汉滩病毒S基因全长和截短片段在大肠杆菌中表达及其初步应用
作者：王长军 唐家琪 操敏 李光富 潘秀珍 李先富
单位：210002 南京军区军事医学研究所
关键词：汉滩病毒属；重组核蛋白；免疫印迹试验；间接酶联免疫吸附试验
中华传染病杂志990310 【摘要】 目的 体外克隆表达汉滩病毒全长及部分核蛋白编码基因，筛选病毒核蛋白在人体体液应答中的主要抗原决定簇区，以期获得高质量核蛋白抗原，为研制新型肾综合征出血热(HFRS)基因工程诊断试剂奠定基础。方法 利用聚合酶链反应(PCR)和限制性内切酶酶切的方法分离汉滩病毒76-118 S基因全长及部分氨基端编码基因(S、SA、SB、SC和SD)，分别将各编码基因克隆入T7原核表达载体，在大肠杆菌中表达；免疫印迹试验(Western-blot analysis)分析重组抗原活性。结果 完整和截短核蛋白皆得到有效表达，相对分子质量分别为50000(recombinant S protein,rS)、4500(rSA)、22000(rSB)、25000(rSC)和27000(rSD)，Western-blot分析表明截短核蛋白(rSB、rSC和rSD)具有较好的抗原活性；粗提抗原Dot-blot方法检测HFRS患者血清结果与IFA法一致；重组小片段抗原与抗汉滩病毒单克隆抗体5H5及H7可发生特异性反应。结论 汉滩病毒核蛋白的氨基端含有一主要抗原决定簇区；原核表达的截短核蛋白在HFRS的血清学诊断中具有一定的价值。
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Expression of the entire and truncated S genome segment of Hantaan virus in E.coli and preliminary use of the recombinant proteins
WANG Changjun,TANG Jiaqi,CAO Min,et al.
Institute of Military Medicine,Nanjing Command,Nanjing 210002
【Abstract】 Objective In order to obtain a major antigenic domain from Hantaan virus nucleocapsid protein,which accounts for the human humoral response and can be used to develop the new genetic engineering diagnostic reagents,the entire and several truncated coding regions of the small (S) genome segment of Hantaan virus was constructed and expressed in E.coli.Methods Fragments of entire and truncated conservative genes (S,SA,SB,SC and SD) were cloned into poly-histidine fusion protein expression vector pET-28c by PCR and restriction digest methods,and the immunogenecity of recombinant proteins were examined by immunoblots and ELISA with polyclonal and monoclonal antibodies.Results The molecular weights of S,SA,SB,SC and SD proteins were 50000,4500,22000,25000 and 27000 dalton respectively.Western-blot analysis demonstrated that recombinant SB,SC and SD proteins presented the specific antigenicity and S protein could be used for the detection of the specific IgG and IgM in the serum of patients by Dot-ELISA after purification.The specificity and stability of the test was equal to IFA.Conclusion A dominating antigenic region located at the amino-terminus of Hantaan virus nucleocapsid protein.These recombinant truncated proteins can be used to diagnose the infection of HFRSV serologically.
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【Key words】 Hantaan virus Recombinant nucleocapsid protein Western-blot Indirect enzyme linked immunoabsorbent assay
