大鼠下丘脑室旁核和视上核内神经激肽B受体和加压素的共存研究*
作者：吕葆真 丁玉强 王 丹 张淼丽
单位：吕葆真 丁玉强 王 丹 张淼丽 第四军医大学解剖学教研室，梁FDA1琚脑研究中心，西安 710032
关键词：神经激肽B受体；加压素；共存；下丘脑室旁核；视上核；大鼠
解剖学报990208 【摘要】 目的 研究神经激肽B受体(NK3受体)免疫反应产物在大鼠下丘脑室旁核和视上核的分布及其与加压素的共存。 方法 免疫组织化学染色，标本在光镜和电镜下观察。共存研究采用相邻切片染色法。 结果 致密的NK3受体阳性产物分布于室旁核的后大细胞部和视上核的主部。免疫电镜观察发现NK3受体阳性反应产物出现于室旁核和视上核的胞体和树突内。在相邻切片上观察到室旁核和视上核内有相当数量的NK3受体阳性神经元，同时含有加压素，它们主要分布于室旁核的后大细胞部和视上核的主部。 结论 根据本研究和以往的机能学的研究结果，推测下丘脑室旁核和视上核内的NK3受体阳性神经元可能参与调控机体内环境改变时下丘脑加压素的释放。
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COEXISTENCE OF NEUROKININ B RECEPTOR(NK3)-LIKEIMMUNOREACTIVITY (-LI) WITH VASOPRESSIN-LI INTHE PARAVENTRICULAR AND SUPRAOPTICNUCLEI OF THE RAT HYPOTHALAMUS
Lü Baozhen,Ding Yuqing△,Wang Dan,Zhang Miaoli
(Department of Anatomy and K.K.Leung Brain Research Centre,The Fourth Military Medical University,Xi'an)
【Abstract】 Objective To examine the localizations of neurokinin B receptor(NK3)-like immunoreactivity (-LI) and its colocalization with vasopressin-LI in the paraventricular and supraoptic nuclei of the rat.Methods Immunohistochemical staining method;the samples were examined under light and electron microscopes.The colocalization of NK3 receptor-LI with vasopressin-LI was investigated through serial adjacent sections.Results The immunostaining showed that intense NK3 receptor-LI was found in the posterior magnocellular part of paraventricular nucleus and the principal part of the supraoptic nucleus.Electron microscopic observation indicated that NK3 receptor-LI was localized in the neuronal cell bodies and dendrites.In addition,a large number of neurons in the paraventricular and supraoptic nuclei were found to show both NK3 receptor-LI and vasopressin-LI,and the majority of them were distributed in the posterior magnocellular part of the paraventricular nucleus and the principal part of the supraoptic nucleus.Conclusion The present results suggest that NK3 receptor in the paraventricular and supraoptic nuclei of the rat hypothalamus may be involved in the modulation of the release of vasopressin from the hypothalamus when the internal environment is disturbed.
