血管铸型观察bFGF对大鼠颌面部移植脂肪新生血管的影响
作者：廖天安 王琼超 谢富生 常杰
单位：570311 海南省人民医院口腔科(廖天安)； 海南医学院附属医院口腔科(王琼趋，常杰)； 海南医学院病理教研室(谢富生)
关键词：脂肪移植；碱性成细胞生长因子；血管铸型
中华医学美容/980112.htm Observation on the function of basic fibroblast growth factor in free fat graft
revascularization of maxillofacial region by vascular cast
Liao Tiannan,Wang Qiongchao,Xie Fusheng,et al
, 百拇医药
【摘要】 目的 为探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在自体游离脂肪中血管形成的作用。方法 以SD大鼠双侧嚼肌区皮下作为受植床，取腹股沟区脂肪切碎后，实验侧加入bFGF，并以纤维蛋白作为bFGF的缓释剂；对照侧加入单纯纤维蛋白进行移植。术后7天，经心脏主动脉插管，以液体铸型材料甲烯丙烯酸甲脂、丙烯酸甲酯灌注制作移植体血管制作后，在JSM-T300型扫描电镜下观察血管走向、形态并计量分析。结果 移植脂肪内血管多从颈向头方行走，皮肤侧比嚼肌侧丰富，实验侧大量血管呈芽突状，芽突顶端及侧方有深而长的椭圆或圆形内皮细胞核压迹，新生血管明显偏粗。结论 bFGF作为外源性因子加入自体游离移植脂肪内可诱导血管长入，增加移植组织中血管的数量及增大新生血管直径的作用。
Observation on the function of basic fibroblast growth factor in free fat graft revascularization
, 百拇医药
on maxillofacial regionby vascular cast Liao Tianan,Wang Qiongchao,Xie Fusheng,et al.Department
of Stomatology, Hai Nan Peoples Hospital, Hai Nan 570311
【Abstract】 Objective To search the function of basic fibroblast growth factor (bFGF) in vascularization
of auto-free grafting.Method Bilateral subcutaneous masseteric muscle region were used as the transplant
, 百拇医药
beds. The fat graft obtained from the inguinal region which were granulated and mixed with only fibroprotein
of the contrast side and fibroprotein containing with basic fibroblast growth factor (bFGF) of the experimental
side.The vascular casts of graft were prepared by methacrylate and methyl methacrylate monomar through
intubation to aorta via the heart 7 days postoperatively. The shape, quantity and direction of revascularization
, 百拇医药
were studied by JSM-T300 scanning electron microscopy.Result The direction of vesselsin graft went mainly
from neck to head. It was more abundance on subcutaneous tissue than adjacent muscular side. There were a
great number of vascular buds as predminant source of new vessels with spheriodal or spherical impressions of
nuclei of endethelial cells on ends or lateral sides of vascular casts, and the dimensions of vessels on test sides were larger than contrapositive sides. Conclusion The bFGF added to graft could stimulate it revascularization and increased quantity and size of new vessels.
, 百拇医药
【Key words】 Fat grafting bFGF Vascular casts
碱性成纤维细胞生长因子(b fibroblast grouth factor,bFGF) 80年代被单独分离后，其促进血管内皮细胞生长，刺激细胞分裂的作用及机理，在细胞培养中已受到广泛重视[1～3]，但在活体上进行实验研究的报道尚不多见。本实验试图通过血管铸型和扫描电镜观察，探讨bFGF在自体游离脂肪移植中血管形成的作用。
材料与方法
