卵细胞质内单精子注射治疗不孕症34例临床总结
作者：邢福祺 陈士岭 闫宗合 陈东红 孔令红 宋兰林 陈思梅
单位：第一军医大学南方医院妇产科，广州，510515
关键词：单精子卵细胞质内注射；不孕症
卵细胞质内单精子注射治疗不孕症34例临床总结
摘要：目的 总结应用单精子卵细胞质内注射(ICSI) 治疗不孕症的临床效果。方法 对34对男性因素、原因不明、受精障碍不孕患者采用GnRHa长周期促排卵方案，给有第一极体的卵细胞行单精子注射。结果 34例34个治疗周期中，1例因反应不良取消。取卵数378个，注射卵数317(83.9%)个，正常受精卵231个(72.9%),卵裂228(98.3%)个，良好胚胎99(43.4%)个,平均移植胚胎数3.6个，临床妊娠12例(移植周期妊娠率为36.4%)。结论 ICSI是治疗男性因素、原因不明、受精障碍等因素引起不孕症的一种切实可行的方法。
, 百拇医药
中图分类号：R711.6
Evaluation of 34 cycles of intracytoplasmic sperm injection for infertility
Xing Fuqi，Chen Shiling，Yan Zonghe，Chen Donghong，Kong Linhong，Song Lanlin，Chen Simei
(Department of Obstetrics and Gynecology，Nanfang Hospital，First Military Medical University，Guangzhou，510515)
Abstract：Objective To evaluate the efficacy of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) in the treatment of infertility.Methods Ovulation induction was accomplished with the use of GnRH agonist down-regulation combined with HMG/FSH stimulation in 34 patients.Mature oocytes with the first polar body were selected for ICSI.Results The total number of oocytes collected was 378，injected oocytes 317(83.9%)，fertilized oocytes 231(72.9%)，developed embryos 228(98.3%)，embryos with good morphology 99 (43.4%);Average number of embryo transfer was 3.6.The clinical pregnancies were achieved in 12 patients and the pregnancy rate of transfer cycle was 35.3%.Conclusion ICSI would be the first choice for treatment of male infertility，idiopathic infertility and fertilization failure with conventional IVF.
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Key words：intracytoplasmic sperm injection(ICSI); infertility
1992年Palermo[1]在世界上率先报道应用卵细胞质内单精子注射(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技术获得健康新生儿出生。这一技术为不孕症治疗，特别是男性原因不孕及受精障碍的治疗带来福音，可谓是体外受精胚胎移植技术的一个重大突破性成果。因而这一技术很快在世界范围普及开来。
我院自1998年9月开始运用这一技术治疗不孕症34例，获临床妊娠12例，3例已分娩健康新生儿。
1 资料与方法
1.1 患者情况 1998年9月至1999年5月在南方医院生殖中心接受治疗的34 对不育患者，女方平均年龄(31.0±4.2)岁，男方年龄(30.9±3.5)岁，平均不育时间(5.1±2.8)年。不孕原因：男方少、弱精症25(73.5%)例，原因不明不孕3(8.8%)例，受精障碍6(17.6%)例(指前次IVF时不受精或受精率少于30%)。男方患者染色体检查未见异常。
