哺乳动物精子顶体反应检测考马斯亮蓝染色法
作者：卓丹心 林典梁 江一平
单位：卓丹心 解放军福州医学高等专科学校解剖学教研室(福州 350003)；林典梁 江一平 福建医科大学组织胚胎学教研室
关键词：精子；顶体反应；考马斯亮蓝
福建医科大学学报990337 顶体反应(acrosome reaction,AR)是精子在受精过程中经历的重要环节之一。在AR机理研究中，检测精子是否发生AR是生殖生物学和生殖医学中常用的研究手段。目前已建立了十多种较实用的AR检测技术，但由于精子及其顶体存在种间差异性，使许多方法在应用上都存在一些局限。近年来Moller[1]和Aarons[2,3]等报道采用考马斯亮蓝染色法来检测小鼠精子AR，作者等人先前已将此法移用于人精子AR的检测中[4]，方法简便、经济。本研究目的是为了推广考马斯亮蓝染色的适用范围，建立一种哺乳动物精子AR检测较通用简便的技术。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 成年雄性小鼠、大鼠和兔由福建省实验动物中心提供，金黄地鼠购自上海生物制品研究所，猪新鲜精液采集自福建省农科院畜牧所，人采用手淫法采集有生育力健康男性精液，常规分析符合WHO标准[5]。
1.1.2 主要试剂及配制
1.1.2.1 培养液 人精子采用BWW(含HSA 3.5 mg/ml),其他几种动物精子采用相应培养液[6]。
1.1.2.2 诱导顶体反应试剂 Ca2+载体A23187(Sigma,C7522)溶于二甲基亚砜(DMSO,Merk)，浓度1 mmol.L-1；孕酮(P，上海试剂二厂)溶于DMSO，浓度0.1 mg.ml-1；γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA，上海伯奥生物科技公司)溶于培养液中，浓度0.125 mmol.ml-1。
, 百拇医药
1.1.2.3 染色液 按先前报道方法[4]加于改良。0.05%考马斯亮蓝高氯染液：考马斯亮蓝R250(coomassie brilliant blue R250,CBB,Fluke)50 mg溶于蒸馏水96.5 ml中，煮沸溶解后加入高氯酸3.5 ml，0.45 μm滤膜过滤；0.05%考马斯亮蓝水溶染色液：考马斯亮蓝R250 50 mg溶于蒸馏水100 ml中，煮沸溶解，0.45 μm滤膜过滤。
1.2 方法
1.2.1 精子的采集和分离
小鼠、大鼠、金黄地鼠、兔开腹取附睾尾及输精管，吸取其中精液，加入相应培养液稀释,精子密度为(2～5)×109/L。猪精液离心后，沉淀精子用培养液悬浮，密度10×109/L。人精液采用SPA技术[7，8]分离活动良好精子，密度10×109/L。上述各种精子悬液即为0组(未获能组)。
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1.2.2 实验分组处理
精子悬液分装于0.5 ml容量的Eppendorf管，0.5 ml/管。1组(获能组)——37℃培养1 h；2组(A23187组)——加入1 mmol.L-1A23187 5 μl，终浓度为10 μmol.L-1，37℃培养1 h。
大鼠精子除0,1,2组外，另设两个处理组：3组(P组)——加入0.1 mg.ml-1孕酮P 5 μl，终浓度为1 μg.ml-1，37℃培养1 h；4组(GABA组)——加入0.125 mmol.ml-1GABA 5 μl，浓度为1.25 μmol.L-1，37℃培养1 h。
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1.2.3 考马斯亮蓝染色法
按先前报道[4]加以改良,即将考马斯亮蓝溶于3.5%高氯酸溶液，改为考马斯亮蓝先溶于水，而后添加3.5%高氯酸，同时将染色步骤由室温改为37℃水浴。染色液置于37℃水浴锅中预热10 min，将精子涂片(除大鼠外)置于CBB高氯酸染色液中浸染5～7 min；大鼠精子涂片于CBB水溶染色液中，37℃浸染30 min；染色后涂片用自来水冲洗即可，吹干，封片。
1.2.4 结果处理
对各种哺乳动物精子的染色形态进行拍照。大鼠精子各组进行考马斯亮蓝染色后，镜检计数>200个精子，记录AR率，对各组精子AR率进行组间差异方差分析。对A23187诱导组的各种哺乳动物精子染色标本，同一张涂片经5个人分别观察，各计数>200个精子，记录AR率，作批内变异系数。
2 结 果
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2.1 经CBB染色后，各种哺乳动物精子尾部都被染成紫蓝色，头部呈现出两种类型染色特征——A型和B型。A型精子顶体区成紫蓝色，顶体后区浅紫色；B型精子顶体区不染色或染浅紫色，顶体后区与A型相似(图1)。大鼠精子经CBB高氯酸染色液浸染难以分辨两种类型，而在CBB水溶液中呈现出A型与B型。各种精子在末获能组中均以A型为主，获能培养1 h后B型有增加趋势，经A23187诱导AR后，B型均有明显增加。这与先前报道的人精子结果一致[4]。
图1 各种哺乳动物精子CBB染色图像(×1000,油镜)
A：顶体完整; B：顶体反应
1.金黄地鼠; 2.小鼠; 3.大鼠; 4.兔; 5.猪; 6.人
2.2 大鼠精子未获能组，A型精子百分率最高。不同处理与未获能组比较，两类精子的构成比均发生改变。经获能培养和P、GABA、A23187诱导AR后，精子A型呈下降趋势，B型精子百分率呈相反趋势(图2)。
, 百拇医药
图2 大鼠精子不同处理组AR率比较
A ：顶替完整； B：顶替反应
a.与未获能组比较，P<0.01; b.与获能组比较，P<0.01.