一、动物及手术：SD大鼠5只，雄性，体重250～300 g 。3 %戌巴比妥钠0.1～0.12 ml/100 g腹腔注射全麻下，常规脱毛，消毒铺巾。双侧下颌角下方作5 mm长切口，分离嚼肌与皮肤为受植区。取腹股沟脂肪，用2 ml注射器接16号针头反复推压2～3次抽取。双侧植入前进行预处理：实验侧植入脂肪0.2 g,加入5 000 mg/100 ml纤维蛋白原(海南医学院蛋白研究所制备)20 μl，纤维蛋白原中含有2 μg与蛋白结合的bFGF(东大海特生物工程有限公司提供)，混匀，加入125 μ/ml凝血酶10 μl，注入实验侧受植床；对照侧植入0.2 g脂肪，所用纤维蛋白原不含bFGF，操作同实验侧。伤口缝合，术后7天处死动物。
, 百拇医药
二、血管铸型标本制作及观察方法
1.单体洗涤及冷贮：将甲烯丙烯酸甲酯(Ⅰ液)及丙烯酸甲酯(Ⅱ液)分别以3 %NaOH洗涤3次，蒸镏水洗涤3次，以去除阻聚剂，在洗涤后的Ⅰ液、Ⅱ液中分别加石膏吸收残留水份，过滤。将Ⅰ液、Ⅱ液按9∶1比例混合，80℃水浴6分钟，流水冷却，冷贮备用。
2.铸型制作：动物在全麻下开胸，经心脏主动脉插管，以100～120 mmHg压力，生理盐水(含肝素2 500 μ/100 dl；罂栗碱150 mg/100 ml)灌洗至血液清澈，再用1 %戌二醛50 ml灌注后维持30分钟。甲烯丙烯酸甲脂50 ml灌注，以驱去血管中水份，40 ml预聚液加入二甲基苯酰0.4 ml充分摇匀，立即灌注，此时从右心房流出的先为甲烯丙稀酸酯，遇水呈油状，随后铸型液流出，遇水可形成硬膜。结扎心蒂，静置3天，解剖动物见移植物有光滑被膜包囊，沿被膜外剪断与周围组织联系的铸型血管，取出移植体，置6N KOH腐蚀3天。手术显微镜下，注射器缓缓
, 百拇医药
冲洗溶解组织残渣。凉干后便获血管铸型标本。
3.扫描电镜观察：整个标本粘附于铜台上，真空喷金，在JSM-T300型扫描电镜下观察血管形态并作计量分析。计量方法：每个标本取4个限象及中心，以同一放大倍数(145倍)摄像5张(每张照片相当于标本实际面0.27 mm2)，每张照片中心画“+”字，计算每个标本5张照片与“+”字交叉的血管总和并按管径大小分类。
结 果
在手术显微镜下可见血管铸型标本血管呈枝网状、粗细不等。血管主要从颈向头方向及周边向中央行走。皮肤侧血管较嚼肌侧丰富。电镜下，移植体皮肤侧血管多呈水平方向，嚼肌侧 可见较多的从浅面向深面行走的血管及芽突，血管多源于皮肤侧。同时可见周边及表面有明显
的动静脉伴行，移植物中血管交叉紊乱。典型的动静脉少见，血管处于发育分化状态(图1)。实验侧移植体内血管普遍较粗，存在大量的芽状、短突状血管，血管芽突的侧方及顶端可见
, http://www.100md.com
深而椭圆或圆形的胞核压迹和管壁的波状外膨出(图2、3)。实验侧与对照侧不同直径血管计数
及采用配对资料在t检验统计学处理结果见表1。
图1 实验侧移植脂肪的皮肤面见血管交叉紊乱，血管
偏粗，少见动静脉及毛细血管分化 SEM×145
图2 SEM×145
图3 SEM×250
, 百拇医药
图2、3 实验侧移植脂肪嚼肌面血管
大量芽、突及其内皮细胞核压迹
表1 实验侧及对照侧不同直径血管数比较
血管直径
(μm)
实验侧
(X1)
对照侧
(X2)
差值d=X1-X2
, http://www.100md.com S
P值
28以下
41.6
46
-4.4
11.46
P>0.5
28～56
29.4
12.6
16.8
8.70
, 百拇医药
0.01>P>0.005
56～84
11.6
8.4
3.2
3.11
0.05>P>0.025
84以上
6.4
3.4
2.6
1.14
0.005>P>0.0025
, http://www.100md.com
合计
89
70.04
18.6
10.08
0.005>P>0.0025
讨 论
众所周知，小血管的再生以生芽方式，血管内皮细胞大量分裂增殖向外突出成幼芽，继而增长成实心内皮细胞条索，以后在血流冲击下出现管腔。Ingber DE(1990) 在血管内皮细胞培养液中加入bFGF后能刺激细胞增殖生长。有研究表明，在无血清和bFGF条件下，阻抑在GI期
状态下的血管内皮细胞加入bFGF后可进入S期，并使细胞同步生长最少持续两代[1]。本实验观察到直径28 μm以上的血管在实验侧与对照侧有显著性差异，实验侧血管总数明显多于对照侧，可见在活体中外源性的bFGF可促进移植体内血管内皮细胞形成更多更粗的内皮细胞条索，促进形成更多的大管腔新生血管。实验中所见大量血管突、芽及明显的胞核压迹存在，可见bFGF的加入使血管生成能持续进行，不断诱导血管长入移植组织内，Mignatei P[4]等用Ⅰ[125]DNA标记牛血管内皮细胞，发现向羊膜基层加入bFGF可使血管内皮细胞长入羊膜内，证明了bFGF对血管内皮的诱导作用。移植体与受床之间的血液循环沟通包括周围血管的长入，以
, 百拇医药
及移植体与受区间的血管吻合两种形式。本实验通过血管铸型，电镜扫描观察，尚未能直接区分这两种形式形成的血管，故bFGF的参与是同时促进血管长入和血管吻合，抑或仅是促进血管长入，尚未能作出定论。而从实验侧与对照侧血管数、直径、芽突的差异可展示，血管长入形式在实验侧具有优势。
实验结果表明，bFGF在活体游离脂肪组织移植中起到诱导血管长入，增加组织中血管数目及增大血管直径的作用。
*本课题由海南省自然科学基金资助
参考文献
1Baldin V, Roman AM, BoSC-Bierne I, et al. Translocation of bFGF to the nucleus is GI phase cell
cycle specific in bovine aorticend thelial cells. EMBO J,1990,9:1511～1517.
, 百拇医药
2Kurokawa M, Doctrow SR, Klagsbrun M. Neutralizing antibodies inhibit the binding of basic fibroblast
growth factor to its receptor but not to heparin. J Biol Chem,1989,264:7686～7691.
