不同CMV分离物侵染寄主的超微结构变化
作者：洪健 陈集双 李德葆
单位：浙江大学生物技术研究所，杭州 310029)
关键词：黄瓜花叶病毒；卫星RNA；细胞病理学；电子显微镜
中国病毒学000111 摘 要：应用电镜观察了黄瓜花叶病毒CMV不同分离物侵染寄主的细胞 超微结构变化。来自一串红(Salvia splendens)的不含卫星RNA分离物M-22侵染心叶烟，病毒粒子散布于细胞质，在液泡中形成大片病毒粒子结晶，液泡膜边缘产生小泡结构，完整的病毒粒子穿过胞间连丝在细胞间运转，胞间连丝中央部分有扩张现象。自然感染三生烟的含坏死卫星RNA分离物8-S1侵染普通烟，病毒粒子分散于细胞质，在液泡中未观察到结晶体，叶绿体产生囊泡结构，部分病毒粒子处在叶绿体空泡中。田间寄主上受8-S1侵染的三生烟细胞质中分布着大量球形病毒粒子，叶绿体也产生含有病毒粒子的囊泡结构。表明含有卫星RNA和不含卫星RNA的CMV分离物引起的细胞病变特征存在差别，可能是CMV卫星RNA参与病理变化的依据之一。
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分类号：S432.41 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)01-0066-07
Ultrastructural Alteration of Host Plants Infected with
Different Cucumber Mosaic Virus Isolates
HONG Jian, CHEN Ji-shuang, LI De-bao
(Institute of Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China)
Abstract：The ultrastructural alterations caused by the infection of two cucumber mosaic virus isolates were investigated. Spherical virus particles of CMV M-22, an isolate originally from Salvia splendens, scattered through out the cytoplasm and aggregated into crystals in the vacuoles of tobacco cells. The existence of virus particles inside the chloroplast was not detected for this isolate. But virus particles were found being aggregated through the plasmodesma, that indicated the way of cell to cell movement of this isolate. Virus particles of CMV 8-S1, an isolate with necrosis satellite RNA and originally from naturally infected tobacco, scattered throughout the cytoplasm and in the vacuoles of abnormal chloroplasts. In the tobacco leaf cells natural-infected by CMV-8 in the field, numerous spherical particles and abnormal chloroplasts were observed. The results suggest that ultrastructural alterations induced by different CMV isolates are quite variable. This is a direct evidence of satellite RNA involve ment in pathogenic process by CMV.
, 百拇医药
Key words：Cucumber mosaic virus; Satellite RNA; Cytopathology; Electr on microscopy▲
黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus)属雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)黄瓜花叶病 毒属(Cucumovirus)，是我国十字花科、茄科、豆科及葫芦科蔬菜最主要的病毒病原之 一。CMV的寄主范围很广，可侵染1000多种单子叶和双子叶植物，我国也已从38科120多种植 物上分离到CMV。近年来国内学者在CMV株系及亚组鉴定、卫星RNA、分子生物学研究以及病 害 防治等方面取得了重要进展[1]，我们先后对来自十字花科、豆科、茄科作物及其 它花卉的不同CMV分离物进行了生物学、血清学和双链RNA比较研究[2～5]。为了 解不同分离物侵染寄主的细胞病理变化差异，探讨卫星RNA影响寄主症状的超微结构机制， 我们对来源于一串红的CMV分离物M-22(不含卫星RNA)和来源于三 生烟的分离物8-S1(含坏 死型卫星RNA)所引起的寄主细胞超微结构变化进行了电镜观察，现将实验结果报道如下。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 毒源