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1.2 方法
1.2.1 超促排卵 均采用长周期GnRHa HPFSH方案。2个主卵泡直径达16～18 mm时肌注HCG10000U后34～36 h经阴道B超引导下取卵。
1.2.2 卵细胞处理 实体镜下确认卵丘复合体后，立即收入含0.35%PPF(Plasma protein fraction，Plasmamate，USA)的HEPES-buffered HTF (Irvine Sci,USA)简单盐平衡液中，经含0.35% PPF的HTF简单盐平衡液洗一次，37℃、5%CO2条件下培养于含0.35% PPF的HTF中3～6h。卵丘复合体用含80000 U/L透明质酸酶(Sigma,USA)的HEPES-buffered HTF适当消化处理，自制的毛玻璃管吹吸法完全去除颗粒细胞，获得显微注射用裸卵。
1.2.3 精子处理 普通光镜下查精液常规，据精液常规参数用Percoll不连续密度梯度或微量Percoll不连续密度梯度分离精子，含0.35%PPF的HEPES-buffered HTF和含0.35%PPF的HTF各洗涤一次，用0.35%PPF的HTF稀释成适当浓度。
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1.2.4 显微操作 固定针、注射针购自Cook公司。显微操作在Nikon TE300配Hoffman调制反差光学系统、Narishige NT-88NE显微操纵仪、Nikon DIAPHOT300恒温罩(37℃)设备上完成。选择已释放第一极体的第二次减数分裂中期成熟卵细胞(MⅡ)进行注射。注射时胞浆回吸至卵细胞膜破裂(见注射针内回吸胞浆突然较快速度流动)。注射后的卵细胞用微滴法(20 μl含0.35% PPF的HTF/滴，1个卵细胞/滴)培养。
1.2.5 精子制动 选择正常形态精子，用注射针将精子尾部做波浪运动按压并损伤精子尾部，以便确实破坏鞘膜，释放可能的卵细胞激活信号。
1.2.6 受精判断 注射后16～20 h在倒置显微镜上检查受精情况。有明显雌、雄原核和第一、第二极体者判断为正常受精合子。
1.2.7 胚胎评分 注射后40～44 h检查胚胎形态。以卵裂速度，即卵裂球数为最重要评分依据，4细胞或以上细胞数(≥4个卵裂球)满分为4分，3细胞满分为3分，2细胞满分为2分，要求卵裂球大小均匀，没有无核碎片；无核碎片≤5%，扣0.5分，无核碎片≤10%，扣1分，无核碎片>10%，扣分数逐步增加；卵裂球大小不均匀扣1分，3细胞中两小一大(较大者可能将分裂为两较小细胞)不算卵裂球大小不均。
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1.2.8 移植胚胎选择与移植方法 尽量选择分数较高的胚胎进行移植，相同分数下，卵裂球较多的胚胎优先移植。移植胚胎数据病人情况、胚胎形态而定≤4个。移植管为Cook公司产品。
1.2.9 黄体支持与黄体补充疗法 根据患者情况采用注射hCG或黄体酮维持黄体功能。于移植后14～16 d查血清β-HCG,4周后B超检查胎囊、胎心，确定妊娠与否。
2 结果与讨论
已获临床妊娠的12例中，流产2例，现已分娩3例。ICSI已成为治疗不孕症的一种重要手段，其最初的适应症为男方精子数过少或运动能力过差的男性不孕症。近年其适应症有扩大趋势，我们除了男性原因不孕和原因不明不孕之外，对前一次IVF-ET不受精或受精率低于30%的病人(近年有人把这种临床现象称为“受精障碍”)也采用了ICSI技术治疗，提高了受精率和卵裂率，取得了穿刺卵受精率72.9%、卵裂率98.3%、良好胚胎43.4%、移植周期妊娠率(不分年龄)35.3%的成绩。操作成功的关键取决于以下二个因素：(1)精子的制动，反复几次按压精子尾部、破坏鞘膜，以便其进入卵细胞后释放某些激活卵细胞而促使受精的活性物质；(2)胞浆的充分回吸也是激活受精过程必不可少的因素。有学者认为用于精子制动的聚乙烯吡酮 (PVP)液浓度对受精与卵裂有影响，无PVP液的精子可提高受精率。因我们才刚刚开始操作，技术有待熟练，故精子制动仍在PVP液中进行。我们的工作(另文总结)还显示受精率、卵裂率与精子数量，运动能力无关，但严重畸形精子受精率低下。与卵子的第一极体形态、卵周隙也无关。当然ICSI技术仅问世几年，有许多问题尚待深入研究如部分少弱精患者的染色体异常可能会传给后代等。
作者简介：邢福祺，男，1943年出生，1967年毕业于哈尔滨医科大学，教授，主任医师，电话87644183
参考文献
1 Palermo G，Joris H，Devroty P et al.Pregnancies after intracytoplasmic injection of a single spermatozoon into an oocyte.Lancet，1992，340:17
