞，用鼠抗人CD3McAb检测T细胞，纯度大于90%。
1.2.2 T细胞C-myc蛋白的表达[5]：分离出的T细胞加入1%多聚甲醛，室温固定10 min后，PBS洗2遍。再加入0.1%Triton X-100作用5 min，以增加细胞膜的通透性，PBS洗2遍。用鼠抗人C—myc单抗(北京邦定公司产品)20μl置4°C 30 min, PBS洗2遍。之后加入羊抗鼠IgG-FTTC(荧光二抗)20 μ1 4℃ 30 min，PBS洗3遍。经30～40 μm尼龙网过滤后，置流式细胞仪(美国Coulter产品，机型为EPICSRXI)计数5×104细胞，在荧光直方图上计算C-myc阳性细胞百分率。每份标本均设阴性对照，即用正常大鼠血清取代第一抗体为阴性对照。
, 百拇医药
1.2.3 血浆ANA检测：采用间接免疫荧光法，试剂盒由上海华山医院提供，依照说明书操作。
1.3 统计方法：实验组和对照组C-myc阳性细胞百分率值经平方根反正弦转换后作方差分析；血浆ANA含量经对数转换后与C—myc阳性细胞百分率进行直线相关分析。
2 结果
2.1 流式细胞仪检测外周血T细胞C-myc阳性百分率：以T淋巴细胞染色阳性数表示C-myc蛋白表达的高低。见附图。
正常对照组为3.1%±1.1%，非活动期SLE组为12.5%±6.5%，活动期SLE组为21.08%±7.9%。结果表明，非活动期SLE患者T细胞C-myc蛋白表达显著高于正常人(P<0.01)，活动期高于非活动期(P<0.01)。
, 百拇医药
附图 正常人与SLE各期患者外周血T细胞C-myc蛋白表达
2.2 C-myc蛋白表达与ANA抗体之间的关系：血浆ANA含量的倒数的几何平均值及几何标准差，SLE患者非活动期为11.84±1.05，活动期为35.48±1.19；几何均数两者差异显著(P<0.01)，且与C-myc存在正相关关系，r为0.7668，P<0.01。
3 讨论
C-myc基因位于第8号染色体上，编码的蛋白位于细胞核内，是一种核蛋白，它能结合在特异的DNA序列上，调节基因的表达，参与细胞的生长、分化和增殖，还能刺激细胞发生凋亡。Kelly等[6]发现正常人T、B淋巴细胞在体外有丝分裂原的刺激下被激活的同时，参与细胞调节的C-myc蛋白表达增高，这说明C-myc表达在控制细胞周期中起重要作用。本研究发现，C-myc蛋白在正常人T细胞表达很低，而SLE患者T淋巴细胞C-myc蛋白表达明显增高，且活动期高于非活动期，这与国外报道[7]一致。由此说明，SLE患者体内T细胞是处于活化状态。这与本室近几年研究结果[3]一致。且Elias等[8]发现，SLE患者C-myc基因未发生结构改变，如突变或甲基化，但是SLE患者C-myc基因的转录率增高，降解率下降，从而导致SLE患者的淋巴细胞C-myc蛋白水平增高。因此在SLE患者中，某些致病因素可能使C-myc基因转录率增高，产生大量C-myc蛋白，C-myc蛋白结合到特定的DNA序列上，从而可能通过调控淋巴细胞，使之异常活化并产生大量自身抗体，引起多系统和器官受累，从而导致SLE的发生。
, 百拇医药
我们还将SLE患者血浆抗核抗体(ANA)含量经对数转换后与T淋巴细胞C-myc蛋白阳性百分率进行直线相关分析，结果发现两者呈正相关。Emlen等[9]发现，SLE患者淋巴细胞凋亡率增高，且认为SLE患者细胞凋亡过程中产生大量核小体成分，作为隐蔽抗原激发自身免疫反应，产生自身抗体如抗核抗体(ANA)等，形成免疫复合物而致病。由此说明SLE患者体内大量抗核抗体的来源。许多资料[10，11]发现，C-myc可启动凋亡程序，但bcl-2可抑制C-myc所导致的凋亡。SLE患者bcl-2表达降低[12]，对C-myc抑制作用减少。故考虑SLE患者T细胞C-myc异常高表达可能诱导淋巴细胞调亡增加，使自身抗体产生增加，因而导致SLE的发生。我们认为C—myc蛋白可能通过对细胞的异常活化和凋亡调控等多方面来参与SLE的免疫发病机制。
参考文献
1 Demmos MK,et al. Oncogene expression in autoimmune and normal peripheral blood mononuclear cells. J Exp Med, 1986, 163∶1292
, 百拇医药
2 Elefthriades EG, et al. Transcriptional and posttranscription responsible for the increased expression of C-myc protooncogene in lymphocytes from patients with systemic lupus erythematosus. Clin Immunol Innunolpathol, 1986, 52∶507
3 陈家福，等.SLE患者白介素6活性的研究.中华皮肤科杂志，1993，26∶32
4 张工梁，等.分离T、B淋巴细胞的简易方法.上海免疫学杂志，1986，6∶184
5 Shinya K, et al. Alterations of C-myc expression by antisense oligodeoxnucleotides enhance the induction of apoptosis in HL-60 cells. Cancer Res, 1995, 55∶1379
, http://www.100md.com