3Gospodarowicz D, Neufeld G, Schewigerer L. Fibroblast growth factor structural and biloogical properties.
J Cell Physilo Suppl, 1989 Suppl, 5:15～26.
4Mignati P, Tsuboi R, Robbins E. et al. In vtro angiogenesis on the human amriotic membrance: reguirement
of basic fibroblast growth factor induced proteinasese. J Cell Bio, 1989,108:671～782.
(收稿：1996-09-11 修回1997-09-23), 百拇医药
单位：570311 海南省人民医院口腔科(廖天安)； 海南医学院附属医院口腔科(王琼趋，常杰)； 海南医学院病理教研室(谢富生)
关键词：脂肪移植；碱性成细胞生长因子；血管铸型
中华医学美容/980112.htm Observation on the function of basic fibroblast growth factor in free fat graft
revascularization of maxillofacial region by vascular cast
Liao Tiannan,Wang Qiongchao,Xie Fusheng,et al
, 百拇医药
【摘要】 目的 为探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在自体游离脂肪中血管形成的作用。方法 以SD大鼠双侧嚼肌区皮下作为受植床，取腹股沟区脂肪切碎后，实验侧加入bFGF，并以纤维蛋白作为bFGF的缓释剂；对照侧加入单纯纤维蛋白进行移植。术后7天，经心脏主动脉插管，以液体铸型材料甲烯丙烯酸甲脂、丙烯酸甲酯灌注制作移植体血管制作后，在JSM-T300型扫描电镜下观察血管走向、形态并计量分析。结果 移植脂肪内血管多从颈向头方行走，皮肤侧比嚼肌侧丰富，实验侧大量血管呈芽突状，芽突顶端及侧方有深而长的椭圆或圆形内皮细胞核压迹，新生血管明显偏粗。结论 bFGF作为外源性因子加入自体游离移植脂肪内可诱导血管长入，增加移植组织中血管的数量及增大新生血管直径的作用。
Observation on the function of basic fibroblast growth factor in free fat graft revascularization
, 百拇医药
on maxillofacial regionby vascular cast Liao Tianan,Wang Qiongchao,Xie Fusheng,et al.Department
of Stomatology, Hai Nan Peoples Hospital, Hai Nan 570311
【Abstract】 Objective To search the function of basic fibroblast growth factor (bFGF) in vascularization
of auto-free grafting.Method Bilateral subcutaneous masseteric muscle region were used as the transplant
, 百拇医药
beds. The fat graft obtained from the inguinal region which were granulated and mixed with only fibroprotein
of the contrast side and fibroprotein containing with basic fibroblast growth factor (bFGF) of the experimental
side.The vascular casts of graft were prepared by methacrylate and methyl methacrylate monomar through
intubation to aorta via the heart 7 days postoperatively. The shape, quantity and direction of revascularization
, 百拇医药
were studied by JSM-T300 scanning electron microscopy.Result The direction of vesselsin graft went mainly
from neck to head. It was more abundance on subcutaneous tissue than adjacent muscular side. There were a
great number of vascular buds as predminant source of new vessels with spheriodal or spherical impressions of
nuclei of endethelial cells on ends or lateral sides of vascular casts, and the dimensions of vessels on test sides were larger than contrapositive sides. Conclusion The bFGF added to graft could stimulate it revascularization and increased quantity and size of new vessels.