由一串红(Salvia splendens)上分离的M-22，经单斑分离纯化后人工接种于心叶烟( Nicotiana glutinosa)。由田间症状表现为饰纹、脉间严重坏死的三生烟(N.tabacum -Samsum)上分离的8-S1，经单斑分离纯化后人工接种于普通烟(N.tabacum)，该分 离物的原田间寄主编号为CMV-8。
1.2 提纯病毒的负染色
适当稀释的病毒提纯液用2%醋酸铀水溶液(pH5.0)负染色，或者先经0.2%多聚甲醛固定，再 用2%磷钨酸(pH6.8)负染色。在CMV悬液中加入少量TMV样品，用来比较测量病毒粒子的大小 。
1.3 寄主组织超薄切片
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用以上两个分离物和一个田间寄主为实验材料，分别取典型花叶症状的寄主叶片黄绿交 界部位，切成1mm2小片，用Karnovsky’ 2.5%戊二醛-2%多聚甲醛混合固定液预固定2～ 4h，再按Hatta等人[6]的方法，用2×SSC缓冲液配制的2μg/mL牛胰核糖核酸 酶RNase处理过夜，然后用1%四氧化锇后固定1～2h，常规脱水，Epon 812环氧树脂包埋， 超薄切片用醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色。
以上样品均在日本JEOL的JEM-1200EX型透射电镜下观察拍照。
2 结果
2.1 M-22分离物侵染心叶烟的细胞超微结构
由人工接种繁殖于心叶烟的M-22分离物经分离提纯后，用醋酸铀负染色的病毒粒子为球形 ，直径约30nm，呈现CMV粒子特有的“中心孔”结构，在电镜高倍放大下，可见表面的蛋 白质形态亚基(图1)。
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图1 提纯的CMV M-22分离物粒子，350000×
Fig.1 Purified virus particles of M-22, 350000×
由人工接种繁殖于心叶烟的M-22分离物经分离提纯后，用醋酸铀负染色的病毒粒子为球形 ，直径约30nm，呈现CMV粒子特有的“中心孔”结构，在电镜高倍放大下，可见表面的蛋 白质形态亚基(图1)。
在M-22接种感染的心叶烟叶片薄壁细胞及维管束组织中，大量球形病毒粒子散布于细胞质 中(图2)，高倍放大也能看到“中心孔”结构，粒子直径比负染时要小一些。细胞质中未见 到病毒粒子呈结晶状排列。病变的细胞有膜结构增生现象，在液泡膜边缘可见到一些内含纤 细丝状物的圆形或卵圆形小泡突入液泡中(图3)。有的细胞还有较大的膜状体紧邻液泡。细 胞的液泡明显增多，细胞质被大小不等的液泡分割成许多岛屿状，小液泡可以相互融合成大 的液泡，或者与细胞的中央液泡融合。病变严重的细胞产生空泡化现象，细胞器解体，病毒 粒子形成不同大小的聚集体，有的聚集体有膜包围。在中央液泡内可观察到大块呈结晶状排 列的病毒粒子(图4A，4B)，病毒结晶体呈多边形或不规则形，大小不等，有的可达数微米， 外周无膜。细胞核的形态无特殊变化，核内未观察到病毒粒子。线粒体内脊产生肿胀。叶绿 体多数呈正常的梭形，基粒片层和基质片层较发达，排列有序，有许多淀粉颗粒和质体小球 积累(图5)。在一些薄壁细胞的细胞壁上，观察到发达的胞间连丝结构，一些完整的病毒颗 粒处在胞间连丝中，有的胞间连丝中央部分扩展，容纳了多层病毒粒子。在紧邻着胞间连丝 的细胞膜处，观察到类似管状物的结构(图6)。
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图2 M-22分离物感染的心叶烟，示病毒粒子散布于细胞质中，55000×
Fig.2 Thin section of Nicotiana glutinosa leaf cells infected with the isolate M-22, showing virus particles scattered throughout the cytoplasm, 55 000×
图3 M-22分离物感染的心叶烟，示液泡膜边缘的小泡结构(箭头)，65000×
Fig.3 Material as in Fig.2, showing virus-specific vesicles attached to the to noplast (arrow), 65000×
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图4 M-22分离物感染的心叶烟，示液泡中的病毒结晶体，4A.28000×，4B.46000×
Fig.4 Material as in Fig.2, showing large crystals of virus particles in the central vacuole, 4A.28000×, 4B.46000×