6 Kelly K, et al. Cell-specific regulation of the C-myc gene by lymphocyte mitogens and platelet-derived growth factor. Cell, 1983,35∶603
7 Boumpas DT, et al. Increased proto oncogene expression in peripheral blood lymphocyte from patients with systemic lupus erythematosus and autoimmune disease. Arthritis Rhem, 1986, 29∶755
8 Elias G, et al. Regulation of C-myc expression in patients with systemic lupus erythematosus. Clin Immuol Immnopathol, 1989, 52∶107
, 百拇医药
9 Emlen W, et al. Accelerated in vitro apoptosis of lymphocytes from patients with systemic lupus erythematosus. J Immunol, 1994, 152∶3685
10 William RC, et al. Oncogenes, viruses of rheumogenes. Am J Med. 1986, 80∶1011
11 Bissonette RP, et al. Apoptotic cell death induced by C—myc is inhibited by bcl-2. Nature, 1992, 359∶552
12 蒋 利，等.系统性红斑狼疮患者T淋巴细胞亚群Fas及bcl-2抗原的表达.中华皮肤科杂志， 1998，31∶4
(1998年12月30日收稿), http://www.100md.com
单位：苏州医学院病理生理学教研室,苏州，215007
关键词：系统性红斑狼疮；C-myc蛋白；抗核抗体；T淋巴细胞
苏州医学院学报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE SUZHOU1999年 第19卷 第8期 Vol 摘要 应用流式细胞仪测定了16例系统性红斑狼疮(SLE)患者及正常人外周血新鲜分离的T淋巴细胞C-myc蛋白的表达；并采用间接免疫荧光法检测患者血浆中的抗核抗体(ANA)的含量。结果显示，SLE患者T细胞C-myc蛋白水平较正常人明显增高(P<0.01)，且活动期明显高于非活动期(P<0.01)；活动期血浆ANA含量明显高于非活动期(P<0.01)，且外周血T细胞C—myc蛋白水平与血浆ANA含量呈正相关(r=0.7668,P<0.01)。结果提示，在SLE发病过程中存在C-myc蛋白的异常表达，C-myc蛋白在SLE发病过程中起重要作用。
, 百拇医药
中图法分类 R593.24
The Expression of C-myc Protein on Peripheral T Cells of SLE Patients and the Correlation between C-myc and ANA
Chen qi, Yin Zhiwei
Department of Pathophysiology, Suzhou Medical college, Suzhou, 215007
Abstract The expression of c-myc protein on the T cells in patients with SLE and on that in the healthy control was measured by flow cytometry analysis. Level of serum in SLE patients C-myc was significantly higher than that in the controls(P<0.01). The difference of the level of C-myc expression between active and inactive SLE was significant (P<0.01). The results also show that the level of serum ANA in active SLE patients increased significantly (P<0.01). By the analysis of the correlation between the level of C-myc expression on T cells and the level of ANA in serum, a positive correlation was demonstrated in SLE. This observation suggests that the expression of C-myc protein is abnormal in pathogenic progress of SLE. C-myc protein is important for the pathogenesis of SLE.
