SOD络合铜对氟性肾损伤拮抗作用-亚显微结构研究
作者：张莉 王志成 李红 富德 边晓燕 廖展如 阎景龙 管春鹏
单位：张莉 李红 边晓燕(哈尔滨医科大学 电镜室，黑龙江 哈尔滨 150 086)；王志成 富德 阎景龙 管春鹏(哈尔滨医科大学 第二临床医学院 骨科，黑龙江 哈尔滨150086)；廖展如(华中 师范大学 化学系，湖北 武汉 430079)
关键词：超氧化物歧化酶；肾；氟中毒；超微结构
中国地方病学杂志000506 [摘要] 目的 探讨氟毒作用后， 活性氧自由基对大鼠肾组织损伤的超微病理变化及人工合成的超氧化物歧化酶对肾脏的保护 作用。方法 选用40只大鼠随机分为4组，①正常对照组：自 由饮用自来水；②氟中毒组：饮用100 mg/L氟化钠；③治疗组：饮用相同浓度的氟化钠同时 腹腔注射络合酮；④治疗对照组：饮氟同时食入硼。5个月后处死做透射电镜观察。结果 氟中毒组，肾小管微绒毛排列紊乱，脱失。胞膜基 底褶变平，乃致细胞膜破裂。治疗组，注入SOD模型配合物络合酮后，大鼠肾组织超微结 构基本正常。结论 活性氧自由基参与了肾组织的超微病理变化，络合 铜对提高肾脏抗氧化损伤能力有积极作用。
, 百拇医药
[中图分类号] R599.1;O613.41;Q248 [文献标识 码] A [文章编号]1000-4955(2000)05-335-02
Substructure study of antagonism of MSOD copper in kidney damaged wi th fluorosis
ZHANG Li，WANG Zi-cheng，LI Hong，et al
(Department of Electron Microscopic，Harbin Medical University，Harb in 150086，China)
Abstract：Objective To explore after fluorosis,free rad icals of active oxygen to kidney tissue injury is changing ultrastrcture patholo g ical and the kidney injury is protected on mechanism by model superoxide dismuta se (MSOD) from the mixture of artificial.Methods Forties westar rats were divided randomly into 4 groups;①The control group:drinking nomal tap water;②Fluorosis group:drinking fluoride (NAF/100 mg/L);③Cure group:dinking water containg the same amount of fluoride as fluorosis group,but giving casein copper;④Control of cure group:dri nking the same amount of fluoride as bring borax.Results Microvilli arranged in disorederscaled off and lost normal structure in the proximal tubule.Conclusions Free radical was involved in ultrastructure changes of kidney,and MSOD copper exerted protect effect.
, 百拇医药
Key words： SOD; Kidney; Flurosis; Ultrastructure
慢性氟中毒是一种累及人体各系统的全身性疾病。90年代随着人们对 自由基与疾病关系的深入了解，开始从氧化损伤角度重视自由基与氟中毒的研究。肾脏是氟 的重要非骨相靶器官。有关氟中毒对肾脏超微结构变化及络合铜拮抗氟性肾脏损伤的效应国 内尚未见报道。本文从亚细胞水平探讨了氟化钠对大鼠肾脏的损害及超氧化物歧化酶(su peroxide dismutase,SOD)的模型配合物(Model SOD,MSOD)络合铜、硼对其拮抗和保护作 用[1]。从形态上为氟中毒治疗更合理、更全面的实施奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器