汉坦病毒为布尼亚病毒科成员，其基因组由L、M、S三节段组成，为负链RNA病毒。该病毒可引起肾综合征出血热(HFRS)、汉坦病毒肺综合征(HPS)[1]等传染病。HFRS在我国流行广泛，目前尚无特效治疗药物，由于早发现、早诊断和早治疗对患者预后影响很大，因此建立可靠的早期快速诊断方法对其防治具有重要意义。本研究根据流行于我国的两型病毒(汉滩型和汉城型)代表株的核苷酸序列，氨基酸同源性及多肽亲水性[2]分析结果，结合S片段特定的内切酶位点，运用聚合酶链反应(PCR)扩增和酶切方法分离出汉滩病毒76-118株S片段cDNA完整编码区和部分氨基端核苷酸片段，分别将其克隆入新型T7启动子原核高效表达载体，获得不同大小的重组核蛋白抗原表达，并对其抗原性进行初步分析。
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材料与方法
一、菌株和质粒
表达型大肠杆菌BL-21(DE3)PLysS购自美国Promega公司；用于基因克隆的大肠杆菌DH5α购自Pharmacia公司；表达载体pET-28c由本所朱进助理研究员赠送；含汉滩病毒76-118 S片段cDNA质粒由中国预防医学科学院病毒学研究所杭长寿研究员惠赠。
二、试剂
PCR扩增反应试剂盒购自上海生物工程公司；T4 DNA连接酶、限制性核酸内切酶购自GIBCO BRL公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、苯甲磺酰氯(PMSF)和溶菌酶为Promega公司产品；辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG、IgM抗体，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG抗体和酶标SPA均购自上海生物制品研究所；所用配制各种液体的化学试剂均为分析纯或分子生物学纯级。
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三、血清标本和抗-肾综合征出血热病毒(抗-HFRSV)单克隆抗体(McAb)
安徽疫区HFRS患者早期血清和乙型肝炎(乙肝)、丙型肝炎(丙肝)患者阳性血清由南京军区总医院提供。HFRS轻型、中型患者血清各3份，重型2份(患者临床分型、分期标准按《流行性出血热防治方案》)，共计8份；乙肝、丙肝阳性血清各2份，健康人血清3份，购自南京市红十字血液中心。抗-HFRSV鼠源McAb 5H5、3A9、1B3由第四军医大学徐志凯教授赠送，McAb F3、H7为本室用陈株免疫制备[3]。
四、引物设计与合成
根据汉滩病毒76-118 S片段核苷酸序列设计四条引物：P1 5′-ATGCATGCGGCCGCTACCA-TGGCAACTATGGAGG-3′，含Nco Ⅰ酶切位点；P2 5′-GATCGTCGACTTAGATCTAGAGTTTCA-AAGGCTC-3′，含Sal Ⅰ和Bgl Ⅱ酶切位点；P3 5′-TATGAGCTCGCATATGGCAACTATGGAGGAA-3′，含Nde Ⅰ酶切位点；P4 5′-TTGTCGACTCTT-CTGCCTTCATGCT-3′，含Sal Ⅰ酶切位点。以上引物均由上海生工生物工程公司协助合成和纯化。
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五、部分S基因片段重组体设计构建
应用限制性内切酶和PCR扩增方法制备不同大小的截短S基因片段SA、SB、SC、SD(见表1)。载体及基因片段的酶切、回收按常规方法[4]进行。连接反应体系中含酶切目的片段200ng，酶切脱“P”表达载体100ng，T4 DNA连接酶2U，共计20μl，14℃作用16小时。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，常规铺板培养。挑取单个菌落扩增培养，抽提质粒，用限制性内切酶酶切和PCR鉴定重组体。
表1 汉滩病毒76-118株S片段全长和部分编码基因重组体设计构建 编号
基因长度
(bp)
序列位置
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克隆粘性末端
编码氨基酸
(aa)
S
1287
37～1324
NcoⅠ/SalⅠ
429
SA
104
37～141
NdeⅠ/BamHⅠ
35
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SB
585
37～612
NdeⅠ/SalⅠ
195
SC
649
37～686
NcoⅠ/BclⅠ
216
SD
737
37～774
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NcoⅠ/HindⅢ
246
注：pET-28c表达载体多克隆酶切位点顺序：NcoⅠ、NdeⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、HindⅢ、NotⅠ;SA、SC、SD通过酶切分离；汉滩病毒76-118 S基因141位、686位、774位分别含BamHⅠ 、BclⅠ(其粘性末端与BamHⅠ粘性末端匹配)、HindⅢ位点
六、PCR
引物P1和P2用于扩增S片段完整编码区基因(下称S)，引物P3和P4用于扩增570bp部分氨基端基因片段(下称SB)。PCR体系为100μl，含引物各40pmol/L,dNTPs 0.15mmol/L,MgCl2 1.5mmol/L，模板10ng，混匀后覆盖适量石蜡油，95℃变性5分钟，加入2.5U Taq DNA聚合酶，进行扩增。条件为：95℃ 30秒，57℃ 1.5分钟，72℃ 1.5分钟，共30个循环，末次循环后72℃延伸10分钟。产物用1.2%琼脂糖电泳鉴定。
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七、诱导表达