, 百拇医药
【Key words】 Neurokinin B receptor;Vasopressin; Colocalization; Paraventricular nucleus of the hypothalamus;Supraoptic nucleus;Rat
速激肽家族(tachykinin family)主要由P物质(SP)、K物质(亦称神经激肽A)和神经激肽B(neurokinin B,NKB)组成，它们在神经系统中乃至整个机体的生理活动中起着重要的作用[1～3]。在速激肽及其受体在神经系统内的作用研究中，有关SP及其受体在伤害性信息传递中的作用的文献最多，从在体到离体，从机能到形态都积累了大量的资料。与SP相比，对神经激肽B及其受体(NK3)的生理作用知之较少。主要可概括为以下3个方面：一是参与调节血压、呼吸、心率等自主神经系统的功能活动[4～8]；二是调节中枢神经系统内5-HT的释放而与运动调节有关；三是在脊髓和延髓后角浅层可能与初级伤害性信息调制有密切关系[9]。以往的研究显示，在脑室内注射NKB或NK3受体的激动剂可引起动物血压升高并产生抑制对盐的摄取等类似加压素的生理效应，且证明这些效应就是通过刺激下丘脑释放加压素引起的[8，10，11]。众所周知，加压素阳性神经元主要分布于下丘脑室旁核和视上核的大型神经内分泌细胞，它们合成的加压素通过视上垂体束释放于垂体后叶的血管内而发挥其生理效应。我们先前在普查NK3受体在大鼠脑内的分布的研究中发现室旁核和视上核内含有大量NK3受体阳性神经元[12]，提示下丘脑室旁核和视上核内NK3受体阳性神经元可能同时含有加压素。因此，本研究采用相邻切片染色方法对下丘脑视上核和室旁核内NK3受体和加压素之间的共存进行了研究。此外，由于室旁核和视上核根据其细胞构筑、纤维联系及其化学神经解剖学特点分为若干个亚核，而以往的研究尚未提及NK3受体在此两核亚核内分布特征，故本研究同时对此问题进行了探讨，并对NK3受体免疫反应产物的超微定位分布进行了观察。
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材料和方法
实验共用成年SD大鼠8只，体重200～250g，分为3组。第1组(2只)大鼠在腹腔内注射戊巴比妥钠(100mg/kg)的深麻醉状态下，开胸经升主动脉插管，先用100ml生理盐水冲净血液，然后用500ml含4%的多聚甲醛和0.5%苦味酸的0.1mol/L磷酸缓冲液(PB，pH7.4)，灌注固定1h。灌毕取出全脑，并在上述固定液内后固定2h(4℃)，然后置于含有30%蔗糖的0.1mol/L PB(pH7.4)内过夜。选取含下丘脑的脑块，冰冻冠状切片(厚40μm)。切片经0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)充分漂洗后，依次进入(1)0.5mg/L兔抗NK3受体多克隆抗体(关于此抗体的制备和鉴定，见文献[12])；(2)生物素标记的羊抗兔IgG(Vector,1∶200)；(3)ABC复合物(Vector,1∶200)。其中1抗和2抗用含1%驴血清和0.3%的Triton X-100的0.01mol/L的PBS(pH7.4)稀释，ABC复合物用0.3%的Triton X-100的0.01mol/L的PBS(pH7.4)稀释，最后切片在含0.05%的DAB和0.003%的H2O2的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.6)内呈色20～30min。部分免疫染色的切片经克紫复染，用此确定室旁核和视上核的NK3受体免疫反应产物在各亚核内的分布特征。第2组(2只)用于免疫电镜研究，动物的灌注固定同上，取材后经后固定3h后，振动切片机切片(厚50μm)。NK3受体免疫染色过程与上述的步骤基本相同，只是抗体稀释液内Trition X-100的浓度为0.05%。呈色后经锇酸固定1h，含70%酒精的饱和醋酸铀染色1h，梯度酒精和环氧丙烷脱水后Epon 812平板包埋、聚合。在解剖显微镜下取出视上核和室旁核，粘接于环氧树脂柱上，超薄切片裱于铜网上，枸橼酸铅染色后在Philips CM100电镜下观察并摄片。
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第3组(4只)的大鼠麻醉和灌注固定如前所述。将含有下丘脑的脑块置于干冰中速冻，然后用恒冷箱切片机切片(厚4μm)。将相邻的两张切片裱于同一张载波片上。1张切片作NK3受体免疫染色反应，反应步骤同上。1张切片作加压素免疫染色，除1抗为兔抗加压素外，其余反应过程包括1抗、2抗稀释和ABC反应过程同上述NK3受体免疫反应步骤。为防止孵育液蒸发，免疫染色过程在湿盒内进行。切片呈色后，经脱水透明和封片，在显微镜下观察NK3受体和加压素阳性神经元的分布并摄片。在洗印的照片上计数3种标记细胞的比例(NK3受体单标，加压素单标及NK3受体/加压素双标细胞)。
结 果
1. NK3受体阳性神经元在室旁核和视上核内的分布
