白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6基因cDNA片段的克隆与鉴定
作者：周国理 黄炯烈 姚其方 詹希美 葛春喜 王玲
单位：中山医科大学寄生虫学教研室， 广东 广州 510089
关键词：伊蚊属；CYP6；杀虫剂抗药性；序列同源性；细胞色素P450；基因扩增
中山医科大学学报000101
摘 要：目的 获得白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6基因家族中的一个cDNA片段。方法 根据家蝇CYP6A1、CYP6D1以及致倦库蚊CYP6E同源区氨基酸序列，设计1对简并引物，进行反转录PCR，获得一大小与设计的细胞色素P450基因片段相符合的cDNA片段。将该片断与pUC19质粒重组，并克隆至JM109大肠杆菌中，经筛选后测序；将推导的氨基酸序列进行同源性分析，并用PC/GENE软件绘制系统树。结果 获得了1条长240 bp的核酸序列；所得序列与昆虫CYP6家族的同源性在36.3%～46.8%之间，但CYP6D1除外，其同源性为29.1%；而与CYP4家族同源性较低，与CYP4C1、CYP4D1、CYP4D2同源性分别为33.3%、32.9%和29.9%；与哺乳动物CYP3A亚家族同源性亦较高；所绘制的系统树显示出与同源性分析相一致的结果。结论 该序列为CYP6家族中某一成员的结构基因片段。
, 百拇医药
分类号：R384.1； Q965.9 文献标识码：A
文章编号：1000-257X(2000)01-0001-05
Clone and identification of a cDNA fragment of CYP6 gene from
deltamethrin-resistant strain of Aedes albopictus
ZHOU Guo-li
(Department of Parasitology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089, China)
HUANG Jiong-lie
, 百拇医药
(Department of Parasitology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089, China)
YAO Qi-fang
(Department of Parasitology, Guangdong Pharmacy College, Guangzhou 510240, China)
ZAN Xi-mei
(Department of Parasitology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089, China)
GE Chun-xi
, http://www.100md.com
(Department of Parasitology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089, China)
WANG Ling
(Department of Parasitology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089, China)
Abstract：Objective To obtain a cDNA fragment of CYP6 gene from deltamethrin-resistant strain of Aedes albopictus. Method A pair of degenerate primers according to the homologus amino acid sequences of CYP6A1, CYP6D1 in Musca domestica and CYP6E in Culex quinquefasciatus were designed and used to amplify CYP6 gene from total RNA of deltamethrin-resistant strain of Ae. albopictus by RT-PCR technique. The cDNA fragment was recombinated with pUC19, and cloned into JM109. A positive clone was selected for sequencing. The deduced amino acid sequence was subjected to homologous analysis. A dendrogram was constructed by the use of PC/GENE sequence analysis software. Results A nucleotide sequence of 240 bp was obtained. The cloned sequence identity to members of CYP6B, CYP6A and CYP6E is from 36.3% to 46.8%, to CYP6D1 is 29.1%, to CYP4C1, CYP4D1 and CYP4D2 is 33.3%, 32.9% and 29.9% respectively. The constructed dendrogram showed a similar result to homologous analysis. Conclusions The cloned sequence is a structural gene fragment from one of members of CYP6 family.