1.1.1 SOD模型配合物络合酮，华中师大化学系提供。氟化钠，北京化 学试剂厂生产。
, http://www.100md.com
1.1.2 H-600A型透射电镜，日本日立公司生产。
1.2 动物及分组
1.2.1 选用纯系Wister雄性大鼠40只，鼠龄1.5月，随机分为4组， 每组10只。
1.2.2 A组(正常对照组)，自由饮用常水。B组(氟中毒组)，饮用100 mg/L氟化钠水。C组(治疗组)，饮用相同浓度的氟化钠水同时按每kg体重腹腔注入络合 酮溶液50 μg(隔日1次)。D组(治疗对照组)，饮氟同时按每kg体重食用硼 砂15 μg。
1.3 实验方法 大鼠饲养5个月后，在戊巴比妥钠腹腔麻醉下快速切除肾脏，放入3%戊二 醛溶液中固定2 h，1%锇酸后固定1 h。丙酮系列脱水，环氧树脂618包，超薄切片、醋 酸双氧铀和柠檬酸铅电子染色。电镜观察。
2 结果
, 百拇医药
2.1 A组 电镜下近曲小管上皮细胞排列整齐，腔面微绒毛纤细而密集，顶部小泡内含 中等电子物，膜旁池系内有丰富的游离核蛋白体。微细胞器呈常态。胞膜内褶发育良好。
2.2 B组 肾小球部分基膜略厚，少量足突溶合。近曲小管上皮细胞排列紊乱，游离端 微绒毛扭曲、肿胀、脱失。基部胞膜内褶消失。胞质内线粒体增多呈圆泡状，嵴膜不清，膜 旁池系消失。粗面内质网扩张脱颗粒。溶酶体增多体积变大，内容物电子密度淡染，膜呈断 续状(图1)。少量细胞细胞器崩解，核固缩，细胞坏死。近曲小管上皮细胞肿胀，间质水 肿。
2.3 C组 肾小球结构清晰，近曲小管上皮细胞发育完好，10例中有7例微绒毛密集 排列，另外3例略疏松。基部质膜内褶清晰，褶间有许多纵行排列的杆状线粒体，嵴膜清楚 。顶部膜性小泡发育良好。内质网轻度扩张，但未脱颗粒(图2)。
2.4 D组 近曲小管上皮细胞排列整齐，腔面微绒毛疏松，基底褶平展，线粒体以小圆 形为多，粗面内质网轻度扩张，部分脱颗粒，胞质基质密度降低(图3)。
, 百拇医药
图1 B组：肾小管上皮微绒毛溶合
×8 00 0
图2 C组：肾小管上皮细胞基本恢复
×8 000
图3 D组：肾小管上皮细胞内基质密度下降
×10 000
3 讨论
氟对肾脏的毒害作用，国内外早有学者研究报道。氟的重要生物学特征 之一 是能作为细胞内酶活性调节物，对机体内肾酶活性产生抑制作用，降低肾蛋白包括酶蛋白的 合成代谢[2]。导致抗氧化能力减弱，而起氧化作用的自由基蓄积，脂质过氧化作 用增强。本实验，氟中毒组，近曲小管上皮细胞微绒毛的扭曲和脱失，胞膜内褶的消失。从 形 态上证实了生物膜屏障作用的损伤。其原因可能是肾上皮细胞生物膜上的酶蛋白活性受到抑 制,引起脂质过氧化所致膜流动性降低，造成膜系统的损伤。线粒体肿胀，氧化磷酸化受抑 制，能量合成障碍，进而使粗面内质网脱颗粒，多聚核蛋白体解聚，抑制蛋白的合成。为酶 活性降低的原因提供了又一种可能性。抗氧化能力减弱，氧自由基蓄积，脂质过氧化作用增 强，使溶酶体增多增大，功能过载，膜受损导致细胞崩解坏死。
, http://www.100md.com
资料表明，SOD是体内最重要的自由基清除剂之一。机体内主要有3种SOD，一种是以 铜离子和锌离子为活性中心，存在于胞浆中的Cu-Zn-SOD;一种是以锰离子为活性中心存在 于线粒体中的Mu-SOD;还有一种是以铁离子为活性中心的Fe-SOD。SOD能够催化超氧阴 离子自由基发生歧化反应，消除体内氧自由基的派生源，减轻自由基链式反应对机体的损害 [3]。实验研究证明作为体 内重要抗氧化酶的SOD，在酶的催化中起重要作用的辅基是铜。摄入SOD模型化合物络 合铜(MSOD)后，肾小管上皮细胞的超微病理损伤明显减轻。从亚细胞水平初步证实了 人工合成的MSOD对氟毒性肾脏有明显的拮抗和保护作用。其作用机制可能是铜是肾小管 重吸收中起主要作用酶系的重要成分，它可以改变某些酶的功能，降低生物膜对氟的通透性 ，减少细胞内氟量，减轻对肾脏的损伤。MSOD是根据天然Cu-Zn-SOD酶 活性部位来设计的模型化合物，其配位结构、性质及体外细胞活性与天然SOD非常相近， 不仅可以清除O-2，还能同时清除H2O2，防止它们转化为毒性更强的OH的 *O-2，保护膜不受损害[4，5]。它还能诱导内源性SOD的合成，使其 含量和生物活性增加，提高清除氟自由基的效率，拮抗了脂质过氧化，保护了生物膜的正常 功能。硼能拮抗过量氟对机体的损害的报道较多。本研究治疗对照组，在染氟同时食用硼砂 ，效果差于治疗组，间接地证明了MSOD的抗氟毒效果。MSOD的医学应用研究当续深 入。最佳剂量，摄入方法等都需进一步研究，以期获得更好效果。
, 百拇医药
