三株抗白念珠菌单克隆抗体的制备与鉴定
作者:王鲁 张雪 刁庆春 刘荣卿 钟白玉
单位:王鲁(第三军医大学附属西南医院:皮肤科 重庆 400038);张雪(第三军医大学附属西南医院:检验科 重庆 400038);刁庆春(第三军医大学附属西南医院:皮肤科 重庆 400038);刘荣卿(第三军医大学附属西南医院:皮肤科 重庆 400038);钟白玉(第三军医大学附属西南医院:皮肤科 重庆 400038)
关键词:白念珠菌;单克隆抗体
第三军医大学学报000129
提要 目的:为进一步研究白念珠菌保护性抗体以及系统性念珠菌病早期诊断奠定基础。方法:运用细胞融合、间接ELISA、IIF、SDS-PAGE及免疫印迹等技术,制备并鉴定抗白色念珠菌单克隆抗体。结果:建立了3株分泌抗白念珠菌胞壁单克隆抗体杂交瘤细胞株1B5、3E8、4C7,亚类分析显示1B5为IgM,3E8和4C7为IgG1,3株单抗皆能使白念珠菌孢子和芽管染上荧光,1B5单抗能识别白念珠菌胞壁外膜上分子量约为32×103u抗原成分。结论:制备成功3株抗白念珠菌胞壁外膜成分单克隆抗体,其中1B5单抗是抗白念珠菌胞壁外膜上分子量约为32×103u抗原成分的单克隆抗体。
中图法分类号 R379.4;R329-33 文献标识码 B
文章编号:1000-5404(2000)01-0097-02
Preparation and identification of three strains of monoclonal antibody (McAb) against candida albicans
近年来,白念珠菌已从一种少见的致病菌转变为医源感染中最常见的病原菌之一[1,2]。由该菌所致的系统性感染,死亡率高达38%~59%[3],原因之一为对该病的诊断困难,二为治疗困难。在系统性念珠菌病患者中,血培养阳性率低;检测白念珠菌抗体或代谢产物,虽然敏感性好,但特异性差,且不能达到早期诊断的目的;寻求一种抗白念珠菌特异抗体以检测相应抗原,也许是系统性念珠菌病早期诊断的方向。近来许多研究结果提示了体液免疫在抗系统性念珠菌病中起着重要的作用,为抗白念珠菌保护性抗体免疫及其抗体参与系统性白念珠菌感染治疗的研究提供一定理论依据[4]。本研究运用杂交瘤技术,制备出抗白念珠菌胞壁外膜成分单克隆抗体,为进一步抗白念珠菌保护性抗体的筛选、鉴定、保护机制的探讨以及系统性念珠菌病早期诊断研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 菌种
为我科真菌保存菌珠——白念珠菌19(白19)。重新培养、鉴定[5]。
1.2 静止相白念珠菌孢子及菌丝相(带芽管的孢子)培养[6]
1.3 单克隆抗体的制备[7]
1.3.1 动物免疫 参见Sundstrom方法[8]。免疫动物选用6~8周龄BALB/C小鼠,免疫方案包括5次腹腔内菌液注射,每周1次,每次菌量为活的静止相白19孢子2×105,融合前3d腹腔内加强免疫1次。
1.3.2 细胞融合、克隆筛选、克隆化培养[7]
1.3.3 抗体检测方法 采用间接ELISA法。
1.3.3.1 步骤 一定浓度活的静止相白19孢子悬液加入酶联板中(0.1ml/孔),37°C干燥;甲醇固定10min。以下按常规ELISA法操作步骤进行。阳性对照为免疫小鼠血清,阴性对照为1640培养液。
1.3.3.2 方阵滴定 略。
1.3.4 单克隆抗体的生产及效价测定[7]
1.4 单抗的鉴定
1.4.1 单抗亚类的鉴定
1.4.2 核型的分析
1.4.3 间接免疫荧光染色 静止相白19孢子和带芽管的孢子分别做抗原,已制备的抗白19孢子胞壁外膜单克隆抗体做为Ⅰ抗,Ⅱ抗为羊抗鼠荧光抗体。按常规间接免疫荧光染色步骤进行荧光染色。
1.4.4 白念珠菌胞壁外膜成分DTT提取物的制备[6]