, 百拇医药
Key words：Aedes; CYP6; insecticide resistance; sequence homology; cytochrome P450; gene amplification▲
昆虫对杀虫剂产生抗性的一个重要机理就是通过微粒体细胞色素P450单加氧酶介导的解毒作用增强。研究昆虫细胞色素P450参与杀虫剂抗性的分子机理，首先就必须寻找和鉴定昆虫中与杀虫剂抗性有关的P450。已知细胞色素P450蛋白是一个超家族，各家族成员众多，而且昆虫中P450含量低且极不稳定，易变性为无活性的P 420[1]。因此如何解决上述矛盾是广大昆虫学工作者所面临的一个重要课题。过去20年中已分离、鉴定的昆虫P450成员将近200个，并分属于CYP4、CYP6、CYP9、CYP12、CYP15、CYP18、CYP28和CYP29 8个家族中[2]。已有许多研究表明其中CYP6家族成员与昆虫抗药性有关[1]，但这些研究仅见于家蝇、果蝇及某些农业昆虫，而关于蚊虫中与抗药性有关的CYP6家族成员，目前国内外均未见报道。因此，本实验直接从CYP6家族入手，根据昆虫中已知的CYP6家族成员氨基酸序列同源区，设计简单引物，进行RT-PCR，以寻找蚊虫中与抗药性有关的CYP6家族成员，为进一步研究蚊虫P450介导的解毒增强的分子机理奠定基础。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验虫株
白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株(以下简称抗性株)由广东药学院寄生虫学教研室惠赠，抗性倍数达50倍。
1.2 引物设计
参照黄炯烈等(1998)[3]及王迅等(1996)[4]简并引物设计原理，根据家蝇CYP6A1、CYP6D1以及致倦库蚊CYP6E1同源区氨基酸序列[5～7]，设计了如下引物：正向引物(forward primer)为5′-CGGAATTCGAA(G) CAN C(AT)T(C)N A(C)GN AAA(G) TAT(C) CC-3′，相应的氨基酸序列为ETL(T)RKYP；反向引物(reverse primer)为5′-CGGAATTC GGN CCN A(T)CN CCG(A) AAN GG-3′，相应的氨基酸序列为P(G)FGE(DL)GP(Q)。因克隆策略的需要，两个引物的5′端均引入EcoR Ⅰ酶切位点，并加2个保护性碱基。
, http://www.100md.com
1.3 主要试剂、材料
组织中总RNA抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒均为Qiagen公司产品；RT-PCR试剂盒为Clontech公司产品；载体pUC19、宿主菌JM109均购自华美公司；琼脂糖、各种限制性内切酶、牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)及T4 DNA连接酶均购自基因公司；细菌培养用酵母提取物、胰蛋白胨及琼脂粉均为Oxtid公司产品。
1.4 成蚊总RNA抽提、纯化
取刚羽化3 d内的成蚊15只，液氮速冻，并立即液氮研磨，用Qiagen Total RNA 抽提试剂盒进行抽提、纯化，具体操作步骤见试剂盒说明书。
1.5 RT-PCR
上述抽提的成蚊总RNA，立即用于RT-PCR。根据试剂盒说明书，对其推荐的PCR条件略加修改：50 μL反应体积中含2.5 μL 20×RT-PCR buffer、6 μL 25 mmol/L MgCl2、 1 μL 25 mmol/L MnSO4、0.5 μL Polymerase、8 μL dNTP Mix、 1.5 μL Primer 1、1.5 μL Primer 2、 5 μL RNA模板、24 μL灭菌水，混匀，上层加石蜡油 25 μL，快速离心分层，在英国 Techne公司PROGENE型DNA扩增仪上进行反转录(60 ℃，20 min)，以合成第一链cDNA，然后再进行PCR扩增反应，循环参数如下：90 ℃ 30 s、45 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，35个循环后72 ℃ 5 min，扩增完毕置4 ℃终止反应。
, http://www.100md.com
1.6 PCR产物的克隆与测序
参照文献[8]，RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳，选择大小与所设计的细胞色素P450基因片段相符合的单一cDNA条带，回收、纯化；PCR产物的EcoR Ⅰ酶切，载体pUC 19的EcoR Ⅰ酶切及牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)去磷酸化；T4 DNA连接酶16 ℃连接过夜后，转化入JM109大肠杆菌中；挑取单个白色菌落以碱裂解法快速小量抽提质粒DNA，经电泳初筛后，重组质粒EcoR Ⅰ酶切鉴定和PCR鉴定，择其中一个阳性克隆，送交中科院微生物所M13反向引物测序。
1.7 序列分析
用PC/GENE序列分析软件将所得cDNA序列翻译成蛋白质序列，并输入计算机网络，查询Swissprot数据库，以获得昆虫中已知的细胞色素P450蛋白质序列数据和部分同源性分析数据，并与PC/GENE软件分析的部分同源性资料汇总，绘制系统树。
, http://www.100md.com
2 结 果
2.1 克隆基因cDNA片断序列测定
选取一阳性克隆，用M13反向引物进行测序，核酸序列及按三联密码子推导出的氨基酸序列见图1，包括除去EcoR Ⅰ酶切位点的引物在内，所得cDNA序列总长度为240 bp，氨基酸序列中共有80个氨基酸残基，所得片断长度与文献上P450片断大小相符。
图1 白纹伊蚊抗性株细胞色素P450 cDNA片断序列及推导的氨基酸序列
加有下划线的为引物序列，cDNA片断序列长度为240 bp，共有80个氨基酸残基
Fig. 1 The cloned sequence data from Aedes albopictus
, 百拇医药
resistant strain and deduced sequence of amino acid.