[基金来源]国家自然科学基金( 39470632)
[作者简介]张 莉(1952-)，女，研究员。
[参考文献]
[1] 吕松岑，王志成，富 德，等.SOD模型配合物对过量染氟人胚肾培 养细胞的影响[J].中国地方病学杂志，1996，15(10)：24.
[2] 刘景林，莫志亚，赵永才，等.实验性氟中毒大鼠病理观察[J].中国 地方病防治杂志，1998，13(3)：147.
[3] 大柳善彦.SODと活性酸素调节剂-の药理作用と临床应用[M].东 京：日本医学馆，1989.61-455.
[4] 廖展如，刘长林，石巨恩.一类新的多铜酶的模型化合物[J].化学学 报，1995，1：37-41.
[5] 廖展如，刘宛林，刘长林，等.超氧化物歧化酶模拟化合物的生物活性 研究[J].生物化学与生物物理进展，1996，2：159-163.
[收稿日期]1999-10-15
[修订日期]2000-01-10, 百拇医药
单位：张莉 李红 边晓燕(哈尔滨医科大学 电镜室，黑龙江 哈尔滨 150 086)；王志成 富德 阎景龙 管春鹏(哈尔滨医科大学 第二临床医学院 骨科，黑龙江 哈尔滨150086)；廖展如(华中 师范大学 化学系，湖北 武汉 430079)
关键词：超氧化物歧化酶；肾；氟中毒；超微结构
中国地方病学杂志000506 [摘要] 目的 探讨氟毒作用后， 活性氧自由基对大鼠肾组织损伤的超微病理变化及人工合成的超氧化物歧化酶对肾脏的保护 作用。方法 选用40只大鼠随机分为4组，①正常对照组：自 由饮用自来水；②氟中毒组：饮用100 mg/L氟化钠；③治疗组：饮用相同浓度的氟化钠同时 腹腔注射络合酮；④治疗对照组：饮氟同时食入硼。5个月后处死做透射电镜观察。结果 氟中毒组，肾小管微绒毛排列紊乱，脱失。胞膜基 底褶变平，乃致细胞膜破裂。治疗组，注入SOD模型配合物络合酮后，大鼠肾组织超微结 构基本正常。结论 活性氧自由基参与了肾组织的超微病理变化，络合 铜对提高肾脏抗氧化损伤能力有积极作用。
, 百拇医药
[中图分类号] R599.1;O613.41;Q248 [文献标识 码] A [文章编号]1000-4955(2000)05-335-02
Substructure study of antagonism of MSOD copper in kidney damaged wi th fluorosis
ZHANG Li，WANG Zi-cheng，LI Hong，et al
(Department of Electron Microscopic，Harbin Medical University，Harb in 150086，China)
Abstract：Objective To explore after fluorosis,free rad icals of active oxygen to kidney tissue injury is changing ultrastrcture patholo g ical and the kidney injury is protected on mechanism by model superoxide dismuta se (MSOD) from the mixture of artificial.Methods Forties westar rats were divided randomly into 4 groups;①The control group:drinking nomal tap water;②Fluorosis group:drinking fluoride (NAF/100 mg/L);③Cure group:dinking water containg the same amount of fluoride as fluorosis group,but giving casein copper;④Control of cure group:dri nking the same amount of fluoride as bring borax.Results Microvilli arranged in disorederscaled off and lost normal structure in the proximal tubule.Conclusions Free radical was involved in ultrastructure changes of kidney,and MSOD copper exerted protect effect.
