茶多酚对矽尘处理大鼠肺胶原mRNA表达水平的影响
作者：何永华 赵伯阳 王广增
单位：何永华(湖南省劳动卫生职业病防治研究所劳动卫生科，长沙 410007)；赵伯阳 王广增(华北煤炭医学院卫生系)
关键词：茶多酚；石英；矽肺；胶原mRNA
卫生毒理学杂志000113
摘要 【目的】 从分子水平探讨茶多酚(GTP)抑制矽肺纤维化的机制。【方法】 使用人Proα1(Ⅰ)、Proα1(Ⅲ)型胶原cDNA探针，采用Northern杂交技术，观察矽尘处理大鼠在饮用不同剂量茶多酚饮水后，肺胶原mRNA水平。【结果】 经各剂量茶多酚处理染尘大鼠Proα1(Ⅰ)和Proα1(Ⅲ)表达水平均不同程度低于矽肺对照组大鼠，14 mg/ml GTP组下降最为明显。【结论】 GTP可能抑制矽肺肺胶原基因表达。
, 百拇医药
The effect of green tea polyphenols on expression levels of pulmonary collagen mRNA in rats treated by silica
HE Yong-Hua,ZHAO Bo-Yang,WANG Guan-Zeng.
(Hunan lnstitute of Occupational Health,Changsha,410007,China.)
Abstract:【Objective】 To Study the inlibition effect of GTP on the molcular mechanism of fibrogenesis in silicosis.【Methods】 Human Proα1(Ⅰ) and Proα1(Ⅲ) cDNA probes and Northern Blot hybridization were employed to determine the lung collagen mRNA levels in silica-treated rats, given various doses of green tea polyphenols(GTP) in drinking water.【Results】 It showed that Proα1(Ⅰ) and Pro α1(Ⅲ) mRNA levels of silica-treated rats given various doses of GTP were lower,particularly at dose of 14 mg/ml GTP,than those of the silicosis rats.【Conclusion】 It was saggested that GTP may inhibit the gene expression of lung collagen in silicosis.
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Key words:Green tea polyphenols;Silica;Silicosis;Collagen mRNA
矽肺的基本病理变化是肺组织胶原蛋白过度增生和积聚。在矽肺的发展过程中，Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达水平发生了明显改变[1，2]。众多研究表明抗氧化剂如汉防己甲素能清除自由基，抑制胶原基因表达，对大鼠实验性矽肺具有明显的防治作用[3]。根据同样原理，我们观察了茶多酚(green tea polyphenols,GTP)对染尘大鼠肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原α1型前胶原多肽[Proα1(Ⅰ)、Proα1(Ⅲ)]mRNA表达的影响，探讨GTP抑制矽肺纤维化的分子机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠，体重(200±20)g。由华北煤炭医学院实验动物中心提供。
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1.2 仪器及试剂 3MK冷冻离心机(Sigma产品)、LKB2310电泳仪(Bromma产品)、Lambda 3B紫外可见分光光度计(Perkin-Elmer)；硝酸纤维素(NC)膜(华美公司)、异硫氰酸胍、二乙基焦炭酸钠、十二烷基肌苷酸钠(Serva)、Prime-α-gene labelling system(Promega)、α-32P-dCTP(亚辉公司)、Proα1(Ⅰ) cDNA,Proα1(Ⅲ) cDNA(中国预防医科院劳卫所提供)。其插入片断分别为4.6、4.5 kB，重组位点均为EcoR1；GTP购于浙江农业大学，纯度大于95%，不含咖啡碱。
1.3 制备大鼠矽肺模型及给药 将大鼠随机分为10组，各剂量组分别给予GTP浓度为14、7、2.8 mg/ml的饮水(约合0.50、0.25、0.10 g/kg体重)，对照组给予单纯饮水。3天适应期后，各染尘组大鼠经气管内灌注50 mg/ml石英悬液1 ml,空白对照组以生理盐水代替石英尘。继续按上述剂量给予GTP饮水或单纯饮水，普通饲料喂养2至4个月。
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1.4 大鼠肺组织总RNA提取及转膜 处死大鼠，取出肺组织速冻。用改良胍酚法提取肺组织总RNA[5]，并取RNA样品于紫外可见光光度计测定A230、A260、A280，计算RNA浓度及纯度。取20 μg RNA样品在含甲醛的琼脂糖凝胶中电泳。电泳结束后于紫外灯下观察RNA的完整性。将NC膜覆盖在RNA样品的琼脂糖凝胶上，用毛细管洗脱法将RNA完全转移到NC膜上[5]，并干燥固定。