NK3受体免疫染色结果显示，NK3受体样免疫反应神经元广泛分布于下丘脑内，包括下丘脑外侧区、背侧区、穹隆周核和乳头体等。在室旁核和视上核，致密的NK3受体免疫反应产物分布于室旁核的后大细胞部(posterior magnocellular part)和视上核的主部(principal part)(图1，2)。在室旁核的小细胞部，包括前、内、外和背小细胞部(图1)及视上核视交叉后部(retrochiasmatic part),分布有中等至浅淡的免疫反应产物。由于室旁核的后大细胞部和视上核主部内NK3受体阳性细胞排列密集，并且这些神经元的突起亦有免疫反应，因此在40μm厚的切片上很难判定阳性细胞的大小及数量。但在双标记实验的4μm厚切片上，可明确观察到阳性神经元的大小及免疫产物的定位分布特征，即阳性细胞均为大中型神经元(15～35μm)，免疫反应产物位于胞膜下，胞浆不着色或仅有少量反应产物。这种类型的神经元还散在分布于室旁核的内、外和背小细胞部，但在前小细胞部内未见此种细胞。此外，在视上核的视交叉后部内亦分布有一定数量的此类细胞。除这种大中型细胞外，在室旁核的小细胞部还可见到少量染色浅淡的小型阳性细胞(<15μm)。此外，在下丘脑前部的室旁核和视上核之间的脑区，还可见到少量中大型神经元集成团分布，即位于所谓的圆形核(circular nucleus)内。在此断面上，还可见到少量NK3受体阳性神经元围绕于血管周围。
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2. NK3受体样免疫成分在室旁核和视上核的超微定位分布
室旁核和视上核的免疫电镜观察发现，NK3受体免疫反应产物位于胞体和树突内，未见有轴突或胶质细胞呈现NK3受体免疫反应。在神经元的胞体内，免疫反应产物主要位于胞膜下，既分布于突触部位也见于非突触部位(图3)。胞浆内仅见到极少量的反应产物，胞核为阴性。此外，大量树突也含有NK3受体免疫反应产物，虽然大量反应产物位于树突膜下，但树突内的微管、线粒体等其他细胞器上亦附着有反应产物(图4)。
3. NK3受体和加压素在室旁核和视上核内的共存
由于NK3受体和加压素的抗体为同一种属，所以本研究采用相邻切片法观察了NK3受体和加压素在室旁核和视上核的共存。NK3受体和加压素阳性细胞在室旁核和视上核内的分布几乎完全重叠。同时含有NK3受体和加压素的神经元主要分布于室旁核的大细胞部(图5，6)和视上核的主部(图7，8)，少量分布于视上核的视交叉后部、室旁核的内、外和背小细胞部，下丘脑前部的圆形核和血管周围。在室旁核的后大细胞部，约有72%(140/195)的NK3受体神经元含有加压素，它们占此亚核内加压素细胞总数的55%(140/255)。在视上核的主部，约有46%(125/271)的NK3受体阳性神经元同时有加压素免疫反应，它们占加压素阳性细胞总数的40%(125/312)。
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图1，2 示NK3受体免疫反应产物在大鼠下丘脑室旁核(图1)和视上核(图2)内的分布。致密的阳性反应产物出现于室旁核的后大细胞部(PM)和视上核的主部(SO)。MP.室旁核内侧小细胞部 标尺示120μm
Figs.1,2 Showing the localization of NK3 receptor-LI in the paraventricular(Fig.1) and supraoptic(Fig.2)nuclei of the rat hypothalamus.Intense NK3-LI was distributed in the posterior magnocellular part of the paraventricular nucleus(PM) and the principal part of the supraoptic nucleus(SO).MP,medial parveocellular part of the paraventricular nucleus.Bar=120μm
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图3，4 示NK3受体免疫反应产物在大鼠下丘脑室旁核(图3)和视上核(图4)内的超微定位分布。反应产物定位于胞体的胞膜下(图3，箭头)和树突(De)内(图4)。N.细胞核 标尺示1μm(图3)和0.3μm(图4)
Figs.3,4 Showing the ultrastructural localization of NK3 receptor-LI in the paraventricular(Fig.3) and supraoptic(Fig.4) nuclei of the rat hypothalamus.Immunoreaction products(arrows) were mainly located under plasma membrane(Fig.3) and in dendrites(De,Fig.4).Bars=1μm in Fig.3 and 0.3 μm in Fig4.