1.4.5 SDS-PAGE[9] 对白19孢子胞壁外膜成分DTT提取物进行垂直板SDS-PAGE。浓缩胶为5%,分离胶为10%。停止电泳后取出凝胶进行银染或电转移。
1.4.6 免疫印迹[9] 按前述方法对白19孢子胞壁外膜成分DTT提取物进行垂直板SDS-PAGE。再通过转移电泳,将凝胶上的蛋白成分转移至NC膜上;PBS漂洗,封闭液中37°C封闭2h。以1B5腹水单抗为Ⅰ抗(1B5腹水单抗用抗体稀释液稀释成1∶1000),羊抗鼠酶标抗体做为Ⅱ抗(酶标抗体用抗体稀释液稀释成1∶1000)。在底物溶液中显色10~20min。
2 结果
2.1 抗白念珠菌胞壁外膜抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立
2次成功融合,8块板获483个克隆生长孔。经间接ELISA检测出阳性反应孔3个。连续克隆化培养3次,3株杂交瘤细胞仍持续分泌抗体。培养中细胞生长良好,并可诱生富含单克隆抗体的腹水。经反复冻存复苏后,仍保持分泌抗体的能力。我们将这3株杂交瘤细胞分别命名为1B5、3E8、4C7。
2.2 单克隆抗体的效价测定
用间按ELISA法测抗体效价。已知抗原仍用活的静止相白19孢子悬液。杂交瘤腹水抗体稀释度从1∶100~1∶25600。1B5效价为1∶3200,3E8效价为1∶6400,4C7效价为1∶800。若将包被的已知抗原改用白19DTT胞壁提取物后,3株杂交瘤腹水单抗的效价均超过1∶25600。
2.3 单抗的鉴定
①核型分析:杂交瘤细胞株1B5的染色体数目为96条,3E8为83条,4C7为91条。②单抗亚类:琼脂扩散试验结果显示:1B5单抗为IgM、3E8和4C7单抗为IgG1。③间接免疫荧光染色:3株杂交瘤细胞的腹水单抗1B5、3E8和4C7皆能使白念珠菌孢子和芽管表面产生很强的荧光。④SDS-PAGE和免疫印迹结果显示,静止相白19孢子胞壁DTT提取物中的在分子量大约为32×103u处可见一酶染色阳性带,这表明1B5单抗能识别静止相白19孢子胞壁外膜上分子量大约为32×103u的抗原成分,并与之发生反应。
3 讨论
3.1 免疫原的选择
在白念珠菌致病性研究中,该菌对宿主组织的粘附,被认为是致病的起始环节[4]。这种粘附的发生,是白念珠菌胞壁外层特殊成分与其“靶子”表面的特殊结构相互作用的结果。白念珠菌胞壁通常分为3层[10],由甘露聚糖和蛋白质组成胞壁外层,其功能主要是介导粘附和提供表面抗原。本法直接用活的白念珠菌孢子作为免疫原,以制备抗白念珠菌胞壁外层(外膜)成分的单克隆抗体。
3.2 ELISA检测系统
本法采用间接ELISA法检测系统,检测、筛选阳性单抗克隆孔,遇到以下困难:①用以检测单抗的已知抗原为活的白念珠菌孢子,按常规方法将其包被于酶联板后易被洗脱,影响检测系统的敏感性;②不知该检测系统的最适检测单抗用已知抗原浓度和最适检测用阳性抗体的工作效价;③该检测系统的检测可靠性如何。按我们改进的抗原免就基本上解决了酶联孔中已包被白念珠菌易被洗脱的问题。再者,我们对本研究采用的间接ELISA法检测系统,先进行方阵滴定,求得该检测系统的最适检测用已知抗原浓度(白19孢子悬液浓度为1×107/ml)和最适检测用阳性抗体工作效价(1∶800);同时在实验中,检测板中各孔的OD值随抗体、抗原稀释度的增高而呈阶梯形降低,无“花板”出现,因此,我们能确定该检测系统检测效果好,可信度高。
3.3 抗白念珠菌胞壁外膜成分单克隆抗体的制备、鉴定