1.5 Northern杂交[6] 将结合RNA的NC膜编号，封于杂交管，加入预杂交液，预杂交24 h。再将标记好的cDNA探针加入杂交管中，42 ℃杂交24 h。取出膜，洗去非特异性结合的探针，置于暗盒中放射自显影。显影结果用图像分析系统作灰度分析。
1.6 统计分析方法 用SAS软件作方差分析。
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2 结果
2.1 RNA完整性及纯度 电泳后，样品18 S，28 S条带清晰可见，18 S与28 S条带比例接近2∶1。A260/A280比值均在1.8以上。表明RNA提取后无蛋白质或酚的污染。
2.2 Northern杂交结果(表1、表2)
表1 饮用GTP 2个月大鼠肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原α1前胶原多肽
mRNA的表达水平(密度值)(
±s) 组别
Proα1(Ⅰ)
Proα1(Ⅲ)
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空白对照组
8.8±1.4**
12.2±2.4*
矽尘对照组
16.7±2.3
18.1±3.7
GTP(mg/ml)
14
10.6±1.6**
14.2±2.4**
7
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11.6±1.9**
15.7±2.4**
2.8
14.0±3.7
16.5±2.7
n=3；与矽尘对照组比较，*P<0.05，**P<0.01表2 饮用GPT 4个月大鼠肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原α1前胶原多肽
mRNA的表达水平(密度值)(±s) 组别
Proα1(Ⅰ)
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Proα1(Ⅲ)
空白对照组
9.6±2.5**
12.4±2.2**
矽尘对照组
18.3±3.0
19.3±2.1
GTP(mg/ml)
14
12.6±2.2**
14.5±2.5**
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7
13.8±2.7**
16.0±3.1*
2.8
16.8±3.0
17.6±2.7
n=3；与矽尘对照组比较，*P<0.05，**P<0.01 大鼠染尘后，Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达水平均明显升高。其中2个月时矽尘对照组Proα(Ⅰ) mRNA比同期正常组增加1倍以上，4个月时矽尘对照组Proα1(Ⅰ) mRNA比同期正常组增加了将近1倍。GTP各组染尘大鼠的Proα1(Ⅰ) mRNA、Proα1(Ⅲ) mRNA水平有不同程度下降。14 mg/ml GTP、7 mg/ml GTP组与同期矽尘对照组相比，差异具有显著性(P<0.01或P<0.05)。
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3 讨论
Makela等[1]首次发现大鼠实验性矽肺组织中Ⅰ型胶原基因表达水平升高以来，矽肺研究取得了更深层次的进展。实验发现大鼠自染尘7天起，肺组织Proα1(Ⅰ) 、Proα1(Ⅲ) mRNA含量即开始增加，且Proα1(Ⅰ) mRNA的高峰在染尘后30 d。Proα1(Ⅲ) mRNA高峰在染尘后4～21 d，30 d后趋于平稳，并与矽肺组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原变化规律同步，显示胶原mRNA水平与胶原蛋白合成水平一致[2，7]。可以认为矽肺病变组织中胶原纤维的积聚是由于石英粉尘引起的胶原基因表达增强所致。因此，寻找抑制石英粉尘致胶原mRNA表达的药物，将使矽肺的防治更具方向性。
GTP是绿茶中提取的多酚类化合物，具有强大的清除自由基抗氧化性能，生物性能广泛[8]。本实验发现，较高剂量GTP组的染尘大鼠肺胶原的mRNA表达降低，按有效系数=(矽尘对照组-GTP某剂量组)/(矽尘对照组-空白对照组)计算，14 mg/ml GTP组Proα1(Ⅰ)，Proα1(Ⅲ) mRNA在4个月时，有效系数分别为68%和69%。
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有实验表明石英粉尘能促进体外培养的人胚肺成纤维细胞胶原mRNA合成，铜蓝蛋白和纤维粘连蛋白对胶原基因转录呈协同作用[9]。我们以前的实验表明GTP能降低染尘大鼠血清铜蓝蛋白活性，这可能与GTP抑制胶原基因表达有关；各期2.8 mg/ml GTP组染尘大鼠肺纤维化程度均比同期矽肺对照组低，然而本实验表明，2.8 mg/ml GTP组Proα1(Ⅰ)、Proα1(Ⅲ) mRNA却没有明显改变。提示GTP抑制矽肺纤维化不完全是因为GTP降低肺胶原基因表达所致，还有可能通过别的途径来发挥作用，如通过清除超氧阴离子自由基，使羟自由基产量减少，羟脯氨酸、羟赖氨酸合成受阻，胶原纤维不能大量产生并积聚。
参考文献
[1] Makela Jk,Vuorio E.Type α1 collagene messenger RNA levels in eperimental granulation tissue and silicosis.Med Biol,1986,64:15-26.
