汉滩病毒感染神经元内原癌基因FOS的表达
作者：王航雁 张梦华 汪毅 杨为松
单位：100853 北京，解放军总医院(王航雁)；第四军医大学唐都感染病医院(张梦华、汪毅、杨为松)
关键词：
中华传染病杂志980319附表 FOS在各实验组神经细胞内的表达 时间
感染组
对照组
P值
总数
阳性数
(%)
总数
, http://www.100md.com
阳性数
(%)
即刻
228
114
50.00
258
96
36.05
<0.01
1小时
287
149
, 百拇医药
51.92
297
105
35.35
<0.01
2小时
116
130
78.31
294
97
32.99
<0.001
, http://www.100md.com
3小时
255
154
60.39
280
82
29.29
<0.001
4小时
225
109
48.44
301
, 百拇医药
90
29.90
<0.001
5小时
342
130
38.01
229
73
31.88
>0.05
6小时
262
, 百拇医药
84
32.06
300
91
30.33
>0.05
7小时
218
68
31.19
234
68
29.06
, 百拇医药
>0.05
8小时
244
77
31.55
318
88
27.67
>0.05
A组与B组比较：病毒感染即刻：P<0.01；2小时，3小时，4小时：P<0.001
肾综合征出血热(HFRS)伴发的脑损伤是其严重的并发症之一[1]，本实验利用体外培养的昆明种小鼠胚胎脑皮质神经元为模型，在感染汉滩病毒后，观察神经元内原癌基因磷酸蛋白(FOS)的表达变化，以探讨HFRS脑损伤的发生机制。材料与方法
, 百拇医药
一、实验动物
孕16～19天昆明种小鼠，第四军医大学实验动物中心提供。
二、试剂
(一)细胞培养液 DMEM液(Sigma公司美国)，胎牛血清(Sigma)、D液、0.125%胰酶均为自配。
(二)免疫组化试剂 FOS抗体(rat北京中山生物技术有限公司分装)，Ⅱ抗(rabbit Sigma)，ABC复合物(Sigma),DAB,4%多聚甲醛均为国产。
(三)病毒 A9株汉滩病毒(Hantann Virus HTNV)感染乳鼠脑研磨液(1只乳鼠脑加10ml细胞培养液)经2 500r/min离心沉淀，吸取上清液，为感染病毒；其上清液经56℃，30分钟灭活后用于做阴性对照。
三、实验方法
, 百拇医药
(一)细胞培养 小鼠拉颈处死后，无菌条件下取出双侧子宫置冰盒上，解剖显微镜下剥离胚胎鼠脑皮质，置D液中，剪碎脑皮质，加入0.125%胰酶消化30分钟(37℃)，加入含20%胎牛血清的DMEM培养液，终止10分钟(室温)，DMEM培养液洗一次，在含20%胎牛血清的DMEM培养液中将消化的组织吹成细胞悬液，血球计数板计数后，将细胞浓度调至2.5×105/ml。37℃，5%CO2温箱温育24小时后，每孔加入10μl阿糖胞苷(10mmol/L)，作用24小时，更换新的培养液，此后每隔2日换含10%马血清的DMEM培养液。将培养板随机分成三组：感染组(A)，阴性对照组(B)，正常组(C)。
(二)细胞模型的建立
1.感染组(A)：神经元在培养一周后，用汉滩病毒(A9株)上清液(1∶100)，每孔20μl，感染4小时后换正常培养液，随机将样本分为9组，每组10孔，分别于感染后即刻、1小时、2小时、3小时……8小时处理样本。
, 百拇医药
2.阴性对照组(B)：神经细胞培养一周后，用经灭活的汉滩病毒(A9株)上清液(1∶100)每孔20μl,4小时后换正常液。其余步骤同感染组。
3.正常组：神经细胞培养一周后，与模型组同步随机观察10孔，处理、固定、染色等步骤同A、B组。
4.免疫组化染色：吸去培养液，0.01mol/L PBS洗一次，各孔加入4%多聚甲醛，4℃固定1小时，PBS洗三次，每次5分钟，常规ABC免疫组化染FOS抗血清(1∶500)，温育48小时(4℃)，0.01mol/L PBS洗三次，每次10分钟。入二抗(1∶500)，2小时(室温)。DAB呈色。
5.观察计数和统计学处理：用OLYMPUS倒置相差显微镜(日本产)分别在每孔随机一视野内计数，统计各组10孔神经元总数及FOS染色阳性数，所得数据进行χ2检验。
, 百拇医药 结 果
一、细胞生长及形态学观察
胚胎小鼠神经细胞培养一周，神经突起清晰可见，相互交织成网状，胞体折光性强，感染组(A)、阴性对照组(B)神经元与正常组形态外观大体无差别，经ABC组化FOS抗血清染色，阳性细胞核呈紫蓝色。
二、FOS在各实验组神经细胞内的表达
见附表。A组与B组相比，A组FOS阳性神经元在感染后即刻有差异(P<0.01)、2小时、3小时、4小时数量增多(P<0.001)。差异有显著性，4小时后差异无显著性。
讨 论
原癌基因(Proto-oncogene)广泛存在于真核细胞基因组内，绝大多数正常细胞都有低水平表达[2]。其表达产物是细胞核的磷酸蛋白(FOS)。该物质不仅参与细胞的正常生长、分化过程，也参与调节细胞内的信息传递过程。研究证实，FOS可能是神经元被刺激激活的一种标志[3]，用来分析中枢神经系统的单个神经元在受到不同的外周伤害性刺激后的活动变化。刺激因素有多种，包括各种伤害性的机械性，化学性及生物性因素等，这些因素都可以导致培养的神经元内FOS的一过性表达[4]。其表达的数量和时程因刺激强度、时间及其性质而各不相同[5]。