图5 M-22分离物感染的心叶烟，示未显著病变的叶绿体，15000×
Fig.5 Material as in Fig.2, showing chloroplast with minor alteration, 15000 ×
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图6 M-22分离物感染的心叶烟，示处在胞间连丝中的病毒粒子(箭头)，75000×
Fig.6 Material as in Fig.2, showing virus particles in the plasmodesma (arrow), 75000×
2.2 8-S1分离物侵染普通烟的细胞超微结构
在带有坏死型卫星RNA的CMV分离物8-S1接种感染的普通烟叶片组织中，细胞的病变程度明 显较重，空泡化细胞较多，许多细胞器瓦解。在病变程度较轻的细胞中，大量球形病毒粒 子散布于细胞质中，或者形成小的聚集体(图7、8)。膜结构和液泡明显增生，在液泡膜边 缘也存在含纤细丝状物的小泡结构，但未在液泡中观察到病毒粒子的大块结晶体，也未在细 胞质中发现病毒结晶状排列。细胞核内未观察到病毒粒子。由于概率小，病毒穿过胞间连丝 的现象也未观察到。线粒体内脊肿胀。叶绿体发生明显病变，有的片层结构发育较差，缺 乏基粒；有的形态变得肿胀、畸形，片层结构疏松，排列混乱，淀粉颗粒和质体小球积累； 有的叶绿体产生大的空泡状结构，一些病毒粒子处在叶绿体空泡之中(图8)。随着细胞瓦解 ，叶绿体发生解体，外膜破裂，类囊体残片及淀粉粒散布于空泡化的细胞中(图9)。
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图7 8-S1分离物感染的普通烟，示液泡化细胞 中的病变叶绿体和病毒粒子小聚集体，20000×
Fig.7 Thin section of N.tabacum leaf cells infected with the 8-S1 iso late of CMV, showing abnormal chloroplasts and small virus aggregates in the cytopla sm, 20000×
图8 8-S1分离物感染的普通烟，示病毒粒子散
布于细胞质和叶绿体的泡状结构中(箭头)， 35000×
Fig.8 Material as in Fig.7, showing virus particles scattered throughout t he cytoplasm and in the vacuole of abnormal chloroplast (arrow), 35000×
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图9 8-S1分离物感染的普通烟，示瓦解细胞中的叶绿体残余片层、淀粉粒和病毒粒子，20 000×
Fig.9 Material as in Fig.7, showing broken lamellae, starch granule and virus p articles in disrupted cell, 20000×
2.3 田间发病寄主三生烟的细胞超微结构
在田间自然发病的三生烟(样品编号CMV-8)叶片组织中，细胞严重瓦解，大量球形病毒粒子散布在细胞质中，浓度非常高(图10)。细胞器特别是叶绿体结构被破坏，叶绿体的片层 结构发育程度差，病变后产生膨胀和囊泡化，片层疏松，排列混乱。一些病毒粒子存在于叶 绿体的囊泡之中(图11)，或者在叶绿体基质中(图12)。
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图10 CMV-8田间寄主三生烟，示瓦解的细胞中分布着大量CMV病毒粒子，30000×
Fig.10 Thin section of natural-infected N.tabacum-Samsum leaves fro m the field, showing numerous CMV particles in disrupted cell, 30000×
图11 田间寄主三生烟，示叶绿体疏松的片层、质体小球、空泡结构和其中的病毒粒子(箭 头)，25000×
Fig.11 Material as in Fig.10, showing the abnormal chloroplast with poorly rema ined lamellae, plastoglobulis, vacuoles and virus particles (arrow), 25000×
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图12 田间寄主三生烟，示瓦解的叶绿体中含有病毒粒子，30000×
Ch:叶绿体； CW:细胞壁； M:线粒体； PD:胞间连丝； S:淀粉粒； V:液泡
Fig.12 Material as in Fig.10, showing some virus particles in the disrupte d chloroplast, 30000×