, 百拇医药
[2] 陈亚萍，李玉瑞.实验隆矽肺病变中Ⅰ型及Ⅲ型胶原基因表达的研究.卫生研究，1993，22：1-4.
[3] 王NFDA1兰，刚葆琪.尘肺防治药物.见：现代劳动卫生学.北京：人民卫生出版社，1994，92-98.
[4] 尤宝荣，刘秉慈，王海华，等.汉防己甲素对矽肺大鼠肺胶原代谢的作用.卫生研究，1996，25：201-203.
[5] Chomozgnski P,Sacchi N.Single step method of RNA isolation by acid Guanicyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem,1987,162:156-159.
[6] Thomas PS.Hybridization of denatured RNA and small DNA fragments transferred to nitrocellulose.Pro Natl Acad,1980,77:5201-5222.
[7] 胡汛，余兰，李玉瑞.矽肺大鼠肺组织Ⅰ型与Ⅲ型胶原含量及其比值变化的研究.卫生研究，1989，18：6-8.
[8] 陈为均，万圣勤，等.茶多酚药效研究概况.中草药，1993，24：493-499.
[9] 刘秉慈，尤宝荣，刘玉瑛，等.酮蓝蛋白及纤维粘连蛋白对石英粉尘促进胶原转录的协同作用.生物化学杂志，1993，9：190-193.
(收稿日期：1998-10-28), 百拇医药
单位：何永华(湖南省劳动卫生职业病防治研究所劳动卫生科，长沙 410007)；赵伯阳 王广增(华北煤炭医学院卫生系)
关键词：茶多酚；石英；矽肺；胶原mRNA
卫生毒理学杂志000113
摘要 【目的】 从分子水平探讨茶多酚(GTP)抑制矽肺纤维化的机制。【方法】 使用人Proα1(Ⅰ)、Proα1(Ⅲ)型胶原cDNA探针，采用Northern杂交技术，观察矽尘处理大鼠在饮用不同剂量茶多酚饮水后，肺胶原mRNA水平。【结果】 经各剂量茶多酚处理染尘大鼠Proα1(Ⅰ)和Proα1(Ⅲ)表达水平均不同程度低于矽肺对照组大鼠，14 mg/ml GTP组下降最为明显。【结论】 GTP可能抑制矽肺肺胶原基因表达。
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The effect of green tea polyphenols on expression levels of pulmonary collagen mRNA in rats treated by silica
HE Yong-Hua,ZHAO Bo-Yang,WANG Guan-Zeng.
(Hunan lnstitute of Occupational Health,Changsha,410007,China.)
Abstract:【Objective】 To Study the inlibition effect of GTP on the molcular mechanism of fibrogenesis in silicosis.【Methods】 Human Proα1(Ⅰ) and Proα1(Ⅲ) cDNA probes and Northern Blot hybridization were employed to determine the lung collagen mRNA levels in silica-treated rats, given various doses of green tea polyphenols(GTP) in drinking water.【Results】 It showed that Proα1(Ⅰ) and Pro α1(Ⅲ) mRNA levels of silica-treated rats given various doses of GTP were lower,particularly at dose of 14 mg/ml GTP,than those of the silicosis rats.【Conclusion】 It was saggested that GTP may inhibit the gene expression of lung collagen in silicosis.
