对类风湿因子具有高反应活性的热聚IgG的制备
作者：付春晓 陈长治 俞耀庭 吕宪禹
单位：付春晓(南开大学分子生物所生物活性材料开放实验室，天津 300071)；陈长治(南开大学分子生物所生物活性材料开放实验室，天津 300071)；俞耀庭(南开大学分子生物所生物活性材料开放实验室，天津 300071)；吕宪禹(南开大学分子生物所生物活性材料开放实验室，天津 300071)
关键词：热聚IgG；类风湿因子；高效液相凝胶色谱；酶联免疫吸附
中国免疫学杂志000311 摘 要：目的：优化热聚IgG的制备条件，提高对RF的检测灵敏度。方法：利用高效液相凝胶色谱和酶联免疫吸附技术研究加热条件对热聚IgG分子量分布及其对类风湿因子结合能力的影响。结果：将IgG溶液(10 mg/ml)在62℃热聚30 min，其优势聚合度为11左右，此时它对类风湿因子的结合能力最强。结论：应用高效液相凝胶色谱与ELISA技术，对热聚IgG体系进行分离测定和活性分析，缩短了测定时间，提高了结果的灵敏度和准确性。
, 百拇医药
中国图书分类号：R392.1
The preparation of heat-aggregated IgG with high reactivity to rheumatoid factors
FU Chun-Xiao CHEN Chang-Zhi YU Yao-Ting et al.
(Institute for Molecular Biology,Bioactive Material Research Laboratory of Nankai University,Tianjin 300071)
Abstract：Objective:To optimize the preparation conditions of heat-aggregated IgG for increasing the determination sensitivity of RFs.
, 百拇医药
Methods:Effect of heating conditions on molecular weight distribution of heat-aggregated IgG(HAIgG)and its reactivity to rheumatiod factors(RFs) was studied by gel-HPLC and ELISA,respectively.Results:The reactivity of HAIgG to RFs was correlative to size of aggregates and the optimal condition was to heat IgG solution (10 mg/ml) at 62℃ for 30 min.Conclusion:The authors made the MW determination and activity analysis for heat-aggregated IgG system by applying gel-HPLC and ELISA,the period of detection was decreased and the sensitivity and accuracy were improved.
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Key words：Heat-aggregated IgG Rheumatoid factors Gel-HPLC ELISA
热聚IgG是在一定温度条件下由IgG自身聚合而成的多聚体，它具有同类风湿因子(Rheumatoid factors,RF)反应的特性[1]，常用于血清中RF的检测。IgG的热聚条件直接影响产物的结构及其生物反应活性。本文旨在利用高效液相凝胶色谱和酶联免疫吸附技术研究热聚条件对产物分子量分布及其对RF结合能力的影响，优化制备条件，提高对RF检测的灵敏度。
1 材料与方法
1.1 材料 γ球蛋白注射液由中国医学科学院血液病研究所购得；RF-ELISA试剂盒由南京军区总医院购得；阳性类风湿血清由天津市第三中心医院提供。
1.2 方法
, 百拇医药
1.2.1 IgG的提纯 根据Flodint的方法，利用Sephadex G-200柱从γ球蛋白中提纯IgG[2]。
1.2.2 热聚IgG的制备 将IgG溶液(10 mg/ml)置一定温度的恒温水浴中保温一定时间，冰水冷却。
1.2.3 聚合度的测定 利用校正的TSK G-4000 HPLC色谱柱测定聚合物的分子量，计算聚合度。
1.2.4 对RF结合能力的测定 取热聚IgG溶液(2 mg/ml)0.2 ml，加入0.3 ml类风湿血清和0.2 ml生理盐水，混匀，室温反应1 h后转入4℃冰箱过夜。用ELISA 试剂盒测定反应前后体系中3种RF的浓度，计算RF被结合的量。
2 结果
2.1 热聚温度的确定 在聚合时间确定为30 min的条件下，IgG的热聚发生在60～64℃这样一个较窄的温度区间内。随着热聚温度的提高，聚合反应的程度加大，产物聚合度增加，对RF的结合能力增强。当热聚温度为62℃时，优势聚合度达11左右，对RF的结合能力最强。
, 百拇医药
2.2 热聚时间的确定 在聚合温度确定为62℃的条件下，热聚30 min的产物对RF的结合能力最强。继续延长加热时间，产物聚合度的增加，但对RF结合能力开始下降。当加热时间达120 min时，优势聚合度达22，聚合体系变成凝胶状，ELISA法无法测定其反应活性。
综上，对类风湿因子具有高结合能力的热聚IgG的制备条件是，将IgG溶液(10 mg/ml)在62℃下加热30 min。在该条件下，产物对IgMRF、IgGRF及IgARF的结合量分别达802、615和247 U/mg IgG。
表1 热聚温度对热聚IgG分子量及其同RF结合能力的影响
Tab.1 The effect of heating temperature on molecular weight of aggregated IgG and its RF-binding capacity Temperature (℃)
, http://www.100md.com