, 百拇医药
Key words： SOD; Kidney; Flurosis; Ultrastructure
慢性氟中毒是一种累及人体各系统的全身性疾病。90年代随着人们对 自由基与疾病关系的深入了解，开始从氧化损伤角度重视自由基与氟中毒的研究。肾脏是氟 的重要非骨相靶器官。有关氟中毒对肾脏超微结构变化及络合铜拮抗氟性肾脏损伤的效应国 内尚未见报道。本文从亚细胞水平探讨了氟化钠对大鼠肾脏的损害及超氧化物歧化酶(su peroxide dismutase,SOD)的模型配合物(Model SOD,MSOD)络合铜、硼对其拮抗和保护作 用[1]。从形态上为氟中毒治疗更合理、更全面的实施奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器
1.1.1 SOD模型配合物络合酮，华中师大化学系提供。氟化钠，北京化 学试剂厂生产。
, http://www.100md.com
1.1.2 H-600A型透射电镜，日本日立公司生产。
1.2 动物及分组
1.2.1 选用纯系Wister雄性大鼠40只，鼠龄1.5月，随机分为4组， 每组10只。
1.2.2 A组(正常对照组)，自由饮用常水。B组(氟中毒组)，饮用100 mg/L氟化钠水。C组(治疗组)，饮用相同浓度的氟化钠水同时按每kg体重腹腔注入络合 酮溶液50 μg(隔日1次)。D组(治疗对照组)，饮氟同时按每kg体重食用硼 砂15 μg。
1.3 实验方法 大鼠饲养5个月后，在戊巴比妥钠腹腔麻醉下快速切除肾脏，放入3%戊二 醛溶液中固定2 h，1%锇酸后固定1 h。丙酮系列脱水，环氧树脂618包，超薄切片、醋 酸双氧铀和柠檬酸铅电子染色。电镜观察。
2 结果
, 百拇医药
2.1 A组 电镜下近曲小管上皮细胞排列整齐，腔面微绒毛纤细而密集，顶部小泡内含 中等电子物，膜旁池系内有丰富的游离核蛋白体。微细胞器呈常态。胞膜内褶发育良好。
2.2 B组 肾小球部分基膜略厚，少量足突溶合。近曲小管上皮细胞排列紊乱，游离端 微绒毛扭曲、肿胀、脱失。基部胞膜内褶消失。胞质内线粒体增多呈圆泡状，嵴膜不清，膜 旁池系消失。粗面内质网扩张脱颗粒。溶酶体增多体积变大，内容物电子密度淡染，膜呈断 续状(图1)。少量细胞细胞器崩解，核固缩，细胞坏死。近曲小管上皮细胞肿胀，间质水 肿。
2.3 C组 肾小球结构清晰，近曲小管上皮细胞发育完好，10例中有7例微绒毛密集 排列，另外3例略疏松。基部质膜内褶清晰，褶间有许多纵行排列的杆状线粒体，嵴膜清楚 。顶部膜性小泡发育良好。内质网轻度扩张，但未脱颗粒(图2)。
2.4 D组 近曲小管上皮细胞排列整齐，腔面微绒毛疏松，基底褶平展，线粒体以小圆 形为多，粗面内质网轻度扩张，部分脱颗粒，胞质基质密度降低(图3)。
, 百拇医药
图1 B组：肾小管上皮微绒毛溶合
×8 00 0
图2 C组：肾小管上皮细胞基本恢复
×8 000
图3 D组：肾小管上皮细胞内基质密度下降
×10 000
3 讨论