Ch: chloroplast; CW: cell wall; M: mitochondria; PD: plasmodesma; S: starch gran ule; V: vacuole
3 讨论
有关CMV侵染寄主的细胞超微结构变化报道已见不少[7～10]，通过应用Hatta(1 979)的方法研究了同属的番茄不孕病毒(TAV)、花生矮化病毒(PSV)以及CMV的不同株系，已 基本明确了Cucumovirus属的细胞病理学效应。但由于CMV寄主范围很广，病毒株系复杂 ，其细胞病变特征亦有差异。Hatta和Francki等(1981)比较CMV的六个不同株系和TAV的三个 株系后发现：CMV的T株系在细胞质中有病毒结晶体，细胞核内也存在病毒；M株系造成叶绿 体形态变化，基粒片层发育较差；U株系在细胞质中发生病毒基质[9]。我们观察 到的M-22分离物符合CMV普通株系的特征，8-S1分离物与M株系有相似之处。
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本实验观察两个分离物的生物学、血清学以及双链RNA等特性已作过比较[3，11] 。M-22原寄主一串红症状表现为花叶、矮化、开花减少，分离物在心叶烟和普通烟上产 生系统花叶，在昆诺藜上产生局部枯斑。8-S1原田间寄主三生烟叶片上呈现饰纹、脉间严 重坏死症状，分离物在心叶烟、普通烟及黄瓜等寄主上除产生系统花叶外，还有坏死症状。两个分离物在血清学关系上也存在明显差异。抽提感病组织中的dsRNA，电泳分析发现8-S1 含有高浓度的卫星RNA，而M-22不含卫星RNA。8-S1分离物由于卫星RNA对辅助病毒以及寄 主之间产生一系列调节作用，加重了寄主的发病程度，超微结构表现为细胞明显瓦解，叶绿 体结构遭受严重破坏。田间样品CMV-8的细胞受损程度，尤其是叶绿体的囊泡化现象与人工 接种寄主的情况相似。M-22感染的寄主细胞虽然含有高浓度的病毒粒子，在液泡中还形成 大块病毒结晶体，但细胞损坏程度较轻，叶绿体畸变不明显。当然，这是我们在两个CMV分 离物上所观察到的现象，是否其它分离物也如此，需要继续研究以得到进一步的证实。
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植物病毒侵染对寄主叶绿体影响表现在阻碍叶绿体发育，使其发生聚集，外形肿胀、畸形， 类囊体排列混乱，质体小球数量增加。Reinero[12，13]报道TMV的外壳蛋白(C P)进入普通烟叶绿体内，并结合到类囊体膜的光系统Ⅱ上，阻止电子在传递链中的传递，降 解叶绿体，破坏了叶绿体结构和功能。朱水芳等[14]也报道CMV侵染的烟叶绿体 中CP浓度与花叶症状严重度成正相关，Hsu[15]报道CMV强毒株侵染后在叶绿体中 有CP积累，而弱毒株侵染后叶绿体中无CP积累，说明叶绿体的病变与CP直接相关。8-S1分 离物引起叶绿体严重畸形，可能与高浓度CP进入叶绿体有关。至于在畸形的叶绿体中出现完 整病毒粒子，可能是叶绿体畸变导致其包裹部分细胞质成分，也包入了病毒；或者是叶绿 体外膜破裂，细胞质组分进入类囊体结构之间。因为除了芜菁黄花叶病毒TYMV有证据表明在 叶绿体周边小泡中复制外，其它病毒的复制装配并不在叶绿体内。
在一些病变细胞中发现CMV粒子存在于胞间连丝，是病毒经由胞间连丝穿过细胞壁，在细胞 间短距离转运的直接证据。这在豇豆花叶病毒(CpMV)、萝卜花叶病毒(RaMV)、烟草环斑病毒 (TRSV)、番茄不孕病毒(TAV)等侵染的寄主细胞中也有报道[16]。植物病毒在细 胞间的运动是一个或几个病毒基因产物所操纵的一种主动运动过程，细胞与细胞之间的短距 离运动是以完整病毒粒子形式或以病毒核酸-运动蛋白复合体形式通过胞间连丝[17 ]。在CpMV侵染的寄主细胞中，常可看到由运动蛋白形成的管状物，病毒样颗粒成一列排 在 其中，在病毒编码的运动蛋白与胞间连丝相互作用下，发生扩展作用，使胞间连丝能够通过 物 质的最大孔径增加数倍，能通过完整的病毒粒子。我们实验中也观察到紧连着胞间连丝处有 类似运动蛋白管状结构。更有意义的是，在细胞壁中央部分的胞间连丝中有一群病毒粒子， 似乎其内部空间被拓展得更大，允许几个粒子并排通过，此种现象似与病毒粒子参与胞间连 丝的扩展起到“开门”作用有关。
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目前报道的CMV分离物相当多，但对卫星RNA影响寄主症状的机理了解还很有限。本实验从细 胞病变角度比较了含和不含卫星RNA两个分离物的特性，为探索CMV卫星RNA的病理作用提供 了初步证据。由于目前人们对CMV的复制装配、胞间转运等一系列细胞病理过程还不十分清 楚，需要结合免疫细胞化学及分子生物学技术作深入研究。■
基金项目：国家自然科学基金(No.39970067)和浙江省教委科研项目资助。本实验室楼兵干、方月鲜同志参与部分工作。
作者简介：洪健(1957-)，男，浙江宁波人，研究员，研究方向植物病理学。
参考文献：
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[17]李毅，陈章良.植物病毒胞间运动的分子生物学和细胞学研究进展[J].植物生理学通讯.1995，31(6)：463～469
收稿日期 ：1998-11-20