我们用活的白念珠菌孢子作为抗原,建立了3株分泌抗白念珠菌胞壁外膜成分的单克隆抗体杂交瘤细胞株——4C7、3E8、1B5。用孢子作已知抗原,间接ELISA法测定腹水单抗的效价,1B5为1∶3200,3E8为1∶6400,4C7为1∶800。单抗亚类分析显示1B5为IgM、3E8和4C7为IgG1。白念珠菌胞壁抗原成分复杂,其中单用二巯基苏糖醇(DTT)提取白念珠菌胞壁成分获得的胞壁提取物主要来自白念珠菌胞壁外层。本文用DTT法提取白念珠菌胞壁成分,先证实DTT胞壁提取物能与本文制备的单抗发生阳性反应,再将DTT胞壁提取物进行SDS-PAGE和免疫印迹,结果显示1B5单抗能与DTT白念珠菌胞壁提取物中分子量大约为32×103u抗原成分发生反应。因此,我们认为1B5单抗是抗白念珠菌孢子胞壁外膜上分子量为32×103u大小抗原的单克隆抗体。
作为抗白念珠菌胞壁外膜成分的单克隆抗体,通过间接免疫荧光染色,应使白念珠菌孢子表面染上荧光。本研究用这3株腹水单抗,分别对白念珠菌19孢子、芽管进行间接免疫荧光染色,皆使孢子和芽管表面产生很强的荧光。这也进一步证实了3株单抗是抗白念珠菌胞壁外膜成分的单克隆抗体。
作者简介:王鲁(1963.12),男,山东省莱阳市人,博士,主治医师,主要从事医学真菌方面的研究,发表论文5篇。电话:(023)68754114-73080
参考文献
[1]Jarvis W R.Epidemiology of nosocomial fungal infection,with emphasis on candida species[J].Clin Infect Dis,1995,20(6):1526-1530.
[2]Voss A,Le-Noble J L,Verduyn F M,et al.Candidemia in intensive care unit patients: risk factor for moratality[J].Infection,1997,25(1):8-11.
[3]Wey S B,M Mori,M Pfaller,et al.Hospital-acquired can-diemia: the attributable mortality and excess length of stay[J].Arch Intern Med,1988,148(12):2642-2645
[4]Mathews R C.Pathogenicity determinants of candida albicans: potential argets for immunotherapy[J].Microbiology,1994,140: 1505-1511.
[5]廖万清.真菌病学[M].北京:人民卫生出版社,1989.226-229.
[6]王鲁,叶庆佾.白念珠菌芽管特异性抗原初步研究[J].中华皮肤科杂志,1994,3(2):136-138.
[7]徐志凯.实用单克隆抗体技术[M].西安:陕西科学技术出版社,1992.1-142.
[8]Sundstrom P M,Tam M R,Nichols E J,et al.Antigenic differrences in the surface mannoproteins of candida albicans as revealed by monoclonal antibodies[J].Infect Immun,1988,56(3): 601-606.
[9]金东雁,黎孟枫译.候云德校.分子克隆实验指南[M].成都:四川科学技术出版社,1995.800-887.
[10]Poulain D.Antigenic variability of candida albicans[J].Crit Rev Microbiol,1985,12(3):223-234.
收稿日期:1999-06-22
修回日期:1999-12-16
濠电姷鏁告慨鐑藉极閸涘﹥鍙忛柣鎴f閺嬩線鏌熼梻瀵割槮缁炬儳娼¢弻鐔衡偓鐢登瑰瓭缂備浇缈伴崐婵嬪蓟閿曗偓铻e〒姘煎灡閿涘棗鈹戦悙鍙夆枙濞存粍