The underlined sequences represent primers. The cloned sequence consists of 240 bp. Amino acid residues are deduced
2.2 所得序列的同源性分析
所推导的氨基酸序列(AEDR)与昆虫中部分已知的CYP6、CYP4家族成员以及脊椎动物中部分已知的CYP3家族成员同源性分析见图2；根据图2，分别计算所得氨基酸序列与其它已知细胞色素P450成员氨基酸序列中相同氨基酸残基数所占的百分比(表1)，并以此作为同源性分析的指标；由PC/GENE序列分析软件绘制系统树(图3)。
, http://www.100md.com
图2 白纹伊蚊抗性株P450基因cDNA片段氨基酸序列与其它相关序列的同源性分析
Fig.2 Homologous analysis of cloned P450 amino acid sequence from Aedes albopictus resistant strain and corresponding sequences of other sources of P450 member
Character to show that a position in the alignment is perfectly conserved:`*' Character to show that a position is well conserved:`*'
, 百拇医药
图3 P450基因家族部分成员系统树
Fig.3 Dendrogram of certain members in P450 gene family
表1 本实验所得序列与其它细胞色素P450成员同源性比较
Table 1 Homologous comparison of the cloned sequence with corresponding part of other members of P450 gene Member
Source
Identical number
of residues
Homology
, 百拇医药
(%)
CYP6A1
家蝇[5]
37
46.3
CYP6A2
果蝇1)
29
36.3
CYP6B1
黑凤蝶1)
32
, http://www.100md.com
40.5
CYP6B2
棉蛉虫1)
32
40.0
CYP6B3
黑凤蝶1)
30
38.0
CYP6B4
东方虎凤蝶1)
37
, 百拇医药
46.8
CYP6B5
东方虎凤蝶1)
37
46.8
CYP6B6
棉蛉虫1)
32
40.5
CYP6B7
棉蛉虫1)
31
, 百拇医药
39.2
CYP6D1
家蝇[6]
23
29.1
CYP6E
致倦库蚊[7]
37
46.3
CYP4C1
蟑螂1)
26
, 百拇医药
33.3
CYP4D1
果蝇1)
26
32.9
CYP4D2
果蝇1)
23
29.9
CYP3A1
鼠1)
32
, 百拇医药
41.0
CYP3A2
鼠1)
34
43.6
CYP3A3
人1)
30
38.5
1) These data are obtained from Swissprot Database. CYP6 A 2 derives from Waters LC, et al. 1992. CYP6B1 from Prapaipong H, et al. 1994. CYP6B2 from Wang X P, et al. 1995. CYP6B3 from Hung C F, et al. 1995. CYP6B4 from Hung C F, et al. 1997. CYP6B5 from Hung C F, et al. 1996. CYP6B6、CYP6B7 from Ranasinghe C, et al. 1998. CYP4C1 from Bradfield J Y, et al. 1991. CYP4D1 from Gandhi R, et al. 1992. CYP4D2 from Frolov M V, et al. 1994. CYP3A1 from Gonzalez F J, et al. 1985. CYP3A2 from Gonalez F J, et al. 1986. CYP3A3 from Watkins P B, et al. 19853 讨 论
, http://www.100md.com
由表1可以看出，本实验所得序列(AEDR)与昆虫CYP6家族的同源性在36.3%～46.8%之间，但CYP6D1除外，其同源性为29.1%；而与CYP4家族同源性较低，例如与CYP4C1为33.3%、与CYP4D1为32.9%、与CYP4D2为29.9%。根据P450命名法，一个家族内部各成员P450蛋白序列的同源性一般要大于40%，但许多学者认为这样划一条绝对的界限，在细胞色素P450家族划分的实际工作中是不现实的，应该结合诸如基因的内含子与外显子的组成、数目和位置以及生物来源等情况综合考虑[9]。本序列是以昆虫CYP6家族中已知成员的保守区氨基酸序列设计引物，用白纹伊蚊抗性株总RNA为模板，通过反转录PCR方法而获得的，因此应首先考虑该序列为昆虫CYP6家族中某一成员的结构基因片段。