阳性重组质粒转化感受态大肠杆菌BL-21(DE3)PlysS，从平皿上随机挑取单个转化菌，重复接种于2块新平皿上，其中1块加1mmol/L IPTG,37℃培养4～6小时，找出在IPTG平板上不生长，而在另1块平皿上生长良好的克隆，接种于LBK(含卡那霉素50μg/ml)培养液5ml中，37℃培养过夜，次日取培养物按1∶100比例种于新鲜LBK培养液中，37℃振荡培养至A600约0.9，加IPTG至1mmol/L，37℃诱导培养3～6小时，收集菌体。
八、表达蛋白的初步纯化
用裂解液(50mmol/L Tris-Cl pH8.0,0.1mol/L EDTA,100mmol/L NaCl)3ml悬浮菌体，加适量PMSF和溶菌酶，冰浴搅拌20分钟。加去氧胆酸4mg、DNA酶Ⅰ(Pharmacia 10U/μl)20μl，37℃作用30分钟。4℃ 13 000r/min离心15分钟，沉淀悬于9倍体积的含5% Triton X-100和10mmol/L EDTA(pH8.0)的缓冲液中洗5分钟，4℃ 13 000r/min离心15分钟，沉淀用含0.1 mmol/L PMSF(临用现加)、6mol/L去离子尿素的裂解缓冲液溶解，室温放置1小时。4℃ 13 000r/min离心20分钟，收集上清用于活性检测。
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九、Western-blot分析
裂解菌体或粗提产物经12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，采用半干转印法[5]将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用封闭液(含5%脱脂奶粉的PBS液)作用1.5小时，再加用1∶200封闭液稀释的患者血清或加用封闭液1∶500稀释的混和抗HFRSV单克隆抗体，作用2小时。充分洗涤，加用封闭液作1∶150稀释的辣根过氧化物酶标记的SPA或兔抗鼠IgG抗体，作用1小时。充分洗涤，加新鲜配制的DAB显色液(5mg DAB溶于10ml 50mmol/L Tris-Cl pH7.6，50mmol/L NaCl中，过滤去沉淀，加30% H2O215μl)，避光显色2～8分钟。以上反应均在室温进行。
十、用粗制抗原作Dot-ELISA检测患者血清和McAb
将10倍系列稀释的粗制抗原5μl滴加于硝酸纤维素膜上(以未转化的菌体裂解物作为阴性对照)，晾干后用PBS封闭液作用2小时，以下步骤同Western-blot[4]。
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结 果
一、完整和截短的核蛋白编码基因片段的克隆和鉴定
PCR产物经凝胶电泳后可见约1.3kb的完整编码区S基因和约0.58kb的截短SB基因片段；通过单酶切或多酶切SB和S基因，又得到104bp的SA、649bp的SC和737bp的SD 3段截短的基因片段(图1)。用低溶点琼脂糖回收上述基因片段，与酶切位点匹配的酶切表达载体连接并转化感受态大肠杆菌DH5α，用酶切和PCR方法鉴定证明获得了不同S基因片段的重组克隆。
1、7、9：100bp DNA ladder,2:SA基因，3：PCR Marker,4:SB基因，5：SC基因，6：S基因，8：SD基因
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图1 汉滩病毒76-118株S片段全长和截短基因电泳结果
二、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western-blot分析结果
重组体经IPTG诱导后，汉滩病毒S基因全长和部分基因片段皆得到了有效表达。截短基因片段表达效率高于全长基因，重组体经IPTG平皿筛选T7Promoter后产量均有所提高。表达蛋白相对分子质量依次约为50000(recombinant S protein,rS)、4500(rSA)、22000(rSB)、25000(rSC)、27 000(rSD)，重组蛋白在菌体中主要以包涵体形式存在，在6mol/L尿素中完全溶解。免疫转印结果显示rS及rSD、rSC、rSB重组核蛋白具有特异性抗原活性，能与抗血清及混和单克隆抗体发生特异性反应。rSD和rSC的抗原性较rSB的抗原性强，与完整重组核蛋白rS抗原性相当(图2)；反复调整抗血清及混和单克隆抗体稀释浓度，重组核蛋白rSA抗原皆未见明显的反应条带，表明其缺乏生物活性。
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1：SB重组体表达产物，2、8：蛋白质标准相对分子质量(自上至下为97400、66200、55000、42700、40000、31000、21500、14400)，3：S重组体表达产物，4：SC重组体表达产物，5：BL-21(DE3)空菌对照，6：SD重组体表达产物，7：BL-21(DE3)plys S空菌对照
图2-1 重组体表达产物12% SDS-PAGE分析
1：S重组体表达产物，2：SB重组体未筛选T7启动子表达产物，3：SB重组体筛选T7启动子后表达产物，4：SC重组体表达产物，5：BL-21(DE3)空菌对照，6：SD重组体表达产物，7：SD重组体未诱导产物
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图2-2 重组体表达产物Western-blot检测结果
三、Dot-blot检测患者血清和McAb
将10倍稀释的粗制重组抗原用于Dot-blot实验，以正常人和其他病毒感染(乙肝、丙肝)者血清为阴性对照的标本均显色很浅，而抗-HFRSV阳性标本则显色较深。不同重组抗原检测效果比较，rSC、rSD与rS抗原活性相当，rSB抗原显色稍浅，rSA显色最浅。该方法检测患者血清的结果与IFA的结果吻合(表2)，其中与特异性IgM抗体的显色反应比对特异性IgG抗体的显色反应深，尤以轻型患者更显著。重组抗原与一组抗-HFRSV单克隆抗体反应结果显示，5H5单抗与rSB、rSC、rSD重组抗原反应显色深；与H7单抗反应显色浅，但5H5和H7混和后反应显色明显加深，重组抗原与3A9、7D1、1B3及F3株单抗反应很弱或不反应。