MW of aggregates (kD)
Aggregated degree
RF-binding amount (U/mg IgG)
IgMRF
IgGRF
IgARF
18
160
1
419
555
90
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45
160
1
614
615
82
56
160
1
742
615
82
60
320～2 2901)
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2～14
795
600
135
62
1 8202)
11
802
615
247
64
1 9002)
12
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712
580
172
Note:1)represents the continuous distribution of MW,no dominant aggregate;2)represents the dominant MW;The initial concentrations of IgMRF,IgGRF and IgARF were 1 290 U/ml,1 120 U/ml and 450 U/ml,respectibely表2 热聚时间对聚合IgG分子量及其同RF结合能力的影响
Tab.2 The effect of heating time on molecular weight of aggreated IgG and its RF-binding capacity Time (min)
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MW of aggregates (kD)
Aggregated degree
RF-binding amount (U/mg IgG)
IgMRF
IgGRF
IgARF
0
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1
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555
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14
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443
225
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3 6502)
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22------
3 讨论
3.1 热聚IgG实际上是由一系列不同聚合度的分子组成的混合物，其最高分子量可达107 D。该体系分子量分布的测定可采用光散射[3] 、葡萄糖密度梯度离心[4]、常压凝胶层析等方法[5]。其中光散射法只能给出体系的平均分子量；密度梯度离心法仅能分段给出部分聚合物的平均分子量；常压凝胶层析虽可获得较满意的结果，但样品用量大且耗时过长。鉴于上述方法的不足，本文采用装有TSK-G-4000柱的HPLC，不仅使分离测定的时间大大缩短，而且提高了分辨率。本文采用ELISA法评价了热聚IgG同RF的结合能力，较经典的免疫沉淀、免疫抑制及浊度分析相比，提高了灵敏度，而且可以分别检测出它对IgMRF、IgGRF及IgARF的结合能力，结果更为准确和全面。
3.2 RF因子是存在于类风湿关节炎患者血浆中的一类以自身变性IgG为靶细胞的抗体，能够与IgG分子Fc段上的抗原决定簇反应。热聚过程中，IgG发生构象改变，活性位点的数目和可及性提高，与RF的结合能力增强[6]，并在某一条件下达到最大值。继续强化热聚条件，产物的反应活性开始下降。这可能因为聚合度的进一步增大降低了反应位点的可及性，或是剧烈的变性条件造成了原有活性位点的破坏。
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基金项目：本课题受国家863计划资助，项目编号：863-715-0191
作者简介：付春晓，女，28岁，博士生，主要从事吸附材料研究；
俞耀庭，男，60岁，博士生导师，主要从事生物活性材料研究
作者单位：付春晓(现地址：北京海淀区太平路27#，北京 100850)
参考文献：
[1]Hannestad K.Rheumatoid factors reacting with autologous native γ G-globulin and joint fluid γ G aggregates .Clin Exp Immunol,1968;3:671
[2]Flodin P,Killander J.Fraction of human-serum proteins by gel filtration Biochim.Biophys Acta,1962;63:403
, 百拇医药
[3]Dorner R W,Alexander R L, Moore T L et al.Rheumatoid factors.Clin Chim Acta,1987;167:1
[4]McDougal J S,Redecha P B,Inman R D et al.Binding of immunoglobulin G aggregates and immune complexes in human serum to staphylococci containing protein A. J Clin Inves,1979;63:627
[5]Oreskes I,Mandel D.Size fraction of thermal aggregates of immunolglobulin G.Analytical Biochemistry,1983;134:199
[6]Augener W,Howard M G.Study on the mechanism of heat aggregation of human γ G.The Journal of Immunology,1970;105(4):1024