有趣的是，本实验所获得的氨基酸序列与哺乳动物细胞色素P450 3 A家族有较高的同源性(表1)，其中与CYP3A1、3A2及3A3的同源性分别为41.0%、43.6%及38.5%。考虑到本实验的生物来源为白纹伊蚊，而且反转录PCR简并引物的设计依据是家蝇和致倦库蚊P450保守区氨基酸序列，因此本实验获得的序列应划分至CYP6家族，而非CYP3家族。另外，已知CYP3家族是通过基因复制而变异进化的，大约在11亿年前CYP3家族从其它具有药物代谢功能的P450家族中分化出来，而昆虫CYP6家族从CYP3家族中分化出来的时间大约在3～7亿年以前[10]。因此本文的这一结果与此结论是相一致的，同时这也从另一个角度进一步说明本实验所获得的序列属于CYP6家族。虽然两者的同源性很高，但并不表示它们在各自的生物机体内执行着相同的功能，因为CYP6的一些氨基酸结构明显地与CYP3不同。
, 百拇医药
用PC/GENE序列分析软件绘制出本序列与其它已知的部分CYP6、CYP4和CYP3家族成员之间的进化系统树(图3)。由图3可以看出，本实验所获得的序列(AEDR)与昆虫CYP6B、CYP6E和CYP6A等亚家族亲缘关系较近，而与CYP6D1及CYP4家族亲缘关系较远，这与前面的同源性分析结果是相一致的。
由于本实验所得序列只是细胞色素P450结构基因中一个片断(240 bp)，虽然它与其它已知P450序列的同源性比较并不能代表P450全长cDNA的同源性，但由于本序列两端引物序列是根据昆虫CYP6中的保守区氨基酸序列所设计的，因此比较该段序列的同源性在划分P450家族成员的关系上仍具有较大的参考价值。对本序列的最后确定则有待于进行下一步的研究工作，以获得其全长cDNA序列。本实验所获得的序列以及所建立的从抗性昆虫中寻找与抗性有关的细胞色素P450成员的基本方法，为今后开展抗性基因的检测和筛选等研究工作奠定了基础。■
基金项目：广东省自然科学基金资助项目(970092)； “211工程”重点学科建设基金资助项目
, 百拇医药
(98124)
作者简介：周国理(1964-)，男，安徽枞阳人，讲师，在职博士研究生.
参考文献：
[1]冷欣夫，唐振华，王荫长. 杀虫药剂分子毒理学及昆虫抗药性[M]. 北京： 中国农业出版社， 1996. 1～171.
[2]Scott J G, Liu N, Wen Z. Insect cytochromes P450: diversity, insecticide resistance and tolerance to plant toxins.[J]. Comp Biochem Physiol, 1998, 121(Part C): 147.
[3]黄炯烈，王 迅. 致倦库蚊溴氰菊酯抗性株细胞色素P450基因的克隆、鉴定及同源性分析[J]. 寄生虫与医学昆虫学报， 1998， 5(3)：166.
, 百拇医药
[4]王 迅，黄炯烈. 简并引物PCR在致倦库蚊细胞色素P450基因研究中的应用[J]. 广东寄生虫学会年报， 1996， 18：11.
[5]Feyereisen R, Koener J F, Farnsworth D E, et al. Isolation one sequence of cDNA encoding a cytochrome P450 from an insecticide-resistant strain of the house fly, Musca domestica [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86(5):1465.
[6]Tomita T, Scott J G. cDNA and deduced protein sequence of CYP6D1: the putative gene for cytochrome P450 responsible for pyrethroid resistance in house fly[J]. Insect Biochem Mol Biol, 1995, 25(2):275.
, 百拇医药
[7]Kasai S, Shono T, Yamakawa M. Molecular cloning and nucleotide sequence of a cytochrome P450 cDNA from a Pyrethroid-resistant mosquito, Culex quinquefasciatus Say[J]. Insect Mol Biol, 1998, 7(2):185.
[8]萨姆布鲁克J， 弗里奇 E F， 曼尼阿蒂斯 T(金冬雁，黎孟枫，林 枫，等译).分子克隆实验指南[M]. 北京：科学出版社， 1993. 1～1062.
[9]Nelson D R, Kamataki T, Waxman D J, et al. The P450 superfamily: update on new sequence, gene mapping, accession numbers, early trivial names of enzymes and nomenclature[J]. DNA Cell Biol, 1993, 12(1):1.
[10]Nelson D R, Strobel H W. Evolution of cytochrome P450 proteins [J]. Mol Biol Evol, 1987, 4(6):572.