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图5～8 示NK3受体(图5，7)与加压素(图6，8)在大鼠下丘脑室旁核(图5，6)和视上核(图7，8)内的共存。箭头示部分双标细胞。图5和图6及图7和图8分别为相邻切片像。标尺示30μm
Figs.5-8 Showing colocalization of NK3 receptor-LI(Figs.5 and 7) with vasopressin-LI(Figs.6 and 8)in the paraventricular(Figs5 and 6) and supraoptic nuclei(Figs.7 and 8) of the rat hypothalamus.A part of neurons with both NK3 receptor-LI and vasopressin-LI are indicated by arrows.Fig.5 and Fig.6,and Fig.7 and Fig.8 are adjacent sections,respectively.Bar=30μm
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讨 论
与我们[12]先前的研究相一致，本研究结果显示大量NK3受体阳性神经元定位于大鼠下丘脑室旁核和视上核。与先前研究相比，本研究进一步对此两核内NK3受体阳性神经元的大小和定位分布特征进行了观察。结果表明，室旁核和视上核的NK3阳性神经元主要分布于室旁核的后大细胞部和视上核的主部，且其中有相当部分属于中大型神经元。免疫电镜观察发现NK3受体免疫反应产物定于胞体和树突内。
根据以往对下丘脑室旁核和视上核神经元的分类研究，直径15～35μm的神经元为大型神经内分泌细胞(magnocellular neuroendocrine neuron),它们主要合成和分泌加压素和催产素[13，14]。在室旁核和视上核内，含有加压素的神经元具有明确的亚核定位分布特征，即主要分布于室旁核的后大细胞部和视上核的主部，少量散在分布于内、外和背小细胞部。与加压素阳性细胞的分布相一致，NK3受体阳性神经元亦主要分布于室旁核的后大细胞部和视上核主部，少量散在分布于内、外和背小细胞部。通过相邻切片的观察发现，有约1/2至3/4的NK3受体阳性神经元含有加压素。先前的生理和药理学研究表明，脑室内注射NKB或NK3受体的激动剂可抑制动物的盐欲，并可引起动物血压升高、心率加快等类似加压素的生理效应[4～6，8]，进一步研究发现，脑室内注射NKB或NK3受体的激动剂可引起动物血浆内加压素含量升高，并且它的升压效应可被施用加压素受体阻断剂所阻断[7]。根据本实验的结果和先前的机能学证据，推测NK3受体在机体内环境改变时，可能参与调节下丘脑室旁核和视上核的大神经内分泌细胞合成和分泌加压素。由于NK3受体是G蛋白偶联的受体[1，3]，它通过何种胞内机制来调节加压素合成和释放有待进一步研究。
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本研究还发现室旁核内除大神经内分泌细胞为NK3受体阳性外，还有一定数量的阳性小细胞分布于室旁核的小细胞部。众所周知，室旁核的小细胞部的主要功能是分泌多种释放激素和抑制激素来调节垂体前叶激素的合成与分泌的。目前尚无有关NK3受体在调节垂体前叶激素合成与分泌的研究报告。但本研究的结果为此提供了一个重要线索，即NK3受体可能与垂体前叶激素的释放之间存在某种联系。
关于NK3受体在下丘脑圆形核和血管周的分布及其与加压素共存的可能意义尚不清楚。迄今为止没有关于此两部位神经元的功能的报道，尽管有研究认为它们的轴突投射终止于正中隆起[13，14]，并发现在高渗盐水的刺激下，这些神经元亦表达FOS[15]，说明它们可能与机体内环境改变之间存在某种联系。
* 国家自然科学基金资助课题(No.39600045)
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本文照片的制作过程中得到原悦萍同志的协助，谨致谢忱。
参考文献
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单位：吕葆真 丁玉强 王 丹 张淼丽 第四军医大学解剖学教研室，梁FDA1琚脑研究中心，西安 710032
关键词：神经激肽B受体；加压素；共存；下丘脑室旁核；视上核；大鼠