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表2 Dot-blot检测HFRS患者血清结果 血清标本
S
SA
SB
SC
SD
IFA
轻型3例
3/3
0/0
3/3
3/3
3/3
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>160/3
中型3例
3/3
0/0
3/3
3/3
3/3
>640/3
重型2型
2/2
0/0
2/2
2/2
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2/2
>1 280/3
乙肝2例
0/0
-
-
0/0
0/0
<40/0
丙肝2例
0/0
-
-
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0/0
0/0
<40/0
正常人3例
0/0
-
-
0/0
0/0
<40/0
注：斜线上方为检测IgG阳性结果，下方为检测IgM阳性结果；“-”为未检测；IFA检测斜线上为荧光效价
讨 论
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国内外的研究表明[2，6]，汉滩病毒属成员间基因S片段比M片段的核苷酸序列同源性高，不同毒株间血清学交叉反应的抗原决定簇主要存在于S基因编码的核蛋白上。抗原性分析[7]进一步表明流行于我国的两型病毒(汉滩型和汉城型)其核蛋白上具有组、型特异性抗原决定簇，这些决定簇均具有非构象依赖性的特点，存在于核蛋白的两个独立的区域中。鉴于汉滩病毒核蛋白上含有能与两型病毒抗血清发生特异性反应的抗原位点，本研究选择S基因进行实验表达，并初步证明，S片段氨基端部分编码基因的表达产物可以作为侦检抗原，用于对HFRS患者进行早期快速诊断和流行病学调查及研究。
本研究筛选的S基因小片段具备以下特征：其一是该片段包含了核蛋白的亲水区域，一般认为亲水区域与蛋白质分子的抗原决定簇有关；其二是包含了与病毒核蛋白上组特异性抗原决定簇相关的氨基酸高同源核苷酸片段。试验结果显示，筛选表达的重组抗原具有特异性和生物活性，初步证实这一设计具有可行性，为进一步筛选小核苷酸片段，用以拼接表达可以检测全血中HFRS特异性抗体的双功能蛋白奠定了基础。
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利用基因工程技术克隆、表达有活性的原核重组核蛋白已有不少报道[8，9]。本研究首次采用T7新型表达载体，构建表达了汉滩病毒全长和部分S片段编码基因。免疫印迹测定显示，表达的完整核蛋白(rS)及截短核蛋白(rSB、rSC、rSD)均具有良好的抗原性。用粗制抗原建立的Dot-blot法检测HFRS患者血清中特异性抗核蛋白IgG和IgM抗体，结果与IFA法一致，表明截短的重组抗原具有较宽的反应谱及较强的特异性，提示该抗原编码区内(37-612)含有一个以上主要抗原决定簇。实验中rSA(4 500)重组蛋白片段与抗血清未见特异性反应，显示汉滩毒病属成员间核蛋白氨基末端(37-141)存在较大差异，汉滩病毒与普马拉病毒及四角地区病毒不同[10，11]，不存在可引起体液免疫应答的主要抗原决定簇或只是其中的一部分。由于核蛋白抗原位点是非构象依赖性的，因此推测汉滩病毒核蛋白氨基端的主要抗原决定区位于141～612之间。
此外，单抗5H5和H7与重组核蛋白抗原发生不同程度的特异性反应，两者混和后反应明显增强，显示该两株单抗与抗原的亲和力有叠加作用，为针对不同抗原位点的抗核蛋白单抗，表明该组截短核蛋白具有两个以上的抗原决定簇。
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本课题获国家自然科学基金资助(编号：39670645)
参考文献
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2 Sheshberadaran H,Niklasson B,Tachenko EA.Antigenic relationship between hantaan viruses analysed by immunoprecipitation.J Gen virol,1988,69:2645-2651.
3 唐家琪，陈竞芳，李先富.ELISA检测HFRSV特异性IgM抗体及其与RPHI、IF试验的比较.中国公共卫生，1991，7：163-168.
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4 Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T,et al.Molecular cloning:a laboratary manual.2nd ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratary Press,1989,1:21-98.
5 李永兴，胡长征.介绍一种新的半干式免疫转渍法.生物化学与生物物理进展，1991，616：242-243.
6 俞永新，姚智慧，安琪，等.应用空斑减少中和试验比较流行性出血热不同毒株的抗原性.中华微生物学与免疫学杂志，1991，11：162-164.
7 梁米芳，宋干，杭长寿，等.用单克隆抗体分析流行性出血热病毒的核蛋白抗原位点.病毒学报，1989，5：24-30.
