纤维蛋白原Iodogen法125I标记的研究
作者：高云朝 高保华 王浩丹
单位：高云朝 高保华(泰山医学院附属医院 泰安271000)；王浩丹(山东医科大学 济南250012)
关键词：纤维蛋白原；Iodogen；标记
标记免疫分析与临床000210 摘要 本文探讨了纤维蛋白原(FG)的Iodogen法125I标记技术。先用不同量的Iodogen作用于一定量的125I和FG，根据产物标记率和活性率， 选择Iodogen单次用量为FG的1%； 用此量再进行多步重复标记， 得出最佳重复次数为5次， 得产物标记率95.2%， 活性率87.4%。提示125I标记FG适合采用小剂量多步氧化标记法。
Study of125I Labeling Fibrinogen Using Iodogen Method
, 百拇医药
Gao Yunchao，Gao Baohua, Wang Haodan
(Affiliated Hospital of Taishan Medical College, Taian 271000)
(Shandong Medical University, Jinan 250012)
Abstract The article was to study 125I labeling fibrinogen(FG) using Iodogen method. First, different amount of Iodogen was used to act on certain 125I and FG, then the right amount of Iodogen in single labeling, equal to 1% of FG, was determined according to the labeling rate and activity rate of the products. Second, several repeating labeling was conducted using the same amount of Iodogen and 5 times of repeat was considered the best. The labeling rate of the products was 95.2%, activity rate was 87.4%, indicating that small dose of Iodogen and repeating labeling method is suitable for 125I labeling FG.
, 百拇医药
Key words Fibrinogen Iodogen Labeling
纤维蛋白原(Fibrinogen, FG)是重要的血浆蛋白， 常用125I标记FG, 125I-FG合成虽然简单， 但标记时所用氧化剂Iodogen易致产物失活， 即不能被凝血酶分解而形成125I-纤维蛋白凝胶产物。 为此本文探讨了用小剂量氧化剂的多步重复标记方法， 以获得产物较高的标记率和活性率。
材料与方法
1 试剂
FG、Iodogen、凝血酶： Sigma公司产品； Na125I： 中国同位素公司进口产品； Sephadex G-75: Pharmacia公司产品。
2 Iodogen涂管
, 百拇医药
用电子精密天平称取一定量Iodogen, 二氯甲烷溶解， 取玻璃试管，加入Iodogen: 5、1、0.5、0.2、0.1μg，各若干管， 体积均为200μL; 负压吹干， 密封冷冻保存备用。
3 碘化反应
3.1 选择Iodogen单次标记[1] 取上述不同装量Iodogen管各一只， 分别加入下列反应混合液： FG为20μg/10μL;Na125I为250μCi/10μL和PB为100μL。反应时间为20分钟[2]，反应期间轻轻摇动试管。 反应毕， 各加PB 150μL， 混匀， 静置10分钟。每管加100μL 10%BSA(含溴酚兰一滴)， 分别用Sephadex G-75柱层析分离纯化， 洗脱液用自动部分收集器收集， 滴速为1mL/3min/管。 取每管洗脱液各10μL,用r-计数器计录10秒钟计数， 在普通坐标纸上画出出现双峰曲线： 蛋白峰和游离碘峰， 收集蛋白峰， 取适量用生理盐水稀释， 进行产物鉴定。
, 百拇医药
3.2 产物鉴定 有关产物鉴定方法见表1。
表1 鉴定方法操作步骤
标记率计数
活性率计算
标记产物
100μL
100μL
0.2%FG
200μL
200μL
20%TCA
100μL
, 百拇医药
-
凝血酶
-
1U
于37℃温育40分钟， 测总放射性计数(Tcpm)
3500r/min
轻轻摇动
离心10min
凝胶析出附壁
弃上清
弃液相
测沉淀放射性
, 百拇医药 计数(R cpm)
洗涤三遍
测凝胶放射性
计数(R cpm)
标记率和活性率计算： (R-本底)/(T-本底)
3.3 Iodogen多次标记 根据Iodogen单次标记结果， 选择0.2μg Iodogen管进行多管重复标记， 即反应混合液在第1管反应20分钟后， 导入第2个Iodogen管， 再反应20分钟， 以此类推， 重复管数为4～7管， 产物纯化和鉴定同前。
4 统计学处理
结果用均值±标准差(
±s)表示， 各组均值差异性比较用方差分析和q检验。结 果
, 百拇医药
(1)Iodogen不同用量的单次标记结果列于表2， 由表可见Iodogen单次用量为0.2μg时， 其产物活性率最高。