收稿日期：1999-07-30, 百拇医药
单位：中山医科大学寄生虫学教研室， 广东 广州 510089
关键词：伊蚊属；CYP6；杀虫剂抗药性；序列同源性；细胞色素P450；基因扩增
中山医科大学学报000101
摘 要：目的 获得白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6基因家族中的一个cDNA片段。方法 根据家蝇CYP6A1、CYP6D1以及致倦库蚊CYP6E同源区氨基酸序列，设计1对简并引物，进行反转录PCR，获得一大小与设计的细胞色素P450基因片段相符合的cDNA片段。将该片断与pUC19质粒重组，并克隆至JM109大肠杆菌中，经筛选后测序；将推导的氨基酸序列进行同源性分析，并用PC/GENE软件绘制系统树。结果 获得了1条长240 bp的核酸序列；所得序列与昆虫CYP6家族的同源性在36.3%～46.8%之间，但CYP6D1除外，其同源性为29.1%；而与CYP4家族同源性较低，与CYP4C1、CYP4D1、CYP4D2同源性分别为33.3%、32.9%和29.9%；与哺乳动物CYP3A亚家族同源性亦较高；所绘制的系统树显示出与同源性分析相一致的结果。结论 该序列为CYP6家族中某一成员的结构基因片段。
, 百拇医药
分类号：R384.1； Q965.9 文献标识码：A
文章编号：1000-257X(2000)01-0001-05
Clone and identification of a cDNA fragment of CYP6 gene from
deltamethrin-resistant strain of Aedes albopictus
ZHOU Guo-li
(Department of Parasitology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089, China)
HUANG Jiong-lie
, 百拇医药
(Department of Parasitology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089, China)
YAO Qi-fang
(Department of Parasitology, Guangdong Pharmacy College, Guangzhou 510240, China)
ZAN Xi-mei
(Department of Parasitology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089, China)
GE Chun-xi
, http://www.100md.com
(Department of Parasitology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089, China)
WANG Ling
(Department of Parasitology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089, China)
Abstract：Objective To obtain a cDNA fragment of CYP6 gene from deltamethrin-resistant strain of Aedes albopictus. Method A pair of degenerate primers according to the homologus amino acid sequences of CYP6A1, CYP6D1 in Musca domestica and CYP6E in Culex quinquefasciatus were designed and used to amplify CYP6 gene from total RNA of deltamethrin-resistant strain of Ae. albopictus by RT-PCR technique. The cDNA fragment was recombinated with pUC19, and cloned into JM109. A positive clone was selected for sequencing. The deduced amino acid sequence was subjected to homologous analysis. A dendrogram was constructed by the use of PC/GENE sequence analysis software. Results A nucleotide sequence of 240 bp was obtained. The cloned sequence identity to members of CYP6B, CYP6A and CYP6E is from 36.3% to 46.8%, to CYP6D1 is 29.1%, to CYP4C1, CYP4D1 and CYP4D2 is 33.3%, 32.9% and 29.9% respectively. The constructed dendrogram showed a similar result to homologous analysis. Conclusions The cloned sequence is a structural gene fragment from one of members of CYP6 family.
