白念珠菌烯醇化酶的分离与纯化
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中华皮肤科杂志 2000年第5期第33卷
作者：唐宁枫 焦瑞清 吴绍熙 秦俊川 郭宁如
单位：唐宁枫 吴绍熙 郭宁如(210042南京，中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所)；焦端清 秦浚川(南京大学医药生物技术国家重点实验室)
关键词：
中华皮肤科杂志000526 烯醇化酶(enolase)，又称2-磷酸甘油水解酶，是糖酵解所必需的胞内酶，能催化磷酸甘油酸盐向磷酸烯醇式丙酮酸转变，同时也在糖异生过程中催化逆向反应。白念珠菌烯醇化酶具有高度的保守性，在白念珠菌系统感染时能激发机体产生特异的免疫反应，白念珠菌烯醇化酶的分离与纯化是研究它的前提和基础。
1：标准分子量2：白念珠菌全菌蛋白3：经硫酸铵沉淀后的菌体蛋白4：经DEAE-SephadexA-50凝胶柱(pH7.8)层析后的菌体蛋白5：经DEAE-SephadexA-50凝胶柱(pH8.4)层析后的菌体蛋白6：经ConA-Sepharose-4B凝胶柱层析后纯化的烯醇化酶
, 百拇医药
图1白念珠菌烯醇酶纯化过程
SDS-PAGE图
表1白念珠菌烯醇化酶的纯化
纯化步骤
总蛋白(mg)
总活性(U)
比活(U/mg)
得率(%)
破壁
32234.0
413234
12.8
, 百拇医药
100.0
硫酸胺沉淀
9106.0
322000
35.4
78.0
DEAE-Sephadex(pH7.8)
1784.0
198100
111.0
48.0
DEAE-Sephadex(pH8.0)
, 百拇医药
260.7
107840
403.9
26.0
ConA-Sepharose-4B
8.0
23600
2950.0
6.0
一、材料和方法
1.白念珠菌培养：实验用白念珠菌系真菌室保存的菌株。以液体沙堡培养基振荡培养24h得酵母悬液。
, 百拇医药 2.白念珠菌浓度计算：按比浊方法控制菌悬液浓度，最终浓度为1.5×109/mL，浊度相当于麦氏比浊管第1号管。
3.白念珠菌孢子的破壁：采用Lyticase酶解破壁法[1]。
4.白念珠菌可溶蛋白的硫酸胺沉淀分级盐析：以50%及75%的硫酸胺逐次沉淀蛋白液，离心后收集50%及75%硫酸胺溶液沉淀物，将其置于蒸馏水中过夜透析。
5.层析法：以浓度为10mmol/L，pH为7.8的Tris-HCl溶液平衡DEAE-SephadexA-50柱，将所得到的蛋白液过柱，流速为60mL/h，待流出穿过峰后以0.2mol/LNaCl洗柱，接含相对分子质量为47000蛋白的洗脱峰，用蒸馏水透析脱盐。以浓度为10mmol/L，pH8.0的Tris-HCl溶液平衡DEAE-SephadexA-50柱，将上步的洗脱峰过柱，流速为20mL/h，其余步骤同上。以浓度为10mmol/L,pH为7.4的Tris-HCl溶液平衡ConA-Sephrose-4B柱，以上步洗脱峰过柱，流速为15mL/h，接穿过峰。
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6.以SDS-PAGE电泳监测每一步分离纯化的过程，采用镀银法染色[1]。
7.蛋白浓度的测定采用考马斯亮蓝法和福林酚法[2]。
8.酶蛋白活性测定：采用体外模拟部分糖代谢反应链[3]。大体过程为烯醇化酶催化2-磷酸甘油酸形成磷酸烯醇式丙酮酸，磷酸烯醇式丙酮酸脱磷酸根为丙酮酸，在乳酸脱氢酶的作用下成为乳酸，同时伴有NADH+变为NAD和H+。以酿酒酵母烯醇化酶为标准(Us=227U/mg,pH=7.4，温度30℃)，用波长为340nm的分光光度计测定反应过程中单位时间内NADH转变为NAD的量，从而确定白念珠菌烯醇化酶的活性(Ua)。反应混合物为50mmol/LTris-HCl(pH为7.4)，5mmol/LMgCl2,2mmol/LEDTA,2mmol/LNADH,1.0mmol/LADP,10U丙酮酸激酶，10U乳酶脱氢酶及不同种烯醇化酶。反应总体积为1mL，反应温度为30℃。
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二、结果