(收稿日期: 1999-06-14), 百拇医药
单位：第一军医大学南方医院妇产科，广州，510515
关键词：单精子卵细胞质内注射；不孕症
卵细胞质内单精子注射治疗不孕症34例临床总结
摘要：目的 总结应用单精子卵细胞质内注射(ICSI) 治疗不孕症的临床效果。方法 对34对男性因素、原因不明、受精障碍不孕患者采用GnRHa长周期促排卵方案，给有第一极体的卵细胞行单精子注射。结果 34例34个治疗周期中，1例因反应不良取消。取卵数378个，注射卵数317(83.9%)个，正常受精卵231个(72.9%),卵裂228(98.3%)个，良好胚胎99(43.4%)个,平均移植胚胎数3.6个，临床妊娠12例(移植周期妊娠率为36.4%)。结论 ICSI是治疗男性因素、原因不明、受精障碍等因素引起不孕症的一种切实可行的方法。
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中图分类号：R711.6
Evaluation of 34 cycles of intracytoplasmic sperm injection for infertility
Xing Fuqi，Chen Shiling，Yan Zonghe，Chen Donghong，Kong Linhong，Song Lanlin，Chen Simei
(Department of Obstetrics and Gynecology，Nanfang Hospital，First Military Medical University，Guangzhou，510515)
Abstract：Objective To evaluate the efficacy of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) in the treatment of infertility.Methods Ovulation induction was accomplished with the use of GnRH agonist down-regulation combined with HMG/FSH stimulation in 34 patients.Mature oocytes with the first polar body were selected for ICSI.Results The total number of oocytes collected was 378，injected oocytes 317(83.9%)，fertilized oocytes 231(72.9%)，developed embryos 228(98.3%)，embryos with good morphology 99 (43.4%);Average number of embryo transfer was 3.6.The clinical pregnancies were achieved in 12 patients and the pregnancy rate of transfer cycle was 35.3%.Conclusion ICSI would be the first choice for treatment of male infertility，idiopathic infertility and fertilization failure with conventional IVF.
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Key words：intracytoplasmic sperm injection(ICSI); infertility
1992年Palermo[1]在世界上率先报道应用卵细胞质内单精子注射(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技术获得健康新生儿出生。这一技术为不孕症治疗，特别是男性原因不孕及受精障碍的治疗带来福音，可谓是体外受精胚胎移植技术的一个重大突破性成果。因而这一技术很快在世界范围普及开来。
我院自1998年9月开始运用这一技术治疗不孕症34例，获临床妊娠12例，3例已分娩健康新生儿。
1 资料与方法
1.1 患者情况 1998年9月至1999年5月在南方医院生殖中心接受治疗的34 对不育患者，女方平均年龄(31.0±4.2)岁，男方年龄(30.9±3.5)岁，平均不育时间(5.1±2.8)年。不孕原因：男方少、弱精症25(73.5%)例，原因不明不孕3(8.8%)例，受精障碍6(17.6%)例(指前次IVF时不受精或受精率少于30%)。男方患者染色体检查未见异常。