解剖学报990208 【摘要】 目的 研究神经激肽B受体(NK3受体)免疫反应产物在大鼠下丘脑室旁核和视上核的分布及其与加压素的共存。 方法 免疫组织化学染色，标本在光镜和电镜下观察。共存研究采用相邻切片染色法。 结果 致密的NK3受体阳性产物分布于室旁核的后大细胞部和视上核的主部。免疫电镜观察发现NK3受体阳性反应产物出现于室旁核和视上核的胞体和树突内。在相邻切片上观察到室旁核和视上核内有相当数量的NK3受体阳性神经元，同时含有加压素，它们主要分布于室旁核的后大细胞部和视上核的主部。 结论 根据本研究和以往的机能学的研究结果，推测下丘脑室旁核和视上核内的NK3受体阳性神经元可能参与调控机体内环境改变时下丘脑加压素的释放。
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COEXISTENCE OF NEUROKININ B RECEPTOR(NK3)-LIKEIMMUNOREACTIVITY (-LI) WITH VASOPRESSIN-LI INTHE PARAVENTRICULAR AND SUPRAOPTICNUCLEI OF THE RAT HYPOTHALAMUS
Lü Baozhen,Ding Yuqing△,Wang Dan,Zhang Miaoli
(Department of Anatomy and K.K.Leung Brain Research Centre,The Fourth Military Medical University,Xi'an)
【Abstract】 Objective To examine the localizations of neurokinin B receptor(NK3)-like immunoreactivity (-LI) and its colocalization with vasopressin-LI in the paraventricular and supraoptic nuclei of the rat.Methods Immunohistochemical staining method;the samples were examined under light and electron microscopes.The colocalization of NK3 receptor-LI with vasopressin-LI was investigated through serial adjacent sections.Results The immunostaining showed that intense NK3 receptor-LI was found in the posterior magnocellular part of paraventricular nucleus and the principal part of the supraoptic nucleus.Electron microscopic observation indicated that NK3 receptor-LI was localized in the neuronal cell bodies and dendrites.In addition,a large number of neurons in the paraventricular and supraoptic nuclei were found to show both NK3 receptor-LI and vasopressin-LI,and the majority of them were distributed in the posterior magnocellular part of the paraventricular nucleus and the principal part of the supraoptic nucleus.Conclusion The present results suggest that NK3 receptor in the paraventricular and supraoptic nuclei of the rat hypothalamus may be involved in the modulation of the release of vasopressin from the hypothalamus when the internal environment is disturbed.