收稿日期：1998-08-06
修改日期：1999-11-08, 百拇医药
单位：付春晓(南开大学分子生物所生物活性材料开放实验室，天津 300071)；陈长治(南开大学分子生物所生物活性材料开放实验室，天津 300071)；俞耀庭(南开大学分子生物所生物活性材料开放实验室，天津 300071)；吕宪禹(南开大学分子生物所生物活性材料开放实验室，天津 300071)
关键词：热聚IgG；类风湿因子；高效液相凝胶色谱；酶联免疫吸附
中国免疫学杂志000311 摘 要：目的：优化热聚IgG的制备条件，提高对RF的检测灵敏度。方法：利用高效液相凝胶色谱和酶联免疫吸附技术研究加热条件对热聚IgG分子量分布及其对类风湿因子结合能力的影响。结果：将IgG溶液(10 mg/ml)在62℃热聚30 min，其优势聚合度为11左右，此时它对类风湿因子的结合能力最强。结论：应用高效液相凝胶色谱与ELISA技术，对热聚IgG体系进行分离测定和活性分析，缩短了测定时间，提高了结果的灵敏度和准确性。
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中国图书分类号：R392.1
The preparation of heat-aggregated IgG with high reactivity to rheumatoid factors
FU Chun-Xiao CHEN Chang-Zhi YU Yao-Ting et al.
(Institute for Molecular Biology,Bioactive Material Research Laboratory of Nankai University,Tianjin 300071)
Abstract：Objective:To optimize the preparation conditions of heat-aggregated IgG for increasing the determination sensitivity of RFs.
, 百拇医药
Methods:Effect of heating conditions on molecular weight distribution of heat-aggregated IgG(HAIgG)and its reactivity to rheumatiod factors(RFs) was studied by gel-HPLC and ELISA,respectively.Results:The reactivity of HAIgG to RFs was correlative to size of aggregates and the optimal condition was to heat IgG solution (10 mg/ml) at 62℃ for 30 min.Conclusion:The authors made the MW determination and activity analysis for heat-aggregated IgG system by applying gel-HPLC and ELISA,the period of detection was decreased and the sensitivity and accuracy were improved.
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Key words：Heat-aggregated IgG Rheumatoid factors Gel-HPLC ELISA
热聚IgG是在一定温度条件下由IgG自身聚合而成的多聚体，它具有同类风湿因子(Rheumatoid factors,RF)反应的特性[1]，常用于血清中RF的检测。IgG的热聚条件直接影响产物的结构及其生物反应活性。本文旨在利用高效液相凝胶色谱和酶联免疫吸附技术研究热聚条件对产物分子量分布及其对RF结合能力的影响，优化制备条件，提高对RF检测的灵敏度。
1 材料与方法
1.1 材料 γ球蛋白注射液由中国医学科学院血液病研究所购得；RF-ELISA试剂盒由南京军区总医院购得；阳性类风湿血清由天津市第三中心医院提供。
1.2 方法
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1.2.1 IgG的提纯 根据Flodint的方法，利用Sephadex G-200柱从γ球蛋白中提纯IgG[2]。
1.2.2 热聚IgG的制备 将IgG溶液(10 mg/ml)置一定温度的恒温水浴中保温一定时间，冰水冷却。
1.2.3 聚合度的测定 利用校正的TSK G-4000 HPLC色谱柱测定聚合物的分子量，计算聚合度。
1.2.4 对RF结合能力的测定 取热聚IgG溶液(2 mg/ml)0.2 ml，加入0.3 ml类风湿血清和0.2 ml生理盐水，混匀，室温反应1 h后转入4℃冰箱过夜。用ELISA 试剂盒测定反应前后体系中3种RF的浓度，计算RF被结合的量。
2 结果
2.1 热聚温度的确定 在聚合时间确定为30 min的条件下，IgG的热聚发生在60～64℃这样一个较窄的温度区间内。随着热聚温度的提高，聚合反应的程度加大，产物聚合度增加，对RF的结合能力增强。当热聚温度为62℃时，优势聚合度达11左右，对RF的结合能力最强。
, 百拇医药
2.2 热聚时间的确定 在聚合温度确定为62℃的条件下，热聚30 min的产物对RF的结合能力最强。继续延长加热时间，产物聚合度的增加，但对RF结合能力开始下降。当加热时间达120 min时，优势聚合度达22，聚合体系变成凝胶状，ELISA法无法测定其反应活性。
综上，对类风湿因子具有高结合能力的热聚IgG的制备条件是，将IgG溶液(10 mg/ml)在62℃下加热30 min。在该条件下，产物对IgMRF、IgGRF及IgARF的结合量分别达802、615和247 U/mg IgG。
表1 热聚温度对热聚IgG分子量及其同RF结合能力的影响