, 百拇医药
本研究应用HTNV(以及灭活的HTNV)作用于培养的神经元，结果显示：正常组有少量的表达，对照组略高于正常组(P>0.05)。HTNV感染组表达明显增高，且呈时间依赖关系，培养神经元在感染HTNV后即刻、1小时、2小时、3小时、4小时FOS表达明显增高，与对照组比较存在显著性差异。另外，我们还观察到神经元感染HTNV后第二时间相FOS的表达水平升高较慢，在2～4小时迅速升高的现象，认为可能是中断病毒感染，神经元适应性活动相对减慢的一种反映，其确切机制有待进一步探讨。
本研究结果提示：HTNV作为病理性刺激因素可以激活培养的胚胎小鼠皮质神经元，使其FOS产生快速、一过性表达增高。诱导的FOS转录mRNA，使mRNA在胞浆中翻译、合成FOS蛋白，与c-jun在核内形成复合物，并与目的基因结合，进一步激活目的基因的表达，最终对刺激作出反应，在神经元损伤中具有一定意义。
参考文献
1 刘俊彬.流行性出血热.见：李梦东，主编.实用传染病学.北京：人民卫生出版社，1994.156-170.
, 百拇医药
2 Walther D,Takemura M,Uhl G.Fos family member changes in nucleus caudalis neurons after primary efferent stimulation:enhancement of fos B and FOS.Mol Brain Res,1993,17:155-159.
3 Dragunow M,Faull R.The use of FOS as a metabolic marker in neuronal pathway tracing.J Neurosci Methods,1989,29:261-285.
4 方向义，胡海涛.中枢神经系统FOS蛋白的表达与外周伤害性刺激.神经解剖学杂志，1996，12：281-283.
5 Osamu T,Hidekazu T,Takehiko Y.Induction of FOS and c-jun dene products and heat Shock protein after brief and prolonged cerebral ischemia in gerbils.Stroke,1995,26:1639-1648., 百拇医药
单位：100853 北京，解放军总医院(王航雁)；第四军医大学唐都感染病医院(张梦华、汪毅、杨为松)
关键词：
中华传染病杂志980319附表 FOS在各实验组神经细胞内的表达 时间
感染组
对照组
P值
总数
阳性数
(%)
总数
, http://www.100md.com
阳性数
(%)
即刻
228
114
50.00
258
96
36.05
<0.01
1小时
287
149
, 百拇医药
51.92
297
105
35.35
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2小时
116
130
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294
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, http://www.100md.com
3小时
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29.29
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, 百拇医药
90
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, 百拇医药
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31.55
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27.67
>0.05
A组与B组比较：病毒感染即刻：P<0.01；2小时，3小时，4小时：P<0.001
肾综合征出血热(HFRS)伴发的脑损伤是其严重的并发症之一[1]，本实验利用体外培养的昆明种小鼠胚胎脑皮质神经元为模型，在感染汉滩病毒后，观察神经元内原癌基因磷酸蛋白(FOS)的表达变化，以探讨HFRS脑损伤的发生机制。材料与方法
, 百拇医药
一、实验动物
孕16～19天昆明种小鼠，第四军医大学实验动物中心提供。
二、试剂
(一)细胞培养液 DMEM液(Sigma公司美国)，胎牛血清(Sigma)、D液、0.125%胰酶均为自配。
(二)免疫组化试剂 FOS抗体(rat北京中山生物技术有限公司分装)，Ⅱ抗(rabbit Sigma)，ABC复合物(Sigma),DAB,4%多聚甲醛均为国产。
(三)病毒 A9株汉滩病毒(Hantann Virus HTNV)感染乳鼠脑研磨液(1只乳鼠脑加10ml细胞培养液)经2 500r/min离心沉淀，吸取上清液，为感染病毒；其上清液经56℃，30分钟灭活后用于做阴性对照。
三、实验方法
, 百拇医药