, 百拇医药
Key words SLE patients; C-myc protein; ANA; T cell
系统性红斑狼疮(SLE)是一种自身免疫性疾病，其主要免疫学特征是淋巴细胞功能异常，产生大量自身抗体[1]，如抗核抗体(ANA)等。但SLE免疫细胞异常的原因尚未阐明。近来国外有研究[2]认为，C-myc基因可能会引起淋巴细胞异常活化和凋亡，从而在SLE的免疫和免疫调节中起重要作用。为此，我们采用流式细胞仪检测SLE患者及正常人外周血T淋巴细胞C-myc蛋白的表达程度，并对患者T淋巴细胞C-myc阳性百分率与血浆ANA含量间的相关性进行分析，旨在探讨C-myc在SLE的表达以及与ANA的关系，为SLE免疫发病机理提供实验依据，并为SLE的治疗提供新的线索。
1 材料和方法
1.1 对象：SLE患者为我院附属一院皮肤科病人，全部符合美国风湿病协会(ARA)1982年修订的诊断标准。活动期和非活动期的判断均参照我室陈家福采用的标准[3]。其中活动期8例，均为女性，年龄18～50岁；非活动期8例，均为女性，年龄22～48岁；正常对照组8例，均为女性，年龄20～42岁。为苏州市中心血库健康献血员。各组年龄、性别齐同。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 T细胞的制备：取5ml外周静脉血(每ml含25U肝素抗凝)，用Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液分离出外周血单个核细胞(PBMC)。参照文献等[4]介绍的尼龙棉柱分离法分离出T细胞，用鼠抗人CD3McAb检测T细胞，纯度大于90%。
1.2.2 T细胞C-myc蛋白的表达[5]：分离出的T细胞加入1%多聚甲醛，室温固定10 min后，PBS洗2遍。再加入0.1%Triton X-100作用5 min，以增加细胞膜的通透性，PBS洗2遍。用鼠抗人C—myc单抗(北京邦定公司产品)20μl置4°C 30 min, PBS洗2遍。之后加入羊抗鼠IgG-FTTC(荧光二抗)20 μ1 4℃ 30 min，PBS洗3遍。经30～40 μm尼龙网过滤后，置流式细胞仪(美国Coulter产品，机型为EPICSRXI)计数5×104细胞，在荧光直方图上计算C-myc阳性细胞百分率。每份标本均设阴性对照，即用正常大鼠血清取代第一抗体为阴性对照。
, 百拇医药
1.2.3 血浆ANA检测：采用间接免疫荧光法，试剂盒由上海华山医院提供，依照说明书操作。
1.3 统计方法：实验组和对照组C-myc阳性细胞百分率值经平方根反正弦转换后作方差分析；血浆ANA含量经对数转换后与C—myc阳性细胞百分率进行直线相关分析。
2 结果
2.1 流式细胞仪检测外周血T细胞C-myc阳性百分率：以T淋巴细胞染色阳性数表示C-myc蛋白表达的高低。见附图。
正常对照组为3.1%±1.1%，非活动期SLE组为12.5%±6.5%，活动期SLE组为21.08%±7.9%。结果表明，非活动期SLE患者T细胞C-myc蛋白表达显著高于正常人(P<0.01)，活动期高于非活动期(P<0.01)。
, 百拇医药
附图 正常人与SLE各期患者外周血T细胞C-myc蛋白表达
2.2 C-myc蛋白表达与ANA抗体之间的关系：血浆ANA含量的倒数的几何平均值及几何标准差，SLE患者非活动期为11.84±1.05，活动期为35.48±1.19；几何均数两者差异显著(P<0.01)，且与C-myc存在正相关关系，r为0.7668，P<0.01。
3 讨论
C-myc基因位于第8号染色体上，编码的蛋白位于细胞核内，是一种核蛋白，它能结合在特异的DNA序列上，调节基因的表达，参与细胞的生长、分化和增殖，还能刺激细胞发生凋亡。Kelly等[6]发现正常人T、B淋巴细胞在体外有丝分裂原的刺激下被激活的同时，参与细胞调节的C-myc蛋白表达增高，这说明C-myc表达在控制细胞周期中起重要作用。本研究发现，C-myc蛋白在正常人T细胞表达很低，而SLE患者T淋巴细胞C-myc蛋白表达明显增高，且活动期高于非活动期，这与国外报道[7]一致。由此说明，SLE患者体内T细胞是处于活化状态。这与本室近几年研究结果[3]一致。且Elias等[8]发现，SLE患者C-myc基因未发生结构改变，如突变或甲基化，但是SLE患者C-myc基因的转录率增高，降解率下降，从而导致SLE患者的淋巴细胞C-myc蛋白水平增高。因此在SLE患者中，某些致病因素可能使C-myc基因转录率增高，产生大量C-myc蛋白，C-myc蛋白结合到特定的DNA序列上，从而可能通过调控淋巴细胞，使之异常活化并产生大量自身抗体，引起多系统和器官受累，从而导致SLE的发生。