8 梁米芳，李德新，杭长寿，等.汉坦病毒S基因在大肠杆菌中的表达及其初步应用.中华实验与临床病毒学杂志，1993，7：225-228.
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9 Wang M,Rossi C,Schmaljohn CS.Expression of non-conserved regions of the S genome segments of three hantaviruses:evaluation of the expressed polypeptides for diagnosis of haemorrhagic fever with renal syndrome. J Gen Virol,1993,74:1115-1124.
10 Elgh F,Lundkvist A,Alexeyev OA,et al.A major antigenic domain for the human humoral response to Puumala virus nucleocapsid protein is located at the aminoterminus.J Virol,1996,59:161-172.
11 Jenison S,Yakashi T,Morris C,et al.Characterization of human antibody responses to Four Corners Hantavirus infections among patients with Hantavirus Pulmonary syndrome.J virol,1994,68:3000-3006.
(收稿：1998-06-22 修回：1999-01-19), 百拇医药
单位：210002 南京军区军事医学研究所
关键词：汉滩病毒属；重组核蛋白；免疫印迹试验；间接酶联免疫吸附试验
中华传染病杂志990310 【摘要】 目的 体外克隆表达汉滩病毒全长及部分核蛋白编码基因，筛选病毒核蛋白在人体体液应答中的主要抗原决定簇区，以期获得高质量核蛋白抗原，为研制新型肾综合征出血热(HFRS)基因工程诊断试剂奠定基础。方法 利用聚合酶链反应(PCR)和限制性内切酶酶切的方法分离汉滩病毒76-118 S基因全长及部分氨基端编码基因(S、SA、SB、SC和SD)，分别将各编码基因克隆入T7原核表达载体，在大肠杆菌中表达；免疫印迹试验(Western-blot analysis)分析重组抗原活性。结果 完整和截短核蛋白皆得到有效表达，相对分子质量分别为50000(recombinant S protein,rS)、4500(rSA)、22000(rSB)、25000(rSC)和27000(rSD)，Western-blot分析表明截短核蛋白(rSB、rSC和rSD)具有较好的抗原活性；粗提抗原Dot-blot方法检测HFRS患者血清结果与IFA法一致；重组小片段抗原与抗汉滩病毒单克隆抗体5H5及H7可发生特异性反应。结论 汉滩病毒核蛋白的氨基端含有一主要抗原决定簇区；原核表达的截短核蛋白在HFRS的血清学诊断中具有一定的价值。
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Expression of the entire and truncated S genome segment of Hantaan virus in E.coli and preliminary use of the recombinant proteins
WANG Changjun,TANG Jiaqi,CAO Min,et al.
Institute of Military Medicine,Nanjing Command,Nanjing 210002
【Abstract】 Objective In order to obtain a major antigenic domain from Hantaan virus nucleocapsid protein,which accounts for the human humoral response and can be used to develop the new genetic engineering diagnostic reagents,the entire and several truncated coding regions of the small (S) genome segment of Hantaan virus was constructed and expressed in E.coli.Methods Fragments of entire and truncated conservative genes (S,SA,SB,SC and SD) were cloned into poly-histidine fusion protein expression vector pET-28c by PCR and restriction digest methods,and the immunogenecity of recombinant proteins were examined by immunoblots and ELISA with polyclonal and monoclonal antibodies.Results The molecular weights of S,SA,SB,SC and SD proteins were 50000,4500,22000,25000 and 27000 dalton respectively.Western-blot analysis demonstrated that recombinant SB,SC and SD proteins presented the specific antigenicity and S protein could be used for the detection of the specific IgG and IgM in the serum of patients by Dot-ELISA after purification.The specificity and stability of the test was equal to IFA.Conclusion A dominating antigenic region located at the amino-terminus of Hantaan virus nucleocapsid protein.These recombinant truncated proteins can be used to diagnose the infection of HFRSV serologically.