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Key words:Green tea polyphenols;Silica;Silicosis;Collagen mRNA
矽肺的基本病理变化是肺组织胶原蛋白过度增生和积聚。在矽肺的发展过程中，Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达水平发生了明显改变[1，2]。众多研究表明抗氧化剂如汉防己甲素能清除自由基，抑制胶原基因表达，对大鼠实验性矽肺具有明显的防治作用[3]。根据同样原理，我们观察了茶多酚(green tea polyphenols,GTP)对染尘大鼠肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原α1型前胶原多肽[Proα1(Ⅰ)、Proα1(Ⅲ)]mRNA表达的影响，探讨GTP抑制矽肺纤维化的分子机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠，体重(200±20)g。由华北煤炭医学院实验动物中心提供。
, 百拇医药
1.2 仪器及试剂 3MK冷冻离心机(Sigma产品)、LKB2310电泳仪(Bromma产品)、Lambda 3B紫外可见分光光度计(Perkin-Elmer)；硝酸纤维素(NC)膜(华美公司)、异硫氰酸胍、二乙基焦炭酸钠、十二烷基肌苷酸钠(Serva)、Prime-α-gene labelling system(Promega)、α-32P-dCTP(亚辉公司)、Proα1(Ⅰ) cDNA,Proα1(Ⅲ) cDNA(中国预防医科院劳卫所提供)。其插入片断分别为4.6、4.5 kB，重组位点均为EcoR1；GTP购于浙江农业大学，纯度大于95%，不含咖啡碱。
1.3 制备大鼠矽肺模型及给药 将大鼠随机分为10组，各剂量组分别给予GTP浓度为14、7、2.8 mg/ml的饮水(约合0.50、0.25、0.10 g/kg体重)，对照组给予单纯饮水。3天适应期后，各染尘组大鼠经气管内灌注50 mg/ml石英悬液1 ml,空白对照组以生理盐水代替石英尘。继续按上述剂量给予GTP饮水或单纯饮水，普通饲料喂养2至4个月。
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1.4 大鼠肺组织总RNA提取及转膜 处死大鼠，取出肺组织速冻。用改良胍酚法提取肺组织总RNA[5]，并取RNA样品于紫外可见光光度计测定A230、A260、A280，计算RNA浓度及纯度。取20 μg RNA样品在含甲醛的琼脂糖凝胶中电泳。电泳结束后于紫外灯下观察RNA的完整性。将NC膜覆盖在RNA样品的琼脂糖凝胶上，用毛细管洗脱法将RNA完全转移到NC膜上[5]，并干燥固定。
1.5 Northern杂交[6] 将结合RNA的NC膜编号，封于杂交管，加入预杂交液，预杂交24 h。再将标记好的cDNA探针加入杂交管中，42 ℃杂交24 h。取出膜，洗去非特异性结合的探针，置于暗盒中放射自显影。显影结果用图像分析系统作灰度分析。
1.6 统计分析方法 用SAS软件作方差分析。
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2 结果
2.1 RNA完整性及纯度 电泳后，样品18 S，28 S条带清晰可见，18 S与28 S条带比例接近2∶1。A260/A280比值均在1.8以上。表明RNA提取后无蛋白质或酚的污染。
2.2 Northern杂交结果(表1、表2)
表1 饮用GTP 2个月大鼠肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原α1前胶原多肽
mRNA的表达水平(密度值)(
±s) 组别Proα1(Ⅰ)
Proα1(Ⅲ)
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空白对照组
8.8±1.4**
12.2±2.4*
矽尘对照组
16.7±2.3
18.1±3.7
GTP(mg/ml)
14
10.6±1.6**
14.2±2.4**
7
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11.6±1.9**
15.7±2.4**
2.8
14.0±3.7
16.5±2.7
n=3；与矽尘对照组比较，*P<0.05，**P<0.01表2 饮用GPT 4个月大鼠肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原α1前胶原多肽
mRNA的表达水平(密度值)(
±s) 组别Proα1(Ⅰ)
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Proα1(Ⅲ)
空白对照组
9.6±2.5**
12.4±2.2**