修稿日期：1999-01-14, 百拇医药
单位：浙江大学生物技术研究所，杭州 310029)
关键词：黄瓜花叶病毒；卫星RNA；细胞病理学；电子显微镜
中国病毒学000111 摘 要：应用电镜观察了黄瓜花叶病毒CMV不同分离物侵染寄主的细胞 超微结构变化。来自一串红(Salvia splendens)的不含卫星RNA分离物M-22侵染心叶烟，病毒粒子散布于细胞质，在液泡中形成大片病毒粒子结晶，液泡膜边缘产生小泡结构，完整的病毒粒子穿过胞间连丝在细胞间运转，胞间连丝中央部分有扩张现象。自然感染三生烟的含坏死卫星RNA分离物8-S1侵染普通烟，病毒粒子分散于细胞质，在液泡中未观察到结晶体，叶绿体产生囊泡结构，部分病毒粒子处在叶绿体空泡中。田间寄主上受8-S1侵染的三生烟细胞质中分布着大量球形病毒粒子，叶绿体也产生含有病毒粒子的囊泡结构。表明含有卫星RNA和不含卫星RNA的CMV分离物引起的细胞病变特征存在差别，可能是CMV卫星RNA参与病理变化的依据之一。
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分类号：S432.41 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)01-0066-07
Ultrastructural Alteration of Host Plants Infected with
Different Cucumber Mosaic Virus Isolates
HONG Jian, CHEN Ji-shuang, LI De-bao
(Institute of Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China)
Abstract：The ultrastructural alterations caused by the infection of two cucumber mosaic virus isolates were investigated. Spherical virus particles of CMV M-22, an isolate originally from Salvia splendens, scattered through out the cytoplasm and aggregated into crystals in the vacuoles of tobacco cells. The existence of virus particles inside the chloroplast was not detected for this isolate. But virus particles were found being aggregated through the plasmodesma, that indicated the way of cell to cell movement of this isolate. Virus particles of CMV 8-S1, an isolate with necrosis satellite RNA and originally from naturally infected tobacco, scattered throughout the cytoplasm and in the vacuoles of abnormal chloroplasts. In the tobacco leaf cells natural-infected by CMV-8 in the field, numerous spherical particles and abnormal chloroplasts were observed. The results suggest that ultrastructural alterations induced by different CMV isolates are quite variable. This is a direct evidence of satellite RNA involve ment in pathogenic process by CMV.
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Key words：Cucumber mosaic virus; Satellite RNA; Cytopathology; Electr on microscopy▲
黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus)属雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)黄瓜花叶病 毒属(Cucumovirus)，是我国十字花科、茄科、豆科及葫芦科蔬菜最主要的病毒病原之 一。CMV的寄主范围很广，可侵染1000多种单子叶和双子叶植物，我国也已从38科120多种植 物上分离到CMV。近年来国内学者在CMV株系及亚组鉴定、卫星RNA、分子生物学研究以及病 害 防治等方面取得了重要进展[1]，我们先后对来自十字花科、豆科、茄科作物及其 它花卉的不同CMV分离物进行了生物学、血清学和双链RNA比较研究[2～5]。为了 解不同分离物侵染寄主的细胞病理变化差异，探讨卫星RNA影响寄主症状的超微结构机制， 我们对来源于一串红的CMV分离物M-22(不含卫星RNA)和来源于三 生烟的分离物8-S1(含坏 死型卫星RNA)所引起的寄主细胞超微结构变化进行了电镜观察，现将实验结果报道如下。