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【Key words】 Hantaan virus Recombinant nucleocapsid protein Western-blot Indirect enzyme linked immunoabsorbent assay
汉坦病毒为布尼亚病毒科成员，其基因组由L、M、S三节段组成，为负链RNA病毒。该病毒可引起肾综合征出血热(HFRS)、汉坦病毒肺综合征(HPS)[1]等传染病。HFRS在我国流行广泛，目前尚无特效治疗药物，由于早发现、早诊断和早治疗对患者预后影响很大，因此建立可靠的早期快速诊断方法对其防治具有重要意义。本研究根据流行于我国的两型病毒(汉滩型和汉城型)代表株的核苷酸序列，氨基酸同源性及多肽亲水性[2]分析结果，结合S片段特定的内切酶位点，运用聚合酶链反应(PCR)扩增和酶切方法分离出汉滩病毒76-118株S片段cDNA完整编码区和部分氨基端核苷酸片段，分别将其克隆入新型T7启动子原核高效表达载体，获得不同大小的重组核蛋白抗原表达，并对其抗原性进行初步分析。
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材料与方法
一、菌株和质粒
表达型大肠杆菌BL-21(DE3)PLysS购自美国Promega公司；用于基因克隆的大肠杆菌DH5α购自Pharmacia公司；表达载体pET-28c由本所朱进助理研究员赠送；含汉滩病毒76-118 S片段cDNA质粒由中国预防医学科学院病毒学研究所杭长寿研究员惠赠。
二、试剂
PCR扩增反应试剂盒购自上海生物工程公司；T4 DNA连接酶、限制性核酸内切酶购自GIBCO BRL公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、苯甲磺酰氯(PMSF)和溶菌酶为Promega公司产品；辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG、IgM抗体，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG抗体和酶标SPA均购自上海生物制品研究所；所用配制各种液体的化学试剂均为分析纯或分子生物学纯级。
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三、血清标本和抗-肾综合征出血热病毒(抗-HFRSV)单克隆抗体(McAb)
安徽疫区HFRS患者早期血清和乙型肝炎(乙肝)、丙型肝炎(丙肝)患者阳性血清由南京军区总医院提供。HFRS轻型、中型患者血清各3份，重型2份(患者临床分型、分期标准按《流行性出血热防治方案》)，共计8份；乙肝、丙肝阳性血清各2份，健康人血清3份，购自南京市红十字血液中心。抗-HFRSV鼠源McAb 5H5、3A9、1B3由第四军医大学徐志凯教授赠送，McAb F3、H7为本室用陈株免疫制备[3]。
四、引物设计与合成
根据汉滩病毒76-118 S片段核苷酸序列设计四条引物：P1 5′-ATGCATGCGGCCGCTACCA-TGGCAACTATGGAGG-3′，含Nco Ⅰ酶切位点；P2 5′-GATCGTCGACTTAGATCTAGAGTTTCA-AAGGCTC-3′，含Sal Ⅰ和Bgl Ⅱ酶切位点；P3 5′-TATGAGCTCGCATATGGCAACTATGGAGGAA-3′，含Nde Ⅰ酶切位点；P4 5′-TTGTCGACTCTT-CTGCCTTCATGCT-3′，含Sal Ⅰ酶切位点。以上引物均由上海生工生物工程公司协助合成和纯化。
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五、部分S基因片段重组体设计构建
应用限制性内切酶和PCR扩增方法制备不同大小的截短S基因片段SA、SB、SC、SD(见表1)。载体及基因片段的酶切、回收按常规方法[4]进行。连接反应体系中含酶切目的片段200ng，酶切脱“P”表达载体100ng，T4 DNA连接酶2U，共计20μl，14℃作用16小时。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，常规铺板培养。挑取单个菌落扩增培养，抽提质粒，用限制性内切酶酶切和PCR鉴定重组体。
表1 汉滩病毒76-118株S片段全长和部分编码基因重组体设计构建 编号
基因长度
(bp)
序列位置
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克隆粘性末端
编码氨基酸
(aa)
S
1287
37～1324
NcoⅠ/SalⅠ
429
SA
104
37～141
NdeⅠ/BamHⅠ
35
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SB
585
37～612
NdeⅠ/SalⅠ
195
SC
649
37～686
NcoⅠ/BclⅠ
216
SD
737
37～774
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NcoⅠ/HindⅢ
246
注：pET-28c表达载体多克隆酶切位点顺序：NcoⅠ、NdeⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、HindⅢ、NotⅠ;SA、SC、SD通过酶切分离；汉滩病毒76-118 S基因141位、686位、774位分别含BamHⅠ 、BclⅠ(其粘性末端与BamHⅠ粘性末端匹配)、HindⅢ位点