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1.2 方法
1.2.1 超促排卵 均采用长周期GnRHa HPFSH方案。2个主卵泡直径达16～18 mm时肌注HCG10000U后34～36 h经阴道B超引导下取卵。
1.2.2 卵细胞处理 实体镜下确认卵丘复合体后，立即收入含0.35%PPF(Plasma protein fraction，Plasmamate，USA)的HEPES-buffered HTF (Irvine Sci,USA)简单盐平衡液中，经含0.35% PPF的HTF简单盐平衡液洗一次，37℃、5%CO2条件下培养于含0.35% PPF的HTF中3～6h。卵丘复合体用含80000 U/L透明质酸酶(Sigma,USA)的HEPES-buffered HTF适当消化处理，自制的毛玻璃管吹吸法完全去除颗粒细胞，获得显微注射用裸卵。
1.2.3 精子处理 普通光镜下查精液常规，据精液常规参数用Percoll不连续密度梯度或微量Percoll不连续密度梯度分离精子，含0.35%PPF的HEPES-buffered HTF和含0.35%PPF的HTF各洗涤一次，用0.35%PPF的HTF稀释成适当浓度。
, 百拇医药
1.2.4 显微操作 固定针、注射针购自Cook公司。显微操作在Nikon TE300配Hoffman调制反差光学系统、Narishige NT-88NE显微操纵仪、Nikon DIAPHOT300恒温罩(37℃)设备上完成。选择已释放第一极体的第二次减数分裂中期成熟卵细胞(MⅡ)进行注射。注射时胞浆回吸至卵细胞膜破裂(见注射针内回吸胞浆突然较快速度流动)。注射后的卵细胞用微滴法(20 μl含0.35% PPF的HTF/滴，1个卵细胞/滴)培养。
1.2.5 精子制动 选择正常形态精子，用注射针将精子尾部做波浪运动按压并损伤精子尾部，以便确实破坏鞘膜，释放可能的卵细胞激活信号。
1.2.6 受精判断 注射后16～20 h在倒置显微镜上检查受精情况。有明显雌、雄原核和第一、第二极体者判断为正常受精合子。
1.2.7 胚胎评分 注射后40～44 h检查胚胎形态。以卵裂速度，即卵裂球数为最重要评分依据，4细胞或以上细胞数(≥4个卵裂球)满分为4分，3细胞满分为3分，2细胞满分为2分，要求卵裂球大小均匀，没有无核碎片；无核碎片≤5%，扣0.5分，无核碎片≤10%，扣1分，无核碎片>10%，扣分数逐步增加；卵裂球大小不均匀扣1分，3细胞中两小一大(较大者可能将分裂为两较小细胞)不算卵裂球大小不均。
, 百拇医药
1.2.8 移植胚胎选择与移植方法 尽量选择分数较高的胚胎进行移植，相同分数下，卵裂球较多的胚胎优先移植。移植胚胎数据病人情况、胚胎形态而定≤4个。移植管为Cook公司产品。
1.2.9 黄体支持与黄体补充疗法 根据患者情况采用注射hCG或黄体酮维持黄体功能。于移植后14～16 d查血清β-HCG,4周后B超检查胎囊、胎心，确定妊娠与否。
2 结果与讨论
已获临床妊娠的12例中，流产2例，现已分娩3例。ICSI已成为治疗不孕症的一种重要手段，其最初的适应症为男方精子数过少或运动能力过差的男性不孕症。近年其适应症有扩大趋势，我们除了男性原因不孕和原因不明不孕之外，对前一次IVF-ET不受精或受精率低于30%的病人(近年有人把这种临床现象称为“受精障碍”)也采用了ICSI技术治疗，提高了受精率和卵裂率，取得了穿刺卵受精率72.9%、卵裂率98.3%、良好胚胎43.4%、移植周期妊娠率(不分年龄)35.3%的成绩。操作成功的关键取决于以下二个因素：(1)精子的制动，反复几次按压精子尾部、破坏鞘膜，以便其进入卵细胞后释放某些激活卵细胞而促使受精的活性物质；(2)胞浆的充分回吸也是激活受精过程必不可少的因素。有学者认为用于精子制动的聚乙烯吡酮 (PVP)液浓度对受精与卵裂有影响，无PVP液的精子可提高受精率。因我们才刚刚开始操作，技术有待熟练，故精子制动仍在PVP液中进行。我们的工作(另文总结)还显示受精率、卵裂率与精子数量，运动能力无关，但严重畸形精子受精率低下。与卵子的第一极体形态、卵周隙也无关。当然ICSI技术仅问世几年，有许多问题尚待深入研究如部分少弱精患者的染色体异常可能会传给后代等。
作者简介：邢福祺，男，1943年出生，1967年毕业于哈尔滨医科大学，教授，主任医师，电话87644183
参考文献
1 Palermo G，Joris H，Devroty P et al.Pregnancies after intracytoplasmic injection of a single spermatozoon into an oocyte.Lancet，1992，340:17
(收稿日期: 1999-06-14), 百拇医药