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1 材料和方法
1.1 毒源
由一串红(Salvia splendens)上分离的M-22，经单斑分离纯化后人工接种于心叶烟( Nicotiana glutinosa)。由田间症状表现为饰纹、脉间严重坏死的三生烟(N.tabacum -Samsum)上分离的8-S1，经单斑分离纯化后人工接种于普通烟(N.tabacum)，该分 离物的原田间寄主编号为CMV-8。
1.2 提纯病毒的负染色
适当稀释的病毒提纯液用2%醋酸铀水溶液(pH5.0)负染色，或者先经0.2%多聚甲醛固定，再 用2%磷钨酸(pH6.8)负染色。在CMV悬液中加入少量TMV样品，用来比较测量病毒粒子的大小 。
1.3 寄主组织超薄切片
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用以上两个分离物和一个田间寄主为实验材料，分别取典型花叶症状的寄主叶片黄绿交 界部位，切成1mm2小片，用Karnovsky’ 2.5%戊二醛-2%多聚甲醛混合固定液预固定2～ 4h，再按Hatta等人[6]的方法，用2×SSC缓冲液配制的2μg/mL牛胰核糖核酸 酶RNase处理过夜，然后用1%四氧化锇后固定1～2h，常规脱水，Epon 812环氧树脂包埋， 超薄切片用醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色。
以上样品均在日本JEOL的JEM-1200EX型透射电镜下观察拍照。
2 结果
2.1 M-22分离物侵染心叶烟的细胞超微结构
由人工接种繁殖于心叶烟的M-22分离物经分离提纯后，用醋酸铀负染色的病毒粒子为球形 ，直径约30nm，呈现CMV粒子特有的“中心孔”结构，在电镜高倍放大下，可见表面的蛋 白质形态亚基(图1)。
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图1 提纯的CMV M-22分离物粒子，350000×
Fig.1 Purified virus particles of M-22, 350000×
由人工接种繁殖于心叶烟的M-22分离物经分离提纯后，用醋酸铀负染色的病毒粒子为球形 ，直径约30nm，呈现CMV粒子特有的“中心孔”结构，在电镜高倍放大下，可见表面的蛋 白质形态亚基(图1)。
在M-22接种感染的心叶烟叶片薄壁细胞及维管束组织中，大量球形病毒粒子散布于细胞质 中(图2)，高倍放大也能看到“中心孔”结构，粒子直径比负染时要小一些。细胞质中未见 到病毒粒子呈结晶状排列。病变的细胞有膜结构增生现象，在液泡膜边缘可见到一些内含纤 细丝状物的圆形或卵圆形小泡突入液泡中(图3)。有的细胞还有较大的膜状体紧邻液泡。细 胞的液泡明显增多，细胞质被大小不等的液泡分割成许多岛屿状，小液泡可以相互融合成大 的液泡，或者与细胞的中央液泡融合。病变严重的细胞产生空泡化现象，细胞器解体，病毒 粒子形成不同大小的聚集体，有的聚集体有膜包围。在中央液泡内可观察到大块呈结晶状排 列的病毒粒子(图4A，4B)，病毒结晶体呈多边形或不规则形，大小不等，有的可达数微米， 外周无膜。细胞核的形态无特殊变化，核内未观察到病毒粒子。线粒体内脊产生肿胀。叶绿 体多数呈正常的梭形，基粒片层和基质片层较发达，排列有序，有许多淀粉颗粒和质体小球 积累(图5)。在一些薄壁细胞的细胞壁上，观察到发达的胞间连丝结构，一些完整的病毒颗 粒处在胞间连丝中，有的胞间连丝中央部分扩展，容纳了多层病毒粒子。在紧邻着胞间连丝 的细胞膜处，观察到类似管状物的结构(图6)。
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图2 M-22分离物感染的心叶烟，示病毒粒子散布于细胞质中，55000×
Fig.2 Thin section of Nicotiana glutinosa leaf cells infected with the isolate M-22, showing virus particles scattered throughout the cytoplasm, 55 000×
图3 M-22分离物感染的心叶烟，示液泡膜边缘的小泡结构(箭头)，65000×
Fig.3 Material as in Fig.2, showing virus-specific vesicles attached to the to noplast (arrow), 65000×
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图4 M-22分离物感染的心叶烟，示液泡中的病毒结晶体，4A.28000×，4B.46000×