矽尘对照组
18.3±3.0
19.3±2.1
GTP(mg/ml)
14
12.6±2.2**
14.5±2.5**
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7
13.8±2.7**
16.0±3.1*
2.8
16.8±3.0
17.6±2.7
n=3；与矽尘对照组比较，*P<0.05，**P<0.01 大鼠染尘后，Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达水平均明显升高。其中2个月时矽尘对照组Proα(Ⅰ) mRNA比同期正常组增加1倍以上，4个月时矽尘对照组Proα1(Ⅰ) mRNA比同期正常组增加了将近1倍。GTP各组染尘大鼠的Proα1(Ⅰ) mRNA、Proα1(Ⅲ) mRNA水平有不同程度下降。14 mg/ml GTP、7 mg/ml GTP组与同期矽尘对照组相比，差异具有显著性(P<0.01或P<0.05)。
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3 讨论
Makela等[1]首次发现大鼠实验性矽肺组织中Ⅰ型胶原基因表达水平升高以来，矽肺研究取得了更深层次的进展。实验发现大鼠自染尘7天起，肺组织Proα1(Ⅰ) 、Proα1(Ⅲ) mRNA含量即开始增加，且Proα1(Ⅰ) mRNA的高峰在染尘后30 d。Proα1(Ⅲ) mRNA高峰在染尘后4～21 d，30 d后趋于平稳，并与矽肺组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原变化规律同步，显示胶原mRNA水平与胶原蛋白合成水平一致[2，7]。可以认为矽肺病变组织中胶原纤维的积聚是由于石英粉尘引起的胶原基因表达增强所致。因此，寻找抑制石英粉尘致胶原mRNA表达的药物，将使矽肺的防治更具方向性。
GTP是绿茶中提取的多酚类化合物，具有强大的清除自由基抗氧化性能，生物性能广泛[8]。本实验发现，较高剂量GTP组的染尘大鼠肺胶原的mRNA表达降低，按有效系数=(矽尘对照组-GTP某剂量组)/(矽尘对照组-空白对照组)计算，14 mg/ml GTP组Proα1(Ⅰ)，Proα1(Ⅲ) mRNA在4个月时，有效系数分别为68%和69%。
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有实验表明石英粉尘能促进体外培养的人胚肺成纤维细胞胶原mRNA合成，铜蓝蛋白和纤维粘连蛋白对胶原基因转录呈协同作用[9]。我们以前的实验表明GTP能降低染尘大鼠血清铜蓝蛋白活性，这可能与GTP抑制胶原基因表达有关；各期2.8 mg/ml GTP组染尘大鼠肺纤维化程度均比同期矽肺对照组低，然而本实验表明，2.8 mg/ml GTP组Proα1(Ⅰ)、Proα1(Ⅲ) mRNA却没有明显改变。提示GTP抑制矽肺纤维化不完全是因为GTP降低肺胶原基因表达所致，还有可能通过别的途径来发挥作用，如通过清除超氧阴离子自由基，使羟自由基产量减少，羟脯氨酸、羟赖氨酸合成受阻，胶原纤维不能大量产生并积聚。
参考文献
[1] Makela Jk,Vuorio E.Type α1 collagene messenger RNA levels in eperimental granulation tissue and silicosis.Med Biol,1986,64:15-26.
, 百拇医药
[2] 陈亚萍，李玉瑞.实验隆矽肺病变中Ⅰ型及Ⅲ型胶原基因表达的研究.卫生研究，1993，22：1-4.
[3] 王NFDA1兰，刚葆琪.尘肺防治药物.见：现代劳动卫生学.北京：人民卫生出版社，1994，92-98.
[4] 尤宝荣，刘秉慈，王海华，等.汉防己甲素对矽肺大鼠肺胶原代谢的作用.卫生研究，1996，25：201-203.
[5] Chomozgnski P,Sacchi N.Single step method of RNA isolation by acid Guanicyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem,1987,162:156-159.
[6] Thomas PS.Hybridization of denatured RNA and small DNA fragments transferred to nitrocellulose.Pro Natl Acad,1980,77:5201-5222.
[7] 胡汛，余兰，李玉瑞.矽肺大鼠肺组织Ⅰ型与Ⅲ型胶原含量及其比值变化的研究.卫生研究，1989，18：6-8.
[8] 陈为均，万圣勤，等.茶多酚药效研究概况.中草药，1993，24：493-499.
[9] 刘秉慈，尤宝荣，刘玉瑛，等.酮蓝蛋白及纤维粘连蛋白对石英粉尘促进胶原转录的协同作用.生物化学杂志，1993，9：190-193.
(收稿日期：1998-10-28), 百拇医药