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【Key words】 Neurokinin B receptor;Vasopressin; Colocalization; Paraventricular nucleus of the hypothalamus;Supraoptic nucleus;Rat
速激肽家族(tachykinin family)主要由P物质(SP)、K物质(亦称神经激肽A)和神经激肽B(neurokinin B,NKB)组成，它们在神经系统中乃至整个机体的生理活动中起着重要的作用[1～3]。在速激肽及其受体在神经系统内的作用研究中，有关SP及其受体在伤害性信息传递中的作用的文献最多，从在体到离体，从机能到形态都积累了大量的资料。与SP相比，对神经激肽B及其受体(NK3)的生理作用知之较少。主要可概括为以下3个方面：一是参与调节血压、呼吸、心率等自主神经系统的功能活动[4～8]；二是调节中枢神经系统内5-HT的释放而与运动调节有关；三是在脊髓和延髓后角浅层可能与初级伤害性信息调制有密切关系[9]。以往的研究显示，在脑室内注射NKB或NK3受体的激动剂可引起动物血压升高并产生抑制对盐的摄取等类似加压素的生理效应，且证明这些效应就是通过刺激下丘脑释放加压素引起的[8，10，11]。众所周知，加压素阳性神经元主要分布于下丘脑室旁核和视上核的大型神经内分泌细胞，它们合成的加压素通过视上垂体束释放于垂体后叶的血管内而发挥其生理效应。我们先前在普查NK3受体在大鼠脑内的分布的研究中发现室旁核和视上核内含有大量NK3受体阳性神经元[12]，提示下丘脑室旁核和视上核内NK3受体阳性神经元可能同时含有加压素。因此，本研究采用相邻切片染色方法对下丘脑视上核和室旁核内NK3受体和加压素之间的共存进行了研究。此外，由于室旁核和视上核根据其细胞构筑、纤维联系及其化学神经解剖学特点分为若干个亚核，而以往的研究尚未提及NK3受体在此两核亚核内分布特征，故本研究同时对此问题进行了探讨，并对NK3受体免疫反应产物的超微定位分布进行了观察。
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材料和方法
实验共用成年SD大鼠8只，体重200～250g，分为3组。第1组(2只)大鼠在腹腔内注射戊巴比妥钠(100mg/kg)的深麻醉状态下，开胸经升主动脉插管，先用100ml生理盐水冲净血液，然后用500ml含4%的多聚甲醛和0.5%苦味酸的0.1mol/L磷酸缓冲液(PB，pH7.4)，灌注固定1h。灌毕取出全脑，并在上述固定液内后固定2h(4℃)，然后置于含有30%蔗糖的0.1mol/L PB(pH7.4)内过夜。选取含下丘脑的脑块，冰冻冠状切片(厚40μm)。切片经0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)充分漂洗后，依次进入(1)0.5mg/L兔抗NK3受体多克隆抗体(关于此抗体的制备和鉴定，见文献[12])；(2)生物素标记的羊抗兔IgG(Vector,1∶200)；(3)ABC复合物(Vector,1∶200)。其中1抗和2抗用含1%驴血清和0.3%的Triton X-100的0.01mol/L的PBS(pH7.4)稀释，ABC复合物用0.3%的Triton X-100的0.01mol/L的PBS(pH7.4)稀释，最后切片在含0.05%的DAB和0.003%的H2O2的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.6)内呈色20～30min。部分免疫染色的切片经克紫复染，用此确定室旁核和视上核的NK3受体免疫反应产物在各亚核内的分布特征。第2组(2只)用于免疫电镜研究，动物的灌注固定同上，取材后经后固定3h后，振动切片机切片(厚50μm)。NK3受体免疫染色过程与上述的步骤基本相同，只是抗体稀释液内Trition X-100的浓度为0.05%。呈色后经锇酸固定1h，含70%酒精的饱和醋酸铀染色1h，梯度酒精和环氧丙烷脱水后Epon 812平板包埋、聚合。在解剖显微镜下取出视上核和室旁核，粘接于环氧树脂柱上，超薄切片裱于铜网上，枸橼酸铅染色后在Philips CM100电镜下观察并摄片。
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第3组(4只)的大鼠麻醉和灌注固定如前所述。将含有下丘脑的脑块置于干冰中速冻，然后用恒冷箱切片机切片(厚4μm)。将相邻的两张切片裱于同一张载波片上。1张切片作NK3受体免疫染色反应，反应步骤同上。1张切片作加压素免疫染色，除1抗为兔抗加压素外，其余反应过程包括1抗、2抗稀释和ABC反应过程同上述NK3受体免疫反应步骤。为防止孵育液蒸发，免疫染色过程在湿盒内进行。切片呈色后，经脱水透明和封片，在显微镜下观察NK3受体和加压素阳性神经元的分布并摄片。在洗印的照片上计数3种标记细胞的比例(NK3受体单标，加压素单标及NK3受体/加压素双标细胞)。
结 果
1. NK3受体阳性神经元在室旁核和视上核内的分布