2.3 5位观察者观察各种精子同一张经A23187诱导的染色标本，AR率和批内变异系数CV值见附表。
附表 各种精子A23187组AR率及CV值(n=5) 种 类
AR率(%)
CV(%)
小鼠
66.24
±
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3.93
5.93
大鼠
62.31
±
1.55
2.49
金黄地鼠
77.79
±
2.79
3.58
兔
, 百拇医药
22.97
±
1.74
7.58
猪
43.09
±
1.97
4.57
人
41.83
±
1.87
, 百拇医药
4.47
3 讨 论
考马斯亮蓝是常用的蛋白质染色剂，顶体内含有大量糖蛋白，可被染成紫蓝色。各种精子在获能培养前大部分(>80%)呈A型——顶体区紫蓝色。获能前的精子结构包括顶体在内应是完整的，所以A型精子当是顶体完整者；而经A23187诱导后，B型精子均有不同程度增加，B型——顶体区不染紫蓝色。A23187是公认的顶体反应诱导剂，经它作用后精子会发生AR而导致顶体丢失，B型精子可能是顶体反应者。CBB染色可区分这几种哺乳动物不同的顶体状态，B型精子的百分率可代表精子的AR率，而且经方法学实验表明，CBB染色批内变异系数低(附表)，说明这种方法可重复性好，结果可靠，可用于AR的检测实验。
大鼠精子在预实验中显示顶体在CBB高氯酸染色液中不着色或着色浅，难分辨，改用CBB水溶液后可区分A、B二型，为了对新的染色方法进行方法学检测，增设了两个处理组并作了组间差异方差分析。在各处理因素中，P是一种天然的AR诱导因子，它只能诱导获能后的精子发生AR，所以P组与获能组间差异无显著性；除A23187外，GABA的促进作用也很显著，GABA可促进人精子[9]和小鼠精子发生AR[10]。经这些诱导因素作用后，精子会发生AR而导致顶体丢失，B型精子的百分率可能代表着大鼠精子顶体反应的百分率，这与笔者先前对人精子的研究[4]一致。CBB水溶染色液的染色方法可以区分大鼠精子的不同顶体反应状态。
, http://www.100md.com
Aarons等[3]报道考马斯亮蓝对小鼠精子染色只需2 min，笔者按Aarons方法将CBB溶于3.5%高氯酸配成染色液，对人精子染色，室温下需30 min才能使顶体着色。对小鼠的染色结果亦然[4]。本文对先前方法加以改良，将染料先溶于水后加高氯酸，可提高考马斯亮蓝的溶解度；另外提高CBB高氯酸染色液温度至37℃，考马斯亮蓝随温度的上升溶解度也升高；基于这两个原因大大缩短了原来的染色时间，一般只需5～7 min。小鼠精子在这种情况下染2 min也完全能分辨A、B型。染料在配制过程中需经过滤，这样染出来的涂片背景干净，效果好。大鼠在CBB水溶液中染色效果好，但染色时间延长至30 min，这可能与种属的差异性有关。
迄今国内外常用的哺乳动物精子AR检测的方法，一种是凝集素PSA法，这种技术较为可靠，被广泛应用，但是试剂较昂贵，操作繁琐，另一种金霉素CTC法，近年来常有报道，它的试剂较廉价，但染色液需即配即用。这两种方法都存在着需荧光显微镜，标本难于长期存放，观察大量标本时极易疲劳等缺点。这些缺点使得它们在运用推广中有较大局限性，尤其是在一些临床和缺乏资金、仪器的基层单位中难于推广。通过本研究表明，CBB染色检测精子AR的技术，不仅适用于小鼠和人的精子，在其他几种哺乳动物中有一定的通用性，而且CBB染色在镜下对异常形态精子一目了然。这种方法具有操作简便，染色时间短，染液可低温保存、反复使用，标本可长期避光保存，普通显微镜即可镜检等优点，便于推广。当然，PSA法和CTC法二者除可区分未获能和AR型精子外，PSA法可分辨死精子，CTC法可区分获能型精子，而CBB染色法还无法分辨这两种类型，这些局限性有待进一步探讨。
, 百拇医药
参考文献
1 Moller CC, Bleil JD, Kinloch RA. et al. Structural and functional relationships between mouse and hamster zone pellucid glycoproteins. Dev Biol, 1990;137:276