Fig.4 Material as in Fig.2, showing large crystals of virus particles in the central vacuole, 4A.28000×, 4B.46000×
图5 M-22分离物感染的心叶烟，示未显著病变的叶绿体，15000×
Fig.5 Material as in Fig.2, showing chloroplast with minor alteration, 15000 ×
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图6 M-22分离物感染的心叶烟，示处在胞间连丝中的病毒粒子(箭头)，75000×
Fig.6 Material as in Fig.2, showing virus particles in the plasmodesma (arrow), 75000×
2.2 8-S1分离物侵染普通烟的细胞超微结构
在带有坏死型卫星RNA的CMV分离物8-S1接种感染的普通烟叶片组织中，细胞的病变程度明 显较重，空泡化细胞较多，许多细胞器瓦解。在病变程度较轻的细胞中，大量球形病毒粒 子散布于细胞质中，或者形成小的聚集体(图7、8)。膜结构和液泡明显增生，在液泡膜边 缘也存在含纤细丝状物的小泡结构，但未在液泡中观察到病毒粒子的大块结晶体，也未在细 胞质中发现病毒结晶状排列。细胞核内未观察到病毒粒子。由于概率小，病毒穿过胞间连丝 的现象也未观察到。线粒体内脊肿胀。叶绿体发生明显病变，有的片层结构发育较差，缺 乏基粒；有的形态变得肿胀、畸形，片层结构疏松，排列混乱，淀粉颗粒和质体小球积累； 有的叶绿体产生大的空泡状结构，一些病毒粒子处在叶绿体空泡之中(图8)。随着细胞瓦解 ，叶绿体发生解体，外膜破裂，类囊体残片及淀粉粒散布于空泡化的细胞中(图9)。
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图7 8-S1分离物感染的普通烟，示液泡化细胞 中的病变叶绿体和病毒粒子小聚集体，20000×
Fig.7 Thin section of N.tabacum leaf cells infected with the 8-S1 iso late of CMV, showing abnormal chloroplasts and small virus aggregates in the cytopla sm, 20000×
图8 8-S1分离物感染的普通烟，示病毒粒子散
布于细胞质和叶绿体的泡状结构中(箭头)， 35000×
Fig.8 Material as in Fig.7, showing virus particles scattered throughout t he cytoplasm and in the vacuole of abnormal chloroplast (arrow), 35000×
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图9 8-S1分离物感染的普通烟，示瓦解细胞中的叶绿体残余片层、淀粉粒和病毒粒子，20 000×
Fig.9 Material as in Fig.7, showing broken lamellae, starch granule and virus p articles in disrupted cell, 20000×
2.3 田间发病寄主三生烟的细胞超微结构
在田间自然发病的三生烟(样品编号CMV-8)叶片组织中，细胞严重瓦解，大量球形病毒粒子散布在细胞质中，浓度非常高(图10)。细胞器特别是叶绿体结构被破坏，叶绿体的片层 结构发育程度差，病变后产生膨胀和囊泡化，片层疏松，排列混乱。一些病毒粒子存在于叶 绿体的囊泡之中(图11)，或者在叶绿体基质中(图12)。
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图10 CMV-8田间寄主三生烟，示瓦解的细胞中分布着大量CMV病毒粒子，30000×
Fig.10 Thin section of natural-infected N.tabacum-Samsum leaves fro m the field, showing numerous CMV particles in disrupted cell, 30000×
图11 田间寄主三生烟，示叶绿体疏松的片层、质体小球、空泡结构和其中的病毒粒子(箭 头)，25000×
Fig.11 Material as in Fig.10, showing the abnormal chloroplast with poorly rema ined lamellae, plastoglobulis, vacuoles and virus particles (arrow), 25000×
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图12 田间寄主三生烟，示瓦解的叶绿体中含有病毒粒子，30000×
Ch:叶绿体； CW:细胞壁； M:线粒体； PD:胞间连丝； S:淀粉粒； V:液泡
Fig.12 Material as in Fig.10, showing some virus particles in the disrupte d chloroplast, 30000×