六、PCR
引物P1和P2用于扩增S片段完整编码区基因(下称S)，引物P3和P4用于扩增570bp部分氨基端基因片段(下称SB)。PCR体系为100μl，含引物各40pmol/L,dNTPs 0.15mmol/L,MgCl2 1.5mmol/L，模板10ng，混匀后覆盖适量石蜡油，95℃变性5分钟，加入2.5U Taq DNA聚合酶，进行扩增。条件为：95℃ 30秒，57℃ 1.5分钟，72℃ 1.5分钟，共30个循环，末次循环后72℃延伸10分钟。产物用1.2%琼脂糖电泳鉴定。
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七、诱导表达
阳性重组质粒转化感受态大肠杆菌BL-21(DE3)PlysS，从平皿上随机挑取单个转化菌，重复接种于2块新平皿上，其中1块加1mmol/L IPTG,37℃培养4～6小时，找出在IPTG平板上不生长，而在另1块平皿上生长良好的克隆，接种于LBK(含卡那霉素50μg/ml)培养液5ml中，37℃培养过夜，次日取培养物按1∶100比例种于新鲜LBK培养液中，37℃振荡培养至A600约0.9，加IPTG至1mmol/L，37℃诱导培养3～6小时，收集菌体。
八、表达蛋白的初步纯化
用裂解液(50mmol/L Tris-Cl pH8.0,0.1mol/L EDTA,100mmol/L NaCl)3ml悬浮菌体，加适量PMSF和溶菌酶，冰浴搅拌20分钟。加去氧胆酸4mg、DNA酶Ⅰ(Pharmacia 10U/μl)20μl，37℃作用30分钟。4℃ 13 000r/min离心15分钟，沉淀悬于9倍体积的含5% Triton X-100和10mmol/L EDTA(pH8.0)的缓冲液中洗5分钟，4℃ 13 000r/min离心15分钟，沉淀用含0.1 mmol/L PMSF(临用现加)、6mol/L去离子尿素的裂解缓冲液溶解，室温放置1小时。4℃ 13 000r/min离心20分钟，收集上清用于活性检测。
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九、Western-blot分析
裂解菌体或粗提产物经12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，采用半干转印法[5]将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用封闭液(含5%脱脂奶粉的PBS液)作用1.5小时，再加用1∶200封闭液稀释的患者血清或加用封闭液1∶500稀释的混和抗HFRSV单克隆抗体，作用2小时。充分洗涤，加用封闭液作1∶150稀释的辣根过氧化物酶标记的SPA或兔抗鼠IgG抗体，作用1小时。充分洗涤，加新鲜配制的DAB显色液(5mg DAB溶于10ml 50mmol/L Tris-Cl pH7.6，50mmol/L NaCl中，过滤去沉淀，加30% H2O215μl)，避光显色2～8分钟。以上反应均在室温进行。
十、用粗制抗原作Dot-ELISA检测患者血清和McAb
将10倍系列稀释的粗制抗原5μl滴加于硝酸纤维素膜上(以未转化的菌体裂解物作为阴性对照)，晾干后用PBS封闭液作用2小时，以下步骤同Western-blot[4]。
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结 果
一、完整和截短的核蛋白编码基因片段的克隆和鉴定
PCR产物经凝胶电泳后可见约1.3kb的完整编码区S基因和约0.58kb的截短SB基因片段；通过单酶切或多酶切SB和S基因，又得到104bp的SA、649bp的SC和737bp的SD 3段截短的基因片段(图1)。用低溶点琼脂糖回收上述基因片段，与酶切位点匹配的酶切表达载体连接并转化感受态大肠杆菌DH5α，用酶切和PCR方法鉴定证明获得了不同S基因片段的重组克隆。
1、7、9：100bp DNA ladder,2:SA基因，3：PCR Marker,4:SB基因，5：SC基因，6：S基因，8：SD基因
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图1 汉滩病毒76-118株S片段全长和截短基因电泳结果
二、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western-blot分析结果
重组体经IPTG诱导后，汉滩病毒S基因全长和部分基因片段皆得到了有效表达。截短基因片段表达效率高于全长基因，重组体经IPTG平皿筛选T7Promoter后产量均有所提高。表达蛋白相对分子质量依次约为50000(recombinant S protein,rS)、4500(rSA)、22000(rSB)、25000(rSC)、27 000(rSD)，重组蛋白在菌体中主要以包涵体形式存在，在6mol/L尿素中完全溶解。免疫转印结果显示rS及rSD、rSC、rSB重组核蛋白具有特异性抗原活性，能与抗血清及混和单克隆抗体发生特异性反应。rSD和rSC的抗原性较rSB的抗原性强，与完整重组核蛋白rS抗原性相当(图2)；反复调整抗血清及混和单克隆抗体稀释浓度，重组核蛋白rSA抗原皆未见明显的反应条带，表明其缺乏生物活性。