(一)细胞培养 小鼠拉颈处死后，无菌条件下取出双侧子宫置冰盒上，解剖显微镜下剥离胚胎鼠脑皮质，置D液中，剪碎脑皮质，加入0.125%胰酶消化30分钟(37℃)，加入含20%胎牛血清的DMEM培养液，终止10分钟(室温)，DMEM培养液洗一次，在含20%胎牛血清的DMEM培养液中将消化的组织吹成细胞悬液，血球计数板计数后，将细胞浓度调至2.5×105/ml。37℃，5%CO2温箱温育24小时后，每孔加入10μl阿糖胞苷(10mmol/L)，作用24小时，更换新的培养液，此后每隔2日换含10%马血清的DMEM培养液。将培养板随机分成三组：感染组(A)，阴性对照组(B)，正常组(C)。
(二)细胞模型的建立
1.感染组(A)：神经元在培养一周后，用汉滩病毒(A9株)上清液(1∶100)，每孔20μl，感染4小时后换正常培养液，随机将样本分为9组，每组10孔，分别于感染后即刻、1小时、2小时、3小时……8小时处理样本。
, 百拇医药
2.阴性对照组(B)：神经细胞培养一周后，用经灭活的汉滩病毒(A9株)上清液(1∶100)每孔20μl,4小时后换正常液。其余步骤同感染组。
3.正常组：神经细胞培养一周后，与模型组同步随机观察10孔，处理、固定、染色等步骤同A、B组。
4.免疫组化染色：吸去培养液，0.01mol/L PBS洗一次，各孔加入4%多聚甲醛，4℃固定1小时，PBS洗三次，每次5分钟，常规ABC免疫组化染FOS抗血清(1∶500)，温育48小时(4℃)，0.01mol/L PBS洗三次，每次10分钟。入二抗(1∶500)，2小时(室温)。DAB呈色。
5.观察计数和统计学处理：用OLYMPUS倒置相差显微镜(日本产)分别在每孔随机一视野内计数，统计各组10孔神经元总数及FOS染色阳性数，所得数据进行χ2检验。
, 百拇医药 结 果
一、细胞生长及形态学观察
胚胎小鼠神经细胞培养一周，神经突起清晰可见，相互交织成网状，胞体折光性强，感染组(A)、阴性对照组(B)神经元与正常组形态外观大体无差别，经ABC组化FOS抗血清染色，阳性细胞核呈紫蓝色。
二、FOS在各实验组神经细胞内的表达
见附表。A组与B组相比，A组FOS阳性神经元在感染后即刻有差异(P<0.01)、2小时、3小时、4小时数量增多(P<0.001)。差异有显著性，4小时后差异无显著性。
讨 论
原癌基因(Proto-oncogene)广泛存在于真核细胞基因组内，绝大多数正常细胞都有低水平表达[2]。其表达产物是细胞核的磷酸蛋白(FOS)。该物质不仅参与细胞的正常生长、分化过程，也参与调节细胞内的信息传递过程。研究证实，FOS可能是神经元被刺激激活的一种标志[3]，用来分析中枢神经系统的单个神经元在受到不同的外周伤害性刺激后的活动变化。刺激因素有多种，包括各种伤害性的机械性，化学性及生物性因素等，这些因素都可以导致培养的神经元内FOS的一过性表达[4]。其表达的数量和时程因刺激强度、时间及其性质而各不相同[5]。
, 百拇医药
本研究应用HTNV(以及灭活的HTNV)作用于培养的神经元，结果显示：正常组有少量的表达，对照组略高于正常组(P>0.05)。HTNV感染组表达明显增高，且呈时间依赖关系，培养神经元在感染HTNV后即刻、1小时、2小时、3小时、4小时FOS表达明显增高，与对照组比较存在显著性差异。另外，我们还观察到神经元感染HTNV后第二时间相FOS的表达水平升高较慢，在2～4小时迅速升高的现象，认为可能是中断病毒感染，神经元适应性活动相对减慢的一种反映，其确切机制有待进一步探讨。
本研究结果提示：HTNV作为病理性刺激因素可以激活培养的胚胎小鼠皮质神经元，使其FOS产生快速、一过性表达增高。诱导的FOS转录mRNA，使mRNA在胞浆中翻译、合成FOS蛋白，与c-jun在核内形成复合物，并与目的基因结合，进一步激活目的基因的表达，最终对刺激作出反应，在神经元损伤中具有一定意义。
参考文献
1 刘俊彬.流行性出血热.见：李梦东，主编.实用传染病学.北京：人民卫生出版社，1994.156-170.
, 百拇医药
2 Walther D,Takemura M,Uhl G.Fos family member changes in nucleus caudalis neurons after primary efferent stimulation:enhancement of fos B and FOS.Mol Brain Res,1993,17:155-159.
3 Dragunow M,Faull R.The use of FOS as a metabolic marker in neuronal pathway tracing.J Neurosci Methods,1989,29:261-285.
4 方向义，胡海涛.中枢神经系统FOS蛋白的表达与外周伤害性刺激.神经解剖学杂志，1996，12：281-283.
5 Osamu T,Hidekazu T,Takehiko Y.Induction of FOS and c-jun dene products and heat Shock protein after brief and prolonged cerebral ischemia in gerbils.Stroke,1995,26:1639-1648., 百拇医药