Ch: chloroplast; CW: cell wall; M: mitochondria; PD: plasmodesma; S: starch gran ule; V: vacuole
3 讨论
有关CMV侵染寄主的细胞超微结构变化报道已见不少[7～10]，通过应用Hatta(1 979)的方法研究了同属的番茄不孕病毒(TAV)、花生矮化病毒(PSV)以及CMV的不同株系，已 基本明确了Cucumovirus属的细胞病理学效应。但由于CMV寄主范围很广，病毒株系复杂 ，其细胞病变特征亦有差异。Hatta和Francki等(1981)比较CMV的六个不同株系和TAV的三个 株系后发现：CMV的T株系在细胞质中有病毒结晶体，细胞核内也存在病毒；M株系造成叶绿 体形态变化，基粒片层发育较差；U株系在细胞质中发生病毒基质[9]。我们观察 到的M-22分离物符合CMV普通株系的特征，8-S1分离物与M株系有相似之处。
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本实验观察两个分离物的生物学、血清学以及双链RNA等特性已作过比较[3，11] 。M-22原寄主一串红症状表现为花叶、矮化、开花减少，分离物在心叶烟和普通烟上产 生系统花叶，在昆诺藜上产生局部枯斑。8-S1原田间寄主三生烟叶片上呈现饰纹、脉间严 重坏死症状，分离物在心叶烟、普通烟及黄瓜等寄主上除产生系统花叶外，还有坏死症状。两个分离物在血清学关系上也存在明显差异。抽提感病组织中的dsRNA，电泳分析发现8-S1 含有高浓度的卫星RNA，而M-22不含卫星RNA。8-S1分离物由于卫星RNA对辅助病毒以及寄 主之间产生一系列调节作用，加重了寄主的发病程度，超微结构表现为细胞明显瓦解，叶绿 体结构遭受严重破坏。田间样品CMV-8的细胞受损程度，尤其是叶绿体的囊泡化现象与人工 接种寄主的情况相似。M-22感染的寄主细胞虽然含有高浓度的病毒粒子，在液泡中还形成 大块病毒结晶体，但细胞损坏程度较轻，叶绿体畸变不明显。当然，这是我们在两个CMV分 离物上所观察到的现象，是否其它分离物也如此，需要继续研究以得到进一步的证实。
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植物病毒侵染对寄主叶绿体影响表现在阻碍叶绿体发育，使其发生聚集，外形肿胀、畸形， 类囊体排列混乱，质体小球数量增加。Reinero[12，13]报道TMV的外壳蛋白(C P)进入普通烟叶绿体内，并结合到类囊体膜的光系统Ⅱ上，阻止电子在传递链中的传递，降 解叶绿体，破坏了叶绿体结构和功能。朱水芳等[14]也报道CMV侵染的烟叶绿体 中CP浓度与花叶症状严重度成正相关，Hsu[15]报道CMV强毒株侵染后在叶绿体中 有CP积累，而弱毒株侵染后叶绿体中无CP积累，说明叶绿体的病变与CP直接相关。8-S1分 离物引起叶绿体严重畸形，可能与高浓度CP进入叶绿体有关。至于在畸形的叶绿体中出现完 整病毒粒子，可能是叶绿体畸变导致其包裹部分细胞质成分，也包入了病毒；或者是叶绿 体外膜破裂，细胞质组分进入类囊体结构之间。因为除了芜菁黄花叶病毒TYMV有证据表明在 叶绿体周边小泡中复制外，其它病毒的复制装配并不在叶绿体内。
在一些病变细胞中发现CMV粒子存在于胞间连丝，是病毒经由胞间连丝穿过细胞壁，在细胞 间短距离转运的直接证据。这在豇豆花叶病毒(CpMV)、萝卜花叶病毒(RaMV)、烟草环斑病毒 (TRSV)、番茄不孕病毒(TAV)等侵染的寄主细胞中也有报道[16]。植物病毒在细 胞间的运动是一个或几个病毒基因产物所操纵的一种主动运动过程，细胞与细胞之间的短距 离运动是以完整病毒粒子形式或以病毒核酸-运动蛋白复合体形式通过胞间连丝[17 ]。在CpMV侵染的寄主细胞中，常可看到由运动蛋白形成的管状物，病毒样颗粒成一列排 在 其中，在病毒编码的运动蛋白与胞间连丝相互作用下，发生扩展作用，使胞间连丝能够通过 物 质的最大孔径增加数倍，能通过完整的病毒粒子。我们实验中也观察到紧连着胞间连丝处有 类似运动蛋白管状结构。更有意义的是，在细胞壁中央部分的胞间连丝中有一群病毒粒子， 似乎其内部空间被拓展得更大，允许几个粒子并排通过，此种现象似与病毒粒子参与胞间连 丝的扩展起到“开门”作用有关。
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目前报道的CMV分离物相当多，但对卫星RNA影响寄主症状的机理了解还很有限。本实验从细 胞病变角度比较了含和不含卫星RNA两个分离物的特性，为探索CMV卫星RNA的病理作用提供 了初步证据。由于目前人们对CMV的复制装配、胞间转运等一系列细胞病理过程还不十分清 楚，需要结合免疫细胞化学及分子生物学技术作深入研究。■
基金项目：国家自然科学基金(No.39970067)和浙江省教委科研项目资助。本实验室楼兵干、方月鲜同志参与部分工作。
作者简介：洪健(1957-)，男，浙江宁波人，研究员，研究方向植物病理学。
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收稿日期 ：1998-11-20
修稿日期：1999-01-14, 百拇医药