, 百拇医药
我们还将SLE患者血浆抗核抗体(ANA)含量经对数转换后与T淋巴细胞C-myc蛋白阳性百分率进行直线相关分析，结果发现两者呈正相关。Emlen等[9]发现，SLE患者淋巴细胞凋亡率增高，且认为SLE患者细胞凋亡过程中产生大量核小体成分，作为隐蔽抗原激发自身免疫反应，产生自身抗体如抗核抗体(ANA)等，形成免疫复合物而致病。由此说明SLE患者体内大量抗核抗体的来源。许多资料[10，11]发现，C-myc可启动凋亡程序，但bcl-2可抑制C-myc所导致的凋亡。SLE患者bcl-2表达降低[12]，对C-myc抑制作用减少。故考虑SLE患者T细胞C-myc异常高表达可能诱导淋巴细胞调亡增加，使自身抗体产生增加，因而导致SLE的发生。我们认为C—myc蛋白可能通过对细胞的异常活化和凋亡调控等多方面来参与SLE的免疫发病机制。
参考文献
1 Demmos MK,et al. Oncogene expression in autoimmune and normal peripheral blood mononuclear cells. J Exp Med, 1986, 163∶1292
, 百拇医药
2 Elefthriades EG, et al. Transcriptional and posttranscription responsible for the increased expression of C-myc protooncogene in lymphocytes from patients with systemic lupus erythematosus. Clin Immunol Innunolpathol, 1986, 52∶507
3 陈家福，等.SLE患者白介素6活性的研究.中华皮肤科杂志，1993，26∶32
4 张工梁，等.分离T、B淋巴细胞的简易方法.上海免疫学杂志，1986，6∶184
5 Shinya K, et al. Alterations of C-myc expression by antisense oligodeoxnucleotides enhance the induction of apoptosis in HL-60 cells. Cancer Res, 1995, 55∶1379
, http://www.100md.com
6 Kelly K, et al. Cell-specific regulation of the C-myc gene by lymphocyte mitogens and platelet-derived growth factor. Cell, 1983,35∶603
7 Boumpas DT, et al. Increased proto oncogene expression in peripheral blood lymphocyte from patients with systemic lupus erythematosus and autoimmune disease. Arthritis Rhem, 1986, 29∶755
8 Elias G, et al. Regulation of C-myc expression in patients with systemic lupus erythematosus. Clin Immuol Immnopathol, 1989, 52∶107
, 百拇医药
9 Emlen W, et al. Accelerated in vitro apoptosis of lymphocytes from patients with systemic lupus erythematosus. J Immunol, 1994, 152∶3685
10 William RC, et al. Oncogenes, viruses of rheumogenes. Am J Med. 1986, 80∶1011
11 Bissonette RP, et al. Apoptotic cell death induced by C—myc is inhibited by bcl-2. Nature, 1992, 359∶552
12 蒋 利，等.系统性红斑狼疮患者T淋巴细胞亚群Fas及bcl-2抗原的表达.中华皮肤科杂志， 1998，31∶4
(1998年12月30日收稿), http://www.100md.com