2 Aarons D, Boettger-Tong H, Holt G. et al. Acrosome reaction induced by immunoaggregation of a proteins inhibitor bound to the murine sperm head. Mol Reprod Dev, 1991;30:258
3 Aarons D, Battle T, Boettger-Tong H. et al. Role of monoclonal antibody J-23 in inducing acrosome reactions in capacitated mouse spermatozoa. J Repord Fertil, 1992;96:49
, 百拇医药
4 江一平，卓丹心，陈 勇，等. 考马斯亮蓝染色法检测人精子顶体反应的评价. 解剖学报, 1998;29:332
5 世界卫生组织(编)，陈振文(译). 人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室手册. 第3版, 北京:科学出版社, 1994:30
6 菅原七朗. 哺乳动物发育工程实验方法. 南京：南京大学出版社, 1994:262
7 江一平, 余庆亮, 刘秀玲，等. 异种体外受精实验模型的建立及其方法学探讨. 福建医学院学报, 1991;25:297
8 江一平, 余庆亮, 李晓光，等. 精子穿透试验技术改良——小管体外授精及其效果评价. 福建医学院学报, 1994;28:301
9 王春年，刘海卫，袁玉英，等.γ-氨基丁酸诱发人精子顶体反应及其对若干离子转运影响的研究. 生殖与避孕, 1996;16:118
10 Shi QX, Roldan ERS. Evidence that GABAA-like receptor is involved in progesterone-induced acrosomal exocytosis in mouse spermatozoa. Biol Reprod, 1995;52:373
(收稿：1999-03-26 修回：1999-05-27), 百拇医药
单位：卓丹心 解放军福州医学高等专科学校解剖学教研室(福州 350003)；林典梁 江一平 福建医科大学组织胚胎学教研室
关键词：精子；顶体反应；考马斯亮蓝
福建医科大学学报990337 顶体反应(acrosome reaction,AR)是精子在受精过程中经历的重要环节之一。在AR机理研究中，检测精子是否发生AR是生殖生物学和生殖医学中常用的研究手段。目前已建立了十多种较实用的AR检测技术，但由于精子及其顶体存在种间差异性，使许多方法在应用上都存在一些局限。近年来Moller[1]和Aarons[2,3]等报道采用考马斯亮蓝染色法来检测小鼠精子AR，作者等人先前已将此法移用于人精子AR的检测中[4]，方法简便、经济。本研究目的是为了推广考马斯亮蓝染色的适用范围，建立一种哺乳动物精子AR检测较通用简便的技术。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 成年雄性小鼠、大鼠和兔由福建省实验动物中心提供，金黄地鼠购自上海生物制品研究所，猪新鲜精液采集自福建省农科院畜牧所，人采用手淫法采集有生育力健康男性精液，常规分析符合WHO标准[5]。
1.1.2 主要试剂及配制
1.1.2.1 培养液 人精子采用BWW(含HSA 3.5 mg/ml),其他几种动物精子采用相应培养液[6]。
1.1.2.2 诱导顶体反应试剂 Ca2+载体A23187(Sigma,C7522)溶于二甲基亚砜(DMSO,Merk)，浓度1 mmol.L-1；孕酮(P，上海试剂二厂)溶于DMSO，浓度0.1 mg.ml-1；γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA，上海伯奥生物科技公司)溶于培养液中，浓度0.125 mmol.ml-1。