, 百拇医药
Key words：Aedes; CYP6; insecticide resistance; sequence homology; cytochrome P450; gene amplification▲
昆虫对杀虫剂产生抗性的一个重要机理就是通过微粒体细胞色素P450单加氧酶介导的解毒作用增强。研究昆虫细胞色素P450参与杀虫剂抗性的分子机理，首先就必须寻找和鉴定昆虫中与杀虫剂抗性有关的P450。已知细胞色素P450蛋白是一个超家族，各家族成员众多，而且昆虫中P450含量低且极不稳定，易变性为无活性的P 420[1]。因此如何解决上述矛盾是广大昆虫学工作者所面临的一个重要课题。过去20年中已分离、鉴定的昆虫P450成员将近200个，并分属于CYP4、CYP6、CYP9、CYP12、CYP15、CYP18、CYP28和CYP29 8个家族中[2]。已有许多研究表明其中CYP6家族成员与昆虫抗药性有关[1]，但这些研究仅见于家蝇、果蝇及某些农业昆虫，而关于蚊虫中与抗药性有关的CYP6家族成员，目前国内外均未见报道。因此，本实验直接从CYP6家族入手，根据昆虫中已知的CYP6家族成员氨基酸序列同源区，设计简单引物，进行RT-PCR，以寻找蚊虫中与抗药性有关的CYP6家族成员，为进一步研究蚊虫P450介导的解毒增强的分子机理奠定基础。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验虫株
白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株(以下简称抗性株)由广东药学院寄生虫学教研室惠赠，抗性倍数达50倍。
1.2 引物设计
参照黄炯烈等(1998)[3]及王迅等(1996)[4]简并引物设计原理，根据家蝇CYP6A1、CYP6D1以及致倦库蚊CYP6E1同源区氨基酸序列[5～7]，设计了如下引物：正向引物(forward primer)为5′-CGGAATTCGAA(G) CAN C(AT)T(C)N A(C)GN AAA(G) TAT(C) CC-3′，相应的氨基酸序列为ETL(T)RKYP；反向引物(reverse primer)为5′-CGGAATTC GGN CCN A(T)CN CCG(A) AAN GG-3′，相应的氨基酸序列为P(G)FGE(DL)GP(Q)。因克隆策略的需要，两个引物的5′端均引入EcoR Ⅰ酶切位点，并加2个保护性碱基。
, http://www.100md.com
1.3 主要试剂、材料
组织中总RNA抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒均为Qiagen公司产品；RT-PCR试剂盒为Clontech公司产品；载体pUC19、宿主菌JM109均购自华美公司；琼脂糖、各种限制性内切酶、牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)及T4 DNA连接酶均购自基因公司；细菌培养用酵母提取物、胰蛋白胨及琼脂粉均为Oxtid公司产品。
1.4 成蚊总RNA抽提、纯化
取刚羽化3 d内的成蚊15只，液氮速冻，并立即液氮研磨，用Qiagen Total RNA 抽提试剂盒进行抽提、纯化，具体操作步骤见试剂盒说明书。
1.5 RT-PCR
上述抽提的成蚊总RNA，立即用于RT-PCR。根据试剂盒说明书，对其推荐的PCR条件略加修改：50 μL反应体积中含2.5 μL 20×RT-PCR buffer、6 μL 25 mmol/L MgCl2、 1 μL 25 mmol/L MnSO4、0.5 μL Polymerase、8 μL dNTP Mix、 1.5 μL Primer 1、1.5 μL Primer 2、 5 μL RNA模板、24 μL灭菌水，混匀，上层加石蜡油 25 μL，快速离心分层，在英国 Techne公司PROGENE型DNA扩增仪上进行反转录(60 ℃，20 min)，以合成第一链cDNA，然后再进行PCR扩增反应，循环参数如下：90 ℃ 30 s、45 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，35个循环后72 ℃ 5 min，扩增完毕置4 ℃终止反应。
, http://www.100md.com
1.6 PCR产物的克隆与测序
参照文献[8]，RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳，选择大小与所设计的细胞色素P450基因片段相符合的单一cDNA条带，回收、纯化；PCR产物的EcoR Ⅰ酶切，载体pUC 19的EcoR Ⅰ酶切及牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)去磷酸化；T4 DNA连接酶16 ℃连接过夜后，转化入JM109大肠杆菌中；挑取单个白色菌落以碱裂解法快速小量抽提质粒DNA，经电泳初筛后，重组质粒EcoR Ⅰ酶切鉴定和PCR鉴定，择其中一个阳性克隆，送交中科院微生物所M13反向引物测序。
1.7 序列分析
用PC/GENE序列分析软件将所得cDNA序列翻译成蛋白质序列，并输入计算机网络，查询Swissprot数据库，以获得昆虫中已知的细胞色素P450蛋白质序列数据和部分同源性分析数据，并与PC/GENE软件分析的部分同源性资料汇总，绘制系统树。
, http://www.100md.com
2 结 果
2.1 克隆基因cDNA片断序列测定
选取一阳性克隆，用M13反向引物进行测序，核酸序列及按三联密码子推导出的氨基酸序列见图1，包括除去EcoR Ⅰ酶切位点的引物在内，所得cDNA序列总长度为240 bp，氨基酸序列中共有80个氨基酸残基，所得片断长度与文献上P450片断大小相符。
图1 白纹伊蚊抗性株细胞色素P450 cDNA片断序列及推导的氨基酸序列
加有下划线的为引物序列，cDNA片断序列长度为240 bp，共有80个氨基酸残基
Fig. 1 The cloned sequence data from Aedes albopictus
, 百拇医药
resistant strain and deduced sequence of amino acid.