NK3受体免疫染色结果显示，NK3受体样免疫反应神经元广泛分布于下丘脑内，包括下丘脑外侧区、背侧区、穹隆周核和乳头体等。在室旁核和视上核，致密的NK3受体免疫反应产物分布于室旁核的后大细胞部(posterior magnocellular part)和视上核的主部(principal part)(图1，2)。在室旁核的小细胞部，包括前、内、外和背小细胞部(图1)及视上核视交叉后部(retrochiasmatic part),分布有中等至浅淡的免疫反应产物。由于室旁核的后大细胞部和视上核主部内NK3受体阳性细胞排列密集，并且这些神经元的突起亦有免疫反应，因此在40μm厚的切片上很难判定阳性细胞的大小及数量。但在双标记实验的4μm厚切片上，可明确观察到阳性神经元的大小及免疫产物的定位分布特征，即阳性细胞均为大中型神经元(15～35μm)，免疫反应产物位于胞膜下，胞浆不着色或仅有少量反应产物。这种类型的神经元还散在分布于室旁核的内、外和背小细胞部，但在前小细胞部内未见此种细胞。此外，在视上核的视交叉后部内亦分布有一定数量的此类细胞。除这种大中型细胞外，在室旁核的小细胞部还可见到少量染色浅淡的小型阳性细胞(<15μm)。此外，在下丘脑前部的室旁核和视上核之间的脑区，还可见到少量中大型神经元集成团分布，即位于所谓的圆形核(circular nucleus)内。在此断面上，还可见到少量NK3受体阳性神经元围绕于血管周围。
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2. NK3受体样免疫成分在室旁核和视上核的超微定位分布
室旁核和视上核的免疫电镜观察发现，NK3受体免疫反应产物位于胞体和树突内，未见有轴突或胶质细胞呈现NK3受体免疫反应。在神经元的胞体内，免疫反应产物主要位于胞膜下，既分布于突触部位也见于非突触部位(图3)。胞浆内仅见到极少量的反应产物，胞核为阴性。此外，大量树突也含有NK3受体免疫反应产物，虽然大量反应产物位于树突膜下，但树突内的微管、线粒体等其他细胞器上亦附着有反应产物(图4)。
3. NK3受体和加压素在室旁核和视上核内的共存
由于NK3受体和加压素的抗体为同一种属，所以本研究采用相邻切片法观察了NK3受体和加压素在室旁核和视上核的共存。NK3受体和加压素阳性细胞在室旁核和视上核内的分布几乎完全重叠。同时含有NK3受体和加压素的神经元主要分布于室旁核的大细胞部(图5，6)和视上核的主部(图7，8)，少量分布于视上核的视交叉后部、室旁核的内、外和背小细胞部，下丘脑前部的圆形核和血管周围。在室旁核的后大细胞部，约有72%(140/195)的NK3受体神经元含有加压素，它们占此亚核内加压素细胞总数的55%(140/255)。在视上核的主部，约有46%(125/271)的NK3受体阳性神经元同时有加压素免疫反应，它们占加压素阳性细胞总数的40%(125/312)。
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图1，2 示NK3受体免疫反应产物在大鼠下丘脑室旁核(图1)和视上核(图2)内的分布。致密的阳性反应产物出现于室旁核的后大细胞部(PM)和视上核的主部(SO)。MP.室旁核内侧小细胞部 标尺示120μm
Figs.1,2 Showing the localization of NK3 receptor-LI in the paraventricular(Fig.1) and supraoptic(Fig.2)nuclei of the rat hypothalamus.Intense NK3-LI was distributed in the posterior magnocellular part of the paraventricular nucleus(PM) and the principal part of the supraoptic nucleus(SO).MP,medial parveocellular part of the paraventricular nucleus.Bar=120μm
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图3，4 示NK3受体免疫反应产物在大鼠下丘脑室旁核(图3)和视上核(图4)内的超微定位分布。反应产物定位于胞体的胞膜下(图3，箭头)和树突(De)内(图4)。N.细胞核 标尺示1μm(图3)和0.3μm(图4)
Figs.3,4 Showing the ultrastructural localization of NK3 receptor-LI in the paraventricular(Fig.3) and supraoptic(Fig.4) nuclei of the rat hypothalamus.Immunoreaction products(arrows) were mainly located under plasma membrane(Fig.3) and in dendrites(De,Fig.4).Bars=1μm in Fig.3 and 0.3 μm in Fig4.