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1.1.2.3 染色液 按先前报道方法[4]加于改良。0.05%考马斯亮蓝高氯染液：考马斯亮蓝R250(coomassie brilliant blue R250,CBB,Fluke)50 mg溶于蒸馏水96.5 ml中，煮沸溶解后加入高氯酸3.5 ml，0.45 μm滤膜过滤；0.05%考马斯亮蓝水溶染色液：考马斯亮蓝R250 50 mg溶于蒸馏水100 ml中，煮沸溶解，0.45 μm滤膜过滤。
1.2 方法
1.2.1 精子的采集和分离
小鼠、大鼠、金黄地鼠、兔开腹取附睾尾及输精管，吸取其中精液，加入相应培养液稀释,精子密度为(2～5)×109/L。猪精液离心后，沉淀精子用培养液悬浮，密度10×109/L。人精液采用SPA技术[7，8]分离活动良好精子，密度10×109/L。上述各种精子悬液即为0组(未获能组)。
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1.2.2 实验分组处理
精子悬液分装于0.5 ml容量的Eppendorf管，0.5 ml/管。1组(获能组)——37℃培养1 h；2组(A23187组)——加入1 mmol.L-1A23187 5 μl，终浓度为10 μmol.L-1，37℃培养1 h。
大鼠精子除0,1,2组外，另设两个处理组：3组(P组)——加入0.1 mg.ml-1孕酮P 5 μl，终浓度为1 μg.ml-1，37℃培养1 h；4组(GABA组)——加入0.125 mmol.ml-1GABA 5 μl，浓度为1.25 μmol.L-1，37℃培养1 h。
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1.2.3 考马斯亮蓝染色法
按先前报道[4]加以改良,即将考马斯亮蓝溶于3.5%高氯酸溶液，改为考马斯亮蓝先溶于水，而后添加3.5%高氯酸，同时将染色步骤由室温改为37℃水浴。染色液置于37℃水浴锅中预热10 min，将精子涂片(除大鼠外)置于CBB高氯酸染色液中浸染5～7 min；大鼠精子涂片于CBB水溶染色液中，37℃浸染30 min；染色后涂片用自来水冲洗即可，吹干，封片。
1.2.4 结果处理
对各种哺乳动物精子的染色形态进行拍照。大鼠精子各组进行考马斯亮蓝染色后，镜检计数>200个精子，记录AR率，对各组精子AR率进行组间差异方差分析。对A23187诱导组的各种哺乳动物精子染色标本，同一张涂片经5个人分别观察，各计数>200个精子，记录AR率，作批内变异系数。
2 结 果
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2.1 经CBB染色后，各种哺乳动物精子尾部都被染成紫蓝色，头部呈现出两种类型染色特征——A型和B型。A型精子顶体区成紫蓝色，顶体后区浅紫色；B型精子顶体区不染色或染浅紫色，顶体后区与A型相似(图1)。大鼠精子经CBB高氯酸染色液浸染难以分辨两种类型，而在CBB水溶液中呈现出A型与B型。各种精子在末获能组中均以A型为主，获能培养1 h后B型有增加趋势，经A23187诱导AR后，B型均有明显增加。这与先前报道的人精子结果一致[4]。
图1 各种哺乳动物精子CBB染色图像(×1000,油镜)
A：顶体完整; B：顶体反应
1.金黄地鼠; 2.小鼠; 3.大鼠; 4.兔; 5.猪; 6.人
2.2 大鼠精子未获能组，A型精子百分率最高。不同处理与未获能组比较，两类精子的构成比均发生改变。经获能培养和P、GABA、A23187诱导AR后，精子A型呈下降趋势，B型精子百分率呈相反趋势(图2)。
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图2 大鼠精子不同处理组AR率比较
A ：顶替完整； B：顶替反应
a.与未获能组比较，P<0.01; b.与获能组比较，P<0.01.