经数步分离纯化去杂蛋白，得相对分子质量为47000的单一蛋白。纯化过程每一步的蛋白得率见表1。酶活性测定可得反应时间(t)-NADH变化曲线，量出初始NADH及t的变化量即ΔNADH和Δt，根据公式：Ua=(ΔNADHaΔts/ΔNADHsΔta)×Us计算出Ua为2950.0U/mg。
三、讨论
以前测定深部念珠菌感染患者血清中的抗体多采用白念珠菌的粗制抗原，这种方法的特异性较低，烯醇化酶抗原仅在白念珠菌感染过程中被释放出细胞，而且抗原性强，所以测定相应抗体可以大幅度提高诊断的准确性。Mitsutake等[4]比较了检测烯醇化酶抗原、甘露糖抗原、Cand-Tec抗原和1，3-β-D葡聚糖4种诊断念珠菌深部感染的方法，在39例血培养阳性患者中，28例可检测出烯醇化酶抗原，在20例健康者的标本中均未检测出抗原，敏感性和特异性分别为71.8%和100%。我们运用ConA-Sepharose-4B除去糖蛋白和在碱性条件下(pH7.8或8.3)用DEAE-SephadexA-50除去阴离子蛋白，并通过Sephadex的分子筛作用分离出单一的蛋白酶，其具有很高的活性，约比酿酒酵母烯醇化酶的活性高出10倍左右。
, 百拇医药
参考文献
[1]金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南.北京：科学出版社,1998.874-889.
[2]袁玉荪.生物化学实验.北京：高等教育出版社，1992.69-70.
[3]缪辉南，陈石根译.酶法分析手册.上海：上海科学技术出版社，1983.34-43.
[4] Mitsutake K, Miyazaki T, Tashiro T, et al. Enolase antigen, mannan antigen, cand- tec antigen, and β - glucan in patients with candidemia. J Clin Microbiol, 1996,34:1918- 1921.
(收稿日期：1999-09-06), 百拇医药
单位：唐宁枫 吴绍熙 郭宁如(210042南京，中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所)；焦端清 秦浚川(南京大学医药生物技术国家重点实验室)
关键词：
中华皮肤科杂志000526 烯醇化酶(enolase)，又称2-磷酸甘油水解酶，是糖酵解所必需的胞内酶，能催化磷酸甘油酸盐向磷酸烯醇式丙酮酸转变，同时也在糖异生过程中催化逆向反应。白念珠菌烯醇化酶具有高度的保守性，在白念珠菌系统感染时能激发机体产生特异的免疫反应，白念珠菌烯醇化酶的分离与纯化是研究它的前提和基础。
1：标准分子量2：白念珠菌全菌蛋白3：经硫酸铵沉淀后的菌体蛋白4：经DEAE-SephadexA-50凝胶柱(pH7.8)层析后的菌体蛋白5：经DEAE-SephadexA-50凝胶柱(pH8.4)层析后的菌体蛋白6：经ConA-Sepharose-4B凝胶柱层析后纯化的烯醇化酶
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图1白念珠菌烯醇酶纯化过程
SDS-PAGE图
表1白念珠菌烯醇化酶的纯化
纯化步骤
总蛋白(mg)
总活性(U)
比活(U/mg)
得率(%)
破壁
32234.0
413234
12.8
, 百拇医药
100.0
硫酸胺沉淀
9106.0
322000
35.4
78.0
DEAE-Sephadex(pH7.8)
1784.0
198100
111.0
48.0
DEAE-Sephadex(pH8.0)
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260.7
107840
403.9
26.0
ConA-Sepharose-4B
8.0
23600
2950.0
6.0
一、材料和方法
1.白念珠菌培养：实验用白念珠菌系真菌室保存的菌株。以液体沙堡培养基振荡培养24h得酵母悬液。
, 百拇医药 2.白念珠菌浓度计算：按比浊方法控制菌悬液浓度，最终浓度为1.5×109/mL，浊度相当于麦氏比浊管第1号管。