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图5～8 示NK3受体(图5，7)与加压素(图6，8)在大鼠下丘脑室旁核(图5，6)和视上核(图7，8)内的共存。箭头示部分双标细胞。图5和图6及图7和图8分别为相邻切片像。标尺示30μm
Figs.5-8 Showing colocalization of NK3 receptor-LI(Figs.5 and 7) with vasopressin-LI(Figs.6 and 8)in the paraventricular(Figs5 and 6) and supraoptic nuclei(Figs.7 and 8) of the rat hypothalamus.A part of neurons with both NK3 receptor-LI and vasopressin-LI are indicated by arrows.Fig.5 and Fig.6,and Fig.7 and Fig.8 are adjacent sections,respectively.Bar=30μm
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讨 论
与我们[12]先前的研究相一致，本研究结果显示大量NK3受体阳性神经元定位于大鼠下丘脑室旁核和视上核。与先前研究相比，本研究进一步对此两核内NK3受体阳性神经元的大小和定位分布特征进行了观察。结果表明，室旁核和视上核的NK3阳性神经元主要分布于室旁核的后大细胞部和视上核的主部，且其中有相当部分属于中大型神经元。免疫电镜观察发现NK3受体免疫反应产物定于胞体和树突内。
根据以往对下丘脑室旁核和视上核神经元的分类研究，直径15～35μm的神经元为大型神经内分泌细胞(magnocellular neuroendocrine neuron),它们主要合成和分泌加压素和催产素[13，14]。在室旁核和视上核内，含有加压素的神经元具有明确的亚核定位分布特征，即主要分布于室旁核的后大细胞部和视上核的主部，少量散在分布于内、外和背小细胞部。与加压素阳性细胞的分布相一致，NK3受体阳性神经元亦主要分布于室旁核的后大细胞部和视上核主部，少量散在分布于内、外和背小细胞部。通过相邻切片的观察发现，有约1/2至3/4的NK3受体阳性神经元含有加压素。先前的生理和药理学研究表明，脑室内注射NKB或NK3受体的激动剂可抑制动物的盐欲，并可引起动物血压升高、心率加快等类似加压素的生理效应[4～6，8]，进一步研究发现，脑室内注射NKB或NK3受体的激动剂可引起动物血浆内加压素含量升高，并且它的升压效应可被施用加压素受体阻断剂所阻断[7]。根据本实验的结果和先前的机能学证据，推测NK3受体在机体内环境改变时，可能参与调节下丘脑室旁核和视上核的大神经内分泌细胞合成和分泌加压素。由于NK3受体是G蛋白偶联的受体[1，3]，它通过何种胞内机制来调节加压素合成和释放有待进一步研究。
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本研究还发现室旁核内除大神经内分泌细胞为NK3受体阳性外，还有一定数量的阳性小细胞分布于室旁核的小细胞部。众所周知，室旁核的小细胞部的主要功能是分泌多种释放激素和抑制激素来调节垂体前叶激素的合成与分泌的。目前尚无有关NK3受体在调节垂体前叶激素合成与分泌的研究报告。但本研究的结果为此提供了一个重要线索，即NK3受体可能与垂体前叶激素的释放之间存在某种联系。
关于NK3受体在下丘脑圆形核和血管周的分布及其与加压素共存的可能意义尚不清楚。迄今为止没有关于此两部位神经元的功能的报道，尽管有研究认为它们的轴突投射终止于正中隆起[13，14]，并发现在高渗盐水的刺激下，这些神经元亦表达FOS[15]，说明它们可能与机体内环境改变之间存在某种联系。
* 国家自然科学基金资助课题(No.39600045)
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本文照片的制作过程中得到原悦萍同志的协助，谨致谢忱。
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