The underlined sequences represent primers. The cloned sequence consists of 240 bp. Amino acid residues are deduced
2.2 所得序列的同源性分析
所推导的氨基酸序列(AEDR)与昆虫中部分已知的CYP6、CYP4家族成员以及脊椎动物中部分已知的CYP3家族成员同源性分析见图2；根据图2，分别计算所得氨基酸序列与其它已知细胞色素P450成员氨基酸序列中相同氨基酸残基数所占的百分比(表1)，并以此作为同源性分析的指标；由PC/GENE序列分析软件绘制系统树(图3)。
, http://www.100md.com
图2 白纹伊蚊抗性株P450基因cDNA片段氨基酸序列与其它相关序列的同源性分析
Fig.2 Homologous analysis of cloned P450 amino acid sequence from Aedes albopictus resistant strain and corresponding sequences of other sources of P450 member
Character to show that a position in the alignment is perfectly conserved:`*' Character to show that a position is well conserved:`*'
, 百拇医药
图3 P450基因家族部分成员系统树
Fig.3 Dendrogram of certain members in P450 gene family
表1 本实验所得序列与其它细胞色素P450成员同源性比较
Table 1 Homologous comparison of the cloned sequence with corresponding part of other members of P450 gene Member
Source
Identical number
of residues
Homology
, 百拇医药
(%)
CYP6A1
家蝇[5]
37
46.3
CYP6A2
果蝇1)
29
36.3
CYP6B1
黑凤蝶1)
32
, http://www.100md.com
40.5
CYP6B2
棉蛉虫1)
32
40.0
CYP6B3
黑凤蝶1)
30
38.0
CYP6B4
东方虎凤蝶1)
37
, 百拇医药
46.8
CYP6B5
东方虎凤蝶1)
37
46.8
CYP6B6
棉蛉虫1)
32
40.5
CYP6B7
棉蛉虫1)
31
, 百拇医药
39.2
CYP6D1
家蝇[6]
23
29.1
CYP6E
致倦库蚊[7]
37
46.3
CYP4C1
蟑螂1)
26
, 百拇医药
33.3
CYP4D1
果蝇1)
26
32.9
CYP4D2
果蝇1)
23
29.9
CYP3A1
鼠1)
32
, 百拇医药
41.0
CYP3A2
鼠1)
34
43.6
CYP3A3
人1)
30
38.5
1) These data are obtained from Swissprot Database. CYP6 A 2 derives from Waters LC, et al. 1992. CYP6B1 from Prapaipong H, et al. 1994. CYP6B2 from Wang X P, et al. 1995. CYP6B3 from Hung C F, et al. 1995. CYP6B4 from Hung C F, et al. 1997. CYP6B5 from Hung C F, et al. 1996. CYP6B6、CYP6B7 from Ranasinghe C, et al. 1998. CYP4C1 from Bradfield J Y, et al. 1991. CYP4D1 from Gandhi R, et al. 1992. CYP4D2 from Frolov M V, et al. 1994. CYP3A1 from Gonzalez F J, et al. 1985. CYP3A2 from Gonalez F J, et al. 1986. CYP3A3 from Watkins P B, et al. 19853 讨 论
, http://www.100md.com
由表1可以看出，本实验所得序列(AEDR)与昆虫CYP6家族的同源性在36.3%～46.8%之间，但CYP6D1除外，其同源性为29.1%；而与CYP4家族同源性较低，例如与CYP4C1为33.3%、与CYP4D1为32.9%、与CYP4D2为29.9%。根据P450命名法，一个家族内部各成员P450蛋白序列的同源性一般要大于40%，但许多学者认为这样划一条绝对的界限，在细胞色素P450家族划分的实际工作中是不现实的，应该结合诸如基因的内含子与外显子的组成、数目和位置以及生物来源等情况综合考虑[9]。本序列是以昆虫CYP6家族中已知成员的保守区氨基酸序列设计引物，用白纹伊蚊抗性株总RNA为模板，通过反转录PCR方法而获得的，因此应首先考虑该序列为昆虫CYP6家族中某一成员的结构基因片段。