表2 Iodogen不同用量单次标记产物鉴定结果(±s) Iodogen
(μg)
Iodogen/FG
(%)
标记率
(%)
活性率
(%)
5
, 百拇医药
25
85.3±6.9
5.7±2.6
1
5
76.1±7.7
9.2±3.1
0.5
2.5
45.4±5.8
13.0±4.4
0.2
1
, http://www.100md.com
25.0±3.2
22.6±4.5
0.1
0.5
8.2±2.4
7.1±3.2
注： 各组标记率均值之间和活性率均值之间比较， P<0.05
(2)选择0.2μg的Iodogen管进行多管重复标记， 结果列于表3。 结果提示： 0.2μg的Iodogen重复标记5次可获得较高标记率和活性率的产物。
表3 多管重复标记产物鉴定结果 组别
重复次数
, http://www.100md.com
(管数)
标记率
(%)
活性率
(%)
1
4
86.7±7.6
72.1±6.8
2
5
95.2±8.1
87.4±5.6
, 百拇医药
3
6
97.3±7.8
88.8±7.9
4
7
96.8±6.6
85.2±7.8
注： 各组标记率之间和活性率之间比较： 1组与其他三组比较， P<0.05;三组之间比较， P>0.05讨论
FG分子量为34万， 由2874个氨基酸组成， 其中含有大量的酪氨酸残基， 125I容易标记到FG结构上[3]，但FG易被Iodogen氧化而失活， 即凝血酶不能使其转化为125I-纤维蛋白而胶联成凝块析出， 因此为获得较高标记率和活性率的标记产物。 本文采用不同小剂量的Iodogen, 减弱其对FG的氧化作用， 同时采用多步重复氧化标记， 使标记时间得以延长， 条件温和。 实验表明， 单次标记Iodogen用量较高时， 虽然标记率较高，但产物活性较低；用量太低时， 虽然有利于保持活性， 但由于标记率太低(P<0.05)，也不实用， 而以选择0.2μg为佳， 该量相当于FG用量的1%；用此量重复标记时， 重复次数超过5次，并未使标记率和活性率有意义地升高(P>0.05),因此选择5次为好。参考文献
, http://www.100md.com
1，叶维新， 陈杞，李延龄等.实验核医学技术.第1版.长春： 吉林科学技术出版社，1991：40～42
2，Nieuwenhuizen W et al. Studies on the catabolism and distribution of fibrinogen in rats-application of the Iodogen labeling technique. Biochem Bioph Res Comm, 1980;97(1):49
3，仝健等.明胶微球控释示踪研究.同位素， 1998；(3)：168
(1999-07-31收稿), http://www.100md.com
单位：高云朝 高保华(泰山医学院附属医院 泰安271000)；王浩丹(山东医科大学 济南250012)
关键词：纤维蛋白原；Iodogen；标记
标记免疫分析与临床000210 摘要 本文探讨了纤维蛋白原(FG)的Iodogen法125I标记技术。先用不同量的Iodogen作用于一定量的125I和FG，根据产物标记率和活性率， 选择Iodogen单次用量为FG的1%； 用此量再进行多步重复标记， 得出最佳重复次数为5次， 得产物标记率95.2%， 活性率87.4%。提示125I标记FG适合采用小剂量多步氧化标记法。
Study of125I Labeling Fibrinogen Using Iodogen Method
, 百拇医药
Gao Yunchao，Gao Baohua, Wang Haodan
(Affiliated Hospital of Taishan Medical College, Taian 271000)
(Shandong Medical University, Jinan 250012)
Abstract The article was to study 125I labeling fibrinogen(FG) using Iodogen method. First, different amount of Iodogen was used to act on certain 125I and FG, then the right amount of Iodogen in single labeling, equal to 1% of FG, was determined according to the labeling rate and activity rate of the products. Second, several repeating labeling was conducted using the same amount of Iodogen and 5 times of repeat was considered the best. The labeling rate of the products was 95.2%, activity rate was 87.4%, indicating that small dose of Iodogen and repeating labeling method is suitable for 125I labeling FG.