, 百拇医药
【Key words】 Fat grafting bFGF Vascular casts
碱性成纤维细胞生长因子(b fibroblast grouth factor,bFGF) 80年代被单独分离后，其促进血管内皮细胞生长，刺激细胞分裂的作用及机理，在细胞培养中已受到广泛重视[1～3]，但在活体上进行实验研究的报道尚不多见。本实验试图通过血管铸型和扫描电镜观察，探讨bFGF在自体游离脂肪移植中血管形成的作用。
材料与方法
一、动物及手术：SD大鼠5只，雄性，体重250～300 g 。3 %戌巴比妥钠0.1～0.12 ml/100 g腹腔注射全麻下，常规脱毛，消毒铺巾。双侧下颌角下方作5 mm长切口，分离嚼肌与皮肤为受植区。取腹股沟脂肪，用2 ml注射器接16号针头反复推压2～3次抽取。双侧植入前进行预处理：实验侧植入脂肪0.2 g,加入5 000 mg/100 ml纤维蛋白原(海南医学院蛋白研究所制备)20 μl，纤维蛋白原中含有2 μg与蛋白结合的bFGF(东大海特生物工程有限公司提供)，混匀，加入125 μ/ml凝血酶10 μl，注入实验侧受植床；对照侧植入0.2 g脂肪，所用纤维蛋白原不含bFGF，操作同实验侧。伤口缝合，术后7天处死动物。
, 百拇医药
二、血管铸型标本制作及观察方法
1.单体洗涤及冷贮：将甲烯丙烯酸甲酯(Ⅰ液)及丙烯酸甲酯(Ⅱ液)分别以3 %NaOH洗涤3次，蒸镏水洗涤3次，以去除阻聚剂，在洗涤后的Ⅰ液、Ⅱ液中分别加石膏吸收残留水份，过滤。将Ⅰ液、Ⅱ液按9∶1比例混合，80℃水浴6分钟，流水冷却，冷贮备用。
2.铸型制作：动物在全麻下开胸，经心脏主动脉插管，以100～120 mmHg压力，生理盐水(含肝素2 500 μ/100 dl；罂栗碱150 mg/100 ml)灌洗至血液清澈，再用1 %戌二醛50 ml灌注后维持30分钟。甲烯丙烯酸甲脂50 ml灌注，以驱去血管中水份，40 ml预聚液加入二甲基苯酰0.4 ml充分摇匀，立即灌注，此时从右心房流出的先为甲烯丙稀酸酯，遇水呈油状，随后铸型液流出，遇水可形成硬膜。结扎心蒂，静置3天，解剖动物见移植物有光滑被膜包囊，沿被膜外剪断与周围组织联系的铸型血管，取出移植体，置6N KOH腐蚀3天。手术显微镜下，注射器缓缓
, 百拇医药
冲洗溶解组织残渣。凉干后便获血管铸型标本。
3.扫描电镜观察：整个标本粘附于铜台上，真空喷金，在JSM-T300型扫描电镜下观察血管形态并作计量分析。计量方法：每个标本取4个限象及中心，以同一放大倍数(145倍)摄像5张(每张照片相当于标本实际面0.27 mm2)，每张照片中心画“+”字，计算每个标本5张照片与“+”字交叉的血管总和并按管径大小分类。
结 果
在手术显微镜下可见血管铸型标本血管呈枝网状、粗细不等。血管主要从颈向头方向及周边向中央行走。皮肤侧血管较嚼肌侧丰富。电镜下，移植体皮肤侧血管多呈水平方向，嚼肌侧 可见较多的从浅面向深面行走的血管及芽突，血管多源于皮肤侧。同时可见周边及表面有明显
的动静脉伴行，移植物中血管交叉紊乱。典型的动静脉少见，血管处于发育分化状态(图1)。实验侧移植体内血管普遍较粗，存在大量的芽状、短突状血管，血管芽突的侧方及顶端可见
, http://www.100md.com
深而椭圆或圆形的胞核压迹和管壁的波状外膨出(图2、3)。实验侧与对照侧不同直径血管计数
及采用配对资料在t检验统计学处理结果见表1。
图1 实验侧移植脂肪的皮肤面见血管交叉紊乱，血管
偏粗，少见动静脉及毛细血管分化 SEM×145
图2 SEM×145
图3 SEM×250
, 百拇医药
图2、3 实验侧移植脂肪嚼肌面血管
大量芽、突及其内皮细胞核压迹
表1 实验侧及对照侧不同直径血管数比较
血管直径
(μm)
实验侧
(X1)
对照侧
(X2)
差值d=X1-X2