Tab.1 The effect of heating temperature on molecular weight of aggregated IgG and its RF-binding capacity Temperature (℃)
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MW of aggregates (kD)
Aggregated degree
RF-binding amount (U/mg IgG)
IgMRF
IgGRF
IgARF
18
160
1
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45
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1 8202)
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1 9002)
12
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712
580
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Note:1)represents the continuous distribution of MW,no dominant aggregate;2)represents the dominant MW;The initial concentrations of IgMRF,IgGRF and IgARF were 1 290 U/ml,1 120 U/ml and 450 U/ml,respectibely表2 热聚时间对聚合IgG分子量及其同RF结合能力的影响
Tab.2 The effect of heating time on molecular weight of aggreated IgG and its RF-binding capacity Time (min)
, 百拇医药
MW of aggregates (kD)
Aggregated degree
RF-binding amount (U/mg IgG)
IgMRF
IgGRF
IgARF
0
160
1
419
555
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10
320～2 2901)
2～14
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, 百拇医药
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3 讨论
3.1 热聚IgG实际上是由一系列不同聚合度的分子组成的混合物，其最高分子量可达107 D。该体系分子量分布的测定可采用光散射[3] 、葡萄糖密度梯度离心[4]、常压凝胶层析等方法[5]。其中光散射法只能给出体系的平均分子量；密度梯度离心法仅能分段给出部分聚合物的平均分子量；常压凝胶层析虽可获得较满意的结果，但样品用量大且耗时过长。鉴于上述方法的不足，本文采用装有TSK-G-4000柱的HPLC，不仅使分离测定的时间大大缩短，而且提高了分辨率。本文采用ELISA法评价了热聚IgG同RF的结合能力，较经典的免疫沉淀、免疫抑制及浊度分析相比，提高了灵敏度，而且可以分别检测出它对IgMRF、IgGRF及IgARF的结合能力，结果更为准确和全面。
3.2 RF因子是存在于类风湿关节炎患者血浆中的一类以自身变性IgG为靶细胞的抗体，能够与IgG分子Fc段上的抗原决定簇反应。热聚过程中，IgG发生构象改变，活性位点的数目和可及性提高，与RF的结合能力增强[6]，并在某一条件下达到最大值。继续强化热聚条件，产物的反应活性开始下降。这可能因为聚合度的进一步增大降低了反应位点的可及性，或是剧烈的变性条件造成了原有活性位点的破坏。
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基金项目：本课题受国家863计划资助，项目编号：863-715-0191
作者简介：付春晓，女，28岁，博士生，主要从事吸附材料研究；
俞耀庭，男，60岁，博士生导师，主要从事生物活性材料研究
作者单位：付春晓(现地址：北京海淀区太平路27#，北京 100850)
参考文献：
[1]Hannestad K.Rheumatoid factors reacting with autologous native γ G-globulin and joint fluid γ G aggregates .Clin Exp Immunol,1968;3:671
[2]Flodin P,Killander J.Fraction of human-serum proteins by gel filtration Biochim.Biophys Acta,1962;63:403
, 百拇医药
[3]Dorner R W,Alexander R L, Moore T L et al.Rheumatoid factors.Clin Chim Acta,1987;167:1
[4]McDougal J S,Redecha P B,Inman R D et al.Binding of immunoglobulin G aggregates and immune complexes in human serum to staphylococci containing protein A. J Clin Inves,1979;63:627
[5]Oreskes I,Mandel D.Size fraction of thermal aggregates of immunolglobulin G.Analytical Biochemistry,1983;134:199
[6]Augener W,Howard M G.Study on the mechanism of heat aggregation of human γ G.The Journal of Immunology,1970;105(4):1024
收稿日期：1998-08-06
修改日期：1999-11-08, 百拇医药