, 百拇医药
Key words Fibrinogen Iodogen Labeling
纤维蛋白原(Fibrinogen, FG)是重要的血浆蛋白， 常用125I标记FG, 125I-FG合成虽然简单， 但标记时所用氧化剂Iodogen易致产物失活， 即不能被凝血酶分解而形成125I-纤维蛋白凝胶产物。 为此本文探讨了用小剂量氧化剂的多步重复标记方法， 以获得产物较高的标记率和活性率。
材料与方法
1 试剂
FG、Iodogen、凝血酶： Sigma公司产品； Na125I： 中国同位素公司进口产品； Sephadex G-75: Pharmacia公司产品。
2 Iodogen涂管
, 百拇医药
用电子精密天平称取一定量Iodogen, 二氯甲烷溶解， 取玻璃试管，加入Iodogen: 5、1、0.5、0.2、0.1μg，各若干管， 体积均为200μL; 负压吹干， 密封冷冻保存备用。
3 碘化反应
3.1 选择Iodogen单次标记[1] 取上述不同装量Iodogen管各一只， 分别加入下列反应混合液： FG为20μg/10μL;Na125I为250μCi/10μL和PB为100μL。反应时间为20分钟[2]，反应期间轻轻摇动试管。 反应毕， 各加PB 150μL， 混匀， 静置10分钟。每管加100μL 10%BSA(含溴酚兰一滴)， 分别用Sephadex G-75柱层析分离纯化， 洗脱液用自动部分收集器收集， 滴速为1mL/3min/管。 取每管洗脱液各10μL,用r-计数器计录10秒钟计数， 在普通坐标纸上画出出现双峰曲线： 蛋白峰和游离碘峰， 收集蛋白峰， 取适量用生理盐水稀释， 进行产物鉴定。
, 百拇医药
3.2 产物鉴定 有关产物鉴定方法见表1。
表1 鉴定方法操作步骤
标记率计数
活性率计算
标记产物
100μL
100μL
0.2%FG
200μL
200μL
20%TCA
100μL
, 百拇医药
-
凝血酶
-
1U
于37℃温育40分钟， 测总放射性计数(Tcpm)
3500r/min
轻轻摇动
离心10min
凝胶析出附壁
弃上清
弃液相
测沉淀放射性
, 百拇医药 计数(R cpm)
洗涤三遍
测凝胶放射性
计数(R cpm)
标记率和活性率计算： (R-本底)/(T-本底)
3.3 Iodogen多次标记 根据Iodogen单次标记结果， 选择0.2μg Iodogen管进行多管重复标记， 即反应混合液在第1管反应20分钟后， 导入第2个Iodogen管， 再反应20分钟， 以此类推， 重复管数为4～7管， 产物纯化和鉴定同前。
4 统计学处理
结果用均值±标准差(
±s)表示， 各组均值差异性比较用方差分析和q检验。结 果, 百拇医药
(1)Iodogen不同用量的单次标记结果列于表2， 由表可见Iodogen单次用量为0.2μg时， 其产物活性率最高。
表2 Iodogen不同用量单次标记产物鉴定结果(
±s) Iodogen(μg)
Iodogen/FG
(%)
标记率
(%)
活性率
(%)
5
, 百拇医药
25
85.3±6.9
5.7±2.6
1
5
76.1±7.7
9.2±3.1
0.5
2.5
45.4±5.8
13.0±4.4
0.2
1
, http://www.100md.com
25.0±3.2
22.6±4.5
0.1
0.5
8.2±2.4
7.1±3.2
注： 各组标记率均值之间和活性率均值之间比较， P<0.05
(2)选择0.2μg的Iodogen管进行多管重复标记， 结果列于表3。 结果提示： 0.2μg的Iodogen重复标记5次可获得较高标记率和活性率的产物。
表3 多管重复标记产物鉴定结果 组别
重复次数
, http://www.100md.com
(管数)
标记率
(%)
活性率
(%)
1
4
86.7±7.6
72.1±6.8
2
5
95.2±8.1
87.4±5.6
, 百拇医药
3
6
97.3±7.8
88.8±7.9
4
7
96.8±6.6
85.2±7.8
注： 各组标记率之间和活性率之间比较： 1组与其他三组比较， P<0.05;三组之间比较， P>0.05讨论
FG分子量为34万， 由2874个氨基酸组成， 其中含有大量的酪氨酸残基， 125I容易标记到FG结构上[3]，但FG易被Iodogen氧化而失活， 即凝血酶不能使其转化为125I-纤维蛋白而胶联成凝块析出， 因此为获得较高标记率和活性率的标记产物。 本文采用不同小剂量的Iodogen, 减弱其对FG的氧化作用， 同时采用多步重复氧化标记， 使标记时间得以延长， 条件温和。 实验表明， 单次标记Iodogen用量较高时， 虽然标记率较高，但产物活性较低；用量太低时， 虽然有利于保持活性， 但由于标记率太低(P<0.05)，也不实用， 而以选择0.2μg为佳， 该量相当于FG用量的1%；用此量重复标记时， 重复次数超过5次，并未使标记率和活性率有意义地升高(P>0.05),因此选择5次为好。参考文献
, http://www.100md.com
1，叶维新， 陈杞，李延龄等.实验核医学技术.第1版.长春： 吉林科学技术出版社，1991：40～42
2，Nieuwenhuizen W et al. Studies on the catabolism and distribution of fibrinogen in rats-application of the Iodogen labeling technique. Biochem Bioph Res Comm, 1980;97(1):49
3，仝健等.明胶微球控释示踪研究.同位素， 1998；(3)：168
(1999-07-31收稿), http://www.100md.com