2.3 5位观察者观察各种精子同一张经A23187诱导的染色标本，AR率和批内变异系数CV值见附表。
附表 各种精子A23187组AR率及CV值(n=5) 种 类
AR率(%)
CV(%)
小鼠
66.24
±
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3.93
5.93
大鼠
62.31
±
1.55
2.49
金黄地鼠
77.79
±
2.79
3.58
兔
, 百拇医药
22.97
±
1.74
7.58
猪
43.09
±
1.97
4.57
人
41.83
±
1.87
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4.47
3 讨 论
考马斯亮蓝是常用的蛋白质染色剂，顶体内含有大量糖蛋白，可被染成紫蓝色。各种精子在获能培养前大部分(>80%)呈A型——顶体区紫蓝色。获能前的精子结构包括顶体在内应是完整的，所以A型精子当是顶体完整者；而经A23187诱导后，B型精子均有不同程度增加，B型——顶体区不染紫蓝色。A23187是公认的顶体反应诱导剂，经它作用后精子会发生AR而导致顶体丢失，B型精子可能是顶体反应者。CBB染色可区分这几种哺乳动物不同的顶体状态，B型精子的百分率可代表精子的AR率，而且经方法学实验表明，CBB染色批内变异系数低(附表)，说明这种方法可重复性好，结果可靠，可用于AR的检测实验。
大鼠精子在预实验中显示顶体在CBB高氯酸染色液中不着色或着色浅，难分辨，改用CBB水溶液后可区分A、B二型，为了对新的染色方法进行方法学检测，增设了两个处理组并作了组间差异方差分析。在各处理因素中，P是一种天然的AR诱导因子，它只能诱导获能后的精子发生AR，所以P组与获能组间差异无显著性；除A23187外，GABA的促进作用也很显著，GABA可促进人精子[9]和小鼠精子发生AR[10]。经这些诱导因素作用后，精子会发生AR而导致顶体丢失，B型精子的百分率可能代表着大鼠精子顶体反应的百分率，这与笔者先前对人精子的研究[4]一致。CBB水溶染色液的染色方法可以区分大鼠精子的不同顶体反应状态。
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Aarons等[3]报道考马斯亮蓝对小鼠精子染色只需2 min，笔者按Aarons方法将CBB溶于3.5%高氯酸配成染色液，对人精子染色，室温下需30 min才能使顶体着色。对小鼠的染色结果亦然[4]。本文对先前方法加以改良，将染料先溶于水后加高氯酸，可提高考马斯亮蓝的溶解度；另外提高CBB高氯酸染色液温度至37℃，考马斯亮蓝随温度的上升溶解度也升高；基于这两个原因大大缩短了原来的染色时间，一般只需5～7 min。小鼠精子在这种情况下染2 min也完全能分辨A、B型。染料在配制过程中需经过滤，这样染出来的涂片背景干净，效果好。大鼠在CBB水溶液中染色效果好，但染色时间延长至30 min，这可能与种属的差异性有关。
迄今国内外常用的哺乳动物精子AR检测的方法，一种是凝集素PSA法，这种技术较为可靠，被广泛应用，但是试剂较昂贵，操作繁琐，另一种金霉素CTC法，近年来常有报道，它的试剂较廉价，但染色液需即配即用。这两种方法都存在着需荧光显微镜，标本难于长期存放，观察大量标本时极易疲劳等缺点。这些缺点使得它们在运用推广中有较大局限性，尤其是在一些临床和缺乏资金、仪器的基层单位中难于推广。通过本研究表明，CBB染色检测精子AR的技术，不仅适用于小鼠和人的精子，在其他几种哺乳动物中有一定的通用性，而且CBB染色在镜下对异常形态精子一目了然。这种方法具有操作简便，染色时间短，染液可低温保存、反复使用，标本可长期避光保存，普通显微镜即可镜检等优点，便于推广。当然，PSA法和CTC法二者除可区分未获能和AR型精子外，PSA法可分辨死精子，CTC法可区分获能型精子，而CBB染色法还无法分辨这两种类型，这些局限性有待进一步探讨。
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参考文献
1 Moller CC, Bleil JD, Kinloch RA. et al. Structural and functional relationships between mouse and hamster zone pellucid glycoproteins. Dev Biol, 1990;137:276
2 Aarons D, Boettger-Tong H, Holt G. et al. Acrosome reaction induced by immunoaggregation of a proteins inhibitor bound to the murine sperm head. Mol Reprod Dev, 1991;30:258
3 Aarons D, Battle T, Boettger-Tong H. et al. Role of monoclonal antibody J-23 in inducing acrosome reactions in capacitated mouse spermatozoa. J Repord Fertil, 1992;96:49
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4 江一平，卓丹心，陈 勇，等. 考马斯亮蓝染色法检测人精子顶体反应的评价. 解剖学报, 1998;29:332
5 世界卫生组织(编)，陈振文(译). 人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室手册. 第3版, 北京:科学出版社, 1994:30
6 菅原七朗. 哺乳动物发育工程实验方法. 南京：南京大学出版社, 1994:262
7 江一平, 余庆亮, 刘秀玲，等. 异种体外受精实验模型的建立及其方法学探讨. 福建医学院学报, 1991;25:297
8 江一平, 余庆亮, 李晓光，等. 精子穿透试验技术改良——小管体外授精及其效果评价. 福建医学院学报, 1994;28:301
9 王春年，刘海卫，袁玉英，等.γ-氨基丁酸诱发人精子顶体反应及其对若干离子转运影响的研究. 生殖与避孕, 1996;16:118
10 Shi QX, Roldan ERS. Evidence that GABAA-like receptor is involved in progesterone-induced acrosomal exocytosis in mouse spermatozoa. Biol Reprod, 1995;52:373
(收稿：1999-03-26 修回：1999-05-27), 百拇医药