氟对肾脏的毒害作用，国内外早有学者研究报道。氟的重要生物学特征 之一 是能作为细胞内酶活性调节物，对机体内肾酶活性产生抑制作用，降低肾蛋白包括酶蛋白的 合成代谢[2]。导致抗氧化能力减弱，而起氧化作用的自由基蓄积，脂质过氧化作 用增强。本实验，氟中毒组，近曲小管上皮细胞微绒毛的扭曲和脱失，胞膜内褶的消失。从 形 态上证实了生物膜屏障作用的损伤。其原因可能是肾上皮细胞生物膜上的酶蛋白活性受到抑 制,引起脂质过氧化所致膜流动性降低，造成膜系统的损伤。线粒体肿胀，氧化磷酸化受抑 制，能量合成障碍，进而使粗面内质网脱颗粒，多聚核蛋白体解聚，抑制蛋白的合成。为酶 活性降低的原因提供了又一种可能性。抗氧化能力减弱，氧自由基蓄积，脂质过氧化作用增 强，使溶酶体增多增大，功能过载，膜受损导致细胞崩解坏死。
, http://www.100md.com
资料表明，SOD是体内最重要的自由基清除剂之一。机体内主要有3种SOD，一种是以 铜离子和锌离子为活性中心，存在于胞浆中的Cu-Zn-SOD;一种是以锰离子为活性中心存在 于线粒体中的Mu-SOD;还有一种是以铁离子为活性中心的Fe-SOD。SOD能够催化超氧阴 离子自由基发生歧化反应，消除体内氧自由基的派生源，减轻自由基链式反应对机体的损害 [3]。实验研究证明作为体 内重要抗氧化酶的SOD，在酶的催化中起重要作用的辅基是铜。摄入SOD模型化合物络 合铜(MSOD)后，肾小管上皮细胞的超微病理损伤明显减轻。从亚细胞水平初步证实了 人工合成的MSOD对氟毒性肾脏有明显的拮抗和保护作用。其作用机制可能是铜是肾小管 重吸收中起主要作用酶系的重要成分，它可以改变某些酶的功能，降低生物膜对氟的通透性 ，减少细胞内氟量，减轻对肾脏的损伤。MSOD是根据天然Cu-Zn-SOD酶 活性部位来设计的模型化合物，其配位结构、性质及体外细胞活性与天然SOD非常相近， 不仅可以清除O-2，还能同时清除H2O2，防止它们转化为毒性更强的OH的 *O-2，保护膜不受损害[4，5]。它还能诱导内源性SOD的合成，使其 含量和生物活性增加，提高清除氟自由基的效率，拮抗了脂质过氧化，保护了生物膜的正常 功能。硼能拮抗过量氟对机体的损害的报道较多。本研究治疗对照组，在染氟同时食用硼砂 ，效果差于治疗组，间接地证明了MSOD的抗氟毒效果。MSOD的医学应用研究当续深 入。最佳剂量，摄入方法等都需进一步研究，以期获得更好效果。
, 百拇医药
[基金来源]国家自然科学基金( 39470632)
[作者简介]张 莉(1952-)，女，研究员。
[参考文献]
[1] 吕松岑，王志成，富 德，等.SOD模型配合物对过量染氟人胚肾培 养细胞的影响[J].中国地方病学杂志，1996，15(10)：24.
[2] 刘景林，莫志亚，赵永才，等.实验性氟中毒大鼠病理观察[J].中国 地方病防治杂志，1998，13(3)：147.
[3] 大柳善彦.SODと活性酸素调节剂-の药理作用と临床应用[M].东 京：日本医学馆，1989.61-455.
[4] 廖展如，刘长林，石巨恩.一类新的多铜酶的模型化合物[J].化学学 报，1995，1：37-41.
[5] 廖展如，刘宛林，刘长林，等.超氧化物歧化酶模拟化合物的生物活性 研究[J].生物化学与生物物理进展，1996，2：159-163.
[收稿日期]1999-10-15
[修订日期]2000-01-10, 百拇医药
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