有趣的是，本实验所获得的氨基酸序列与哺乳动物细胞色素P450 3 A家族有较高的同源性(表1)，其中与CYP3A1、3A2及3A3的同源性分别为41.0%、43.6%及38.5%。考虑到本实验的生物来源为白纹伊蚊，而且反转录PCR简并引物的设计依据是家蝇和致倦库蚊P450保守区氨基酸序列，因此本实验获得的序列应划分至CYP6家族，而非CYP3家族。另外，已知CYP3家族是通过基因复制而变异进化的，大约在11亿年前CYP3家族从其它具有药物代谢功能的P450家族中分化出来，而昆虫CYP6家族从CYP3家族中分化出来的时间大约在3～7亿年以前[10]。因此本文的这一结果与此结论是相一致的，同时这也从另一个角度进一步说明本实验所获得的序列属于CYP6家族。虽然两者的同源性很高，但并不表示它们在各自的生物机体内执行着相同的功能，因为CYP6的一些氨基酸结构明显地与CYP3不同。
, 百拇医药
用PC/GENE序列分析软件绘制出本序列与其它已知的部分CYP6、CYP4和CYP3家族成员之间的进化系统树(图3)。由图3可以看出，本实验所获得的序列(AEDR)与昆虫CYP6B、CYP6E和CYP6A等亚家族亲缘关系较近，而与CYP6D1及CYP4家族亲缘关系较远，这与前面的同源性分析结果是相一致的。
由于本实验所得序列只是细胞色素P450结构基因中一个片断(240 bp)，虽然它与其它已知P450序列的同源性比较并不能代表P450全长cDNA的同源性，但由于本序列两端引物序列是根据昆虫CYP6中的保守区氨基酸序列所设计的，因此比较该段序列的同源性在划分P450家族成员的关系上仍具有较大的参考价值。对本序列的最后确定则有待于进行下一步的研究工作，以获得其全长cDNA序列。本实验所获得的序列以及所建立的从抗性昆虫中寻找与抗性有关的细胞色素P450成员的基本方法，为今后开展抗性基因的检测和筛选等研究工作奠定了基础。■
基金项目：广东省自然科学基金资助项目(970092)； “211工程”重点学科建设基金资助项目
, 百拇医药
(98124)
作者简介：周国理(1964-)，男，安徽枞阳人，讲师，在职博士研究生.
参考文献：
[1]冷欣夫，唐振华，王荫长. 杀虫药剂分子毒理学及昆虫抗药性[M]. 北京： 中国农业出版社， 1996. 1～171.
[2]Scott J G, Liu N, Wen Z. Insect cytochromes P450: diversity, insecticide resistance and tolerance to plant toxins.[J]. Comp Biochem Physiol, 1998, 121(Part C): 147.
[3]黄炯烈，王 迅. 致倦库蚊溴氰菊酯抗性株细胞色素P450基因的克隆、鉴定及同源性分析[J]. 寄生虫与医学昆虫学报， 1998， 5(3)：166.
, 百拇医药
[4]王 迅，黄炯烈. 简并引物PCR在致倦库蚊细胞色素P450基因研究中的应用[J]. 广东寄生虫学会年报， 1996， 18：11.
[5]Feyereisen R, Koener J F, Farnsworth D E, et al. Isolation one sequence of cDNA encoding a cytochrome P450 from an insecticide-resistant strain of the house fly, Musca domestica [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86(5):1465.
[6]Tomita T, Scott J G. cDNA and deduced protein sequence of CYP6D1: the putative gene for cytochrome P450 responsible for pyrethroid resistance in house fly[J]. Insect Biochem Mol Biol, 1995, 25(2):275.
, 百拇医药
[7]Kasai S, Shono T, Yamakawa M. Molecular cloning and nucleotide sequence of a cytochrome P450 cDNA from a Pyrethroid-resistant mosquito, Culex quinquefasciatus Say[J]. Insect Mol Biol, 1998, 7(2):185.
[8]萨姆布鲁克J， 弗里奇 E F， 曼尼阿蒂斯 T(金冬雁，黎孟枫，林 枫，等译).分子克隆实验指南[M]. 北京：科学出版社， 1993. 1～1062.
[9]Nelson D R, Kamataki T, Waxman D J, et al. The P450 superfamily: update on new sequence, gene mapping, accession numbers, early trivial names of enzymes and nomenclature[J]. DNA Cell Biol, 1993, 12(1):1.
[10]Nelson D R, Strobel H W. Evolution of cytochrome P450 proteins [J]. Mol Biol Evol, 1987, 4(6):572.
收稿日期：1999-07-30, 百拇医药