3.白念珠菌孢子的破壁：采用Lyticase酶解破壁法[1]。
4.白念珠菌可溶蛋白的硫酸胺沉淀分级盐析：以50%及75%的硫酸胺逐次沉淀蛋白液，离心后收集50%及75%硫酸胺溶液沉淀物，将其置于蒸馏水中过夜透析。
5.层析法：以浓度为10mmol/L，pH为7.8的Tris-HCl溶液平衡DEAE-SephadexA-50柱，将所得到的蛋白液过柱，流速为60mL/h，待流出穿过峰后以0.2mol/LNaCl洗柱，接含相对分子质量为47000蛋白的洗脱峰，用蒸馏水透析脱盐。以浓度为10mmol/L，pH8.0的Tris-HCl溶液平衡DEAE-SephadexA-50柱，将上步的洗脱峰过柱，流速为20mL/h，其余步骤同上。以浓度为10mmol/L,pH为7.4的Tris-HCl溶液平衡ConA-Sephrose-4B柱，以上步洗脱峰过柱，流速为15mL/h，接穿过峰。
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6.以SDS-PAGE电泳监测每一步分离纯化的过程，采用镀银法染色[1]。
7.蛋白浓度的测定采用考马斯亮蓝法和福林酚法[2]。
8.酶蛋白活性测定：采用体外模拟部分糖代谢反应链[3]。大体过程为烯醇化酶催化2-磷酸甘油酸形成磷酸烯醇式丙酮酸，磷酸烯醇式丙酮酸脱磷酸根为丙酮酸，在乳酸脱氢酶的作用下成为乳酸，同时伴有NADH+变为NAD和H+。以酿酒酵母烯醇化酶为标准(Us=227U/mg,pH=7.4，温度30℃)，用波长为340nm的分光光度计测定反应过程中单位时间内NADH转变为NAD的量，从而确定白念珠菌烯醇化酶的活性(Ua)。反应混合物为50mmol/LTris-HCl(pH为7.4)，5mmol/LMgCl2,2mmol/LEDTA,2mmol/LNADH,1.0mmol/LADP,10U丙酮酸激酶，10U乳酶脱氢酶及不同种烯醇化酶。反应总体积为1mL，反应温度为30℃。
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二、结果
经数步分离纯化去杂蛋白，得相对分子质量为47000的单一蛋白。纯化过程每一步的蛋白得率见表1。酶活性测定可得反应时间(t)-NADH变化曲线，量出初始NADH及t的变化量即ΔNADH和Δt，根据公式：Ua=(ΔNADHaΔts/ΔNADHsΔta)×Us计算出Ua为2950.0U/mg。
三、讨论
以前测定深部念珠菌感染患者血清中的抗体多采用白念珠菌的粗制抗原，这种方法的特异性较低，烯醇化酶抗原仅在白念珠菌感染过程中被释放出细胞，而且抗原性强，所以测定相应抗体可以大幅度提高诊断的准确性。Mitsutake等[4]比较了检测烯醇化酶抗原、甘露糖抗原、Cand-Tec抗原和1，3-β-D葡聚糖4种诊断念珠菌深部感染的方法，在39例血培养阳性患者中，28例可检测出烯醇化酶抗原，在20例健康者的标本中均未检测出抗原，敏感性和特异性分别为71.8%和100%。我们运用ConA-Sepharose-4B除去糖蛋白和在碱性条件下(pH7.8或8.3)用DEAE-SephadexA-50除去阴离子蛋白，并通过Sephadex的分子筛作用分离出单一的蛋白酶，其具有很高的活性，约比酿酒酵母烯醇化酶的活性高出10倍左右。
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参考文献
[1]金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南.北京：科学出版社,1998.874-889.
[2]袁玉荪.生物化学实验.北京：高等教育出版社，1992.69-70.
[3]缪辉南，陈石根译.酶法分析手册.上海：上海科学技术出版社，1983.34-43.
[4] Mitsutake K, Miyazaki T, Tashiro T, et al. Enolase antigen, mannan antigen, cand- tec antigen, and β - glucan in patients with candidemia. J Clin Microbiol, 1996,34:1918- 1921.
(收稿日期：1999-09-06), 百拇医药