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1：SB重组体表达产物，2、8：蛋白质标准相对分子质量(自上至下为97400、66200、55000、42700、40000、31000、21500、14400)，3：S重组体表达产物，4：SC重组体表达产物，5：BL-21(DE3)空菌对照，6：SD重组体表达产物，7：BL-21(DE3)plys S空菌对照
图2-1 重组体表达产物12% SDS-PAGE分析
1：S重组体表达产物，2：SB重组体未筛选T7启动子表达产物，3：SB重组体筛选T7启动子后表达产物，4：SC重组体表达产物，5：BL-21(DE3)空菌对照，6：SD重组体表达产物，7：SD重组体未诱导产物
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图2-2 重组体表达产物Western-blot检测结果
三、Dot-blot检测患者血清和McAb
将10倍稀释的粗制重组抗原用于Dot-blot实验，以正常人和其他病毒感染(乙肝、丙肝)者血清为阴性对照的标本均显色很浅，而抗-HFRSV阳性标本则显色较深。不同重组抗原检测效果比较，rSC、rSD与rS抗原活性相当，rSB抗原显色稍浅，rSA显色最浅。该方法检测患者血清的结果与IFA的结果吻合(表2)，其中与特异性IgM抗体的显色反应比对特异性IgG抗体的显色反应深，尤以轻型患者更显著。重组抗原与一组抗-HFRSV单克隆抗体反应结果显示，5H5单抗与rSB、rSC、rSD重组抗原反应显色深；与H7单抗反应显色浅，但5H5和H7混和后反应显色明显加深，重组抗原与3A9、7D1、1B3及F3株单抗反应很弱或不反应。
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表2 Dot-blot检测HFRS患者血清结果 血清标本
S
SA
SB
SC
SD
IFA
轻型3例
3/3
0/0
3/3
3/3
3/3
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>160/3
中型3例
3/3
0/0
3/3
3/3
3/3
>640/3
重型2型
2/2
0/0
2/2
2/2
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2/2
>1 280/3
乙肝2例
0/0
-
-
0/0
0/0
<40/0
丙肝2例
0/0
-
-
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0/0
0/0
<40/0
正常人3例
0/0
-
-
0/0
0/0
<40/0
注：斜线上方为检测IgG阳性结果，下方为检测IgM阳性结果；“-”为未检测；IFA检测斜线上为荧光效价
讨 论
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国内外的研究表明[2，6]，汉滩病毒属成员间基因S片段比M片段的核苷酸序列同源性高，不同毒株间血清学交叉反应的抗原决定簇主要存在于S基因编码的核蛋白上。抗原性分析[7]进一步表明流行于我国的两型病毒(汉滩型和汉城型)其核蛋白上具有组、型特异性抗原决定簇，这些决定簇均具有非构象依赖性的特点，存在于核蛋白的两个独立的区域中。鉴于汉滩病毒核蛋白上含有能与两型病毒抗血清发生特异性反应的抗原位点，本研究选择S基因进行实验表达，并初步证明，S片段氨基端部分编码基因的表达产物可以作为侦检抗原，用于对HFRS患者进行早期快速诊断和流行病学调查及研究。
本研究筛选的S基因小片段具备以下特征：其一是该片段包含了核蛋白的亲水区域，一般认为亲水区域与蛋白质分子的抗原决定簇有关；其二是包含了与病毒核蛋白上组特异性抗原决定簇相关的氨基酸高同源核苷酸片段。试验结果显示，筛选表达的重组抗原具有特异性和生物活性，初步证实这一设计具有可行性，为进一步筛选小核苷酸片段，用以拼接表达可以检测全血中HFRS特异性抗体的双功能蛋白奠定了基础。
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利用基因工程技术克隆、表达有活性的原核重组核蛋白已有不少报道[8，9]。本研究首次采用T7新型表达载体，构建表达了汉滩病毒全长和部分S片段编码基因。免疫印迹测定显示，表达的完整核蛋白(rS)及截短核蛋白(rSB、rSC、rSD)均具有良好的抗原性。用粗制抗原建立的Dot-blot法检测HFRS患者血清中特异性抗核蛋白IgG和IgM抗体，结果与IFA法一致，表明截短的重组抗原具有较宽的反应谱及较强的特异性，提示该抗原编码区内(37-612)含有一个以上主要抗原决定簇。实验中rSA(4 500)重组蛋白片段与抗血清未见特异性反应，显示汉滩毒病属成员间核蛋白氨基末端(37-141)存在较大差异，汉滩病毒与普马拉病毒及四角地区病毒不同[10，11]，不存在可引起体液免疫应答的主要抗原决定簇或只是其中的一部分。由于核蛋白抗原位点是非构象依赖性的，因此推测汉滩病毒核蛋白氨基端的主要抗原决定区位于141～612之间。
此外，单抗5H5和H7与重组核蛋白抗原发生不同程度的特异性反应，两者混和后反应明显增强，显示该两株单抗与抗原的亲和力有叠加作用，为针对不同抗原位点的抗核蛋白单抗，表明该组截短核蛋白具有两个以上的抗原决定簇。
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本课题获国家自然科学基金资助(编号：39670645)
参考文献
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(收稿：1998-06-22 修回：1999-01-19), 百拇医药