, http://www.100md.com S
P值
28以下
41.6
46
-4.4
11.46
P>0.5
28～56
29.4
12.6
16.8
8.70
, 百拇医药
0.01>P>0.005
56～84
11.6
8.4
3.2
3.11
0.05>P>0.025
84以上
6.4
3.4
2.6
1.14
0.005>P>0.0025
, http://www.100md.com
合计
89
70.04
18.6
10.08
0.005>P>0.0025
讨 论
众所周知，小血管的再生以生芽方式，血管内皮细胞大量分裂增殖向外突出成幼芽，继而增长成实心内皮细胞条索，以后在血流冲击下出现管腔。Ingber DE(1990) 在血管内皮细胞培养液中加入bFGF后能刺激细胞增殖生长。有研究表明，在无血清和bFGF条件下，阻抑在GI期
状态下的血管内皮细胞加入bFGF后可进入S期，并使细胞同步生长最少持续两代[1]。本实验观察到直径28 μm以上的血管在实验侧与对照侧有显著性差异，实验侧血管总数明显多于对照侧，可见在活体中外源性的bFGF可促进移植体内血管内皮细胞形成更多更粗的内皮细胞条索，促进形成更多的大管腔新生血管。实验中所见大量血管突、芽及明显的胞核压迹存在，可见bFGF的加入使血管生成能持续进行，不断诱导血管长入移植组织内，Mignatei P[4]等用Ⅰ[125]DNA标记牛血管内皮细胞，发现向羊膜基层加入bFGF可使血管内皮细胞长入羊膜内，证明了bFGF对血管内皮的诱导作用。移植体与受床之间的血液循环沟通包括周围血管的长入，以
, 百拇医药
及移植体与受区间的血管吻合两种形式。本实验通过血管铸型，电镜扫描观察，尚未能直接区分这两种形式形成的血管，故bFGF的参与是同时促进血管长入和血管吻合，抑或仅是促进血管长入，尚未能作出定论。而从实验侧与对照侧血管数、直径、芽突的差异可展示，血管长入形式在实验侧具有优势。
实验结果表明，bFGF在活体游离脂肪组织移植中起到诱导血管长入，增加组织中血管数目及增大血管直径的作用。
*本课题由海南省自然科学基金资助
参考文献
1Baldin V, Roman AM, BoSC-Bierne I, et al. Translocation of bFGF to the nucleus is GI phase cell
cycle specific in bovine aorticend thelial cells. EMBO J,1990,9:1511～1517.
, 百拇医药
2Kurokawa M, Doctrow SR, Klagsbrun M. Neutralizing antibodies inhibit the binding of basic fibroblast
growth factor to its receptor but not to heparin. J Biol Chem,1989,264:7686～7691.
3Gospodarowicz D, Neufeld G, Schewigerer L. Fibroblast growth factor structural and biloogical properties.
J Cell Physilo Suppl, 1989 Suppl, 5:15～26.
4Mignati P, Tsuboi R, Robbins E. et al. In vtro angiogenesis on the human amriotic membrance: reguirement
of basic fibroblast growth factor induced proteinasese. J Cell Bio, 1989,108:671～782.
(收稿：1996-09-11 修回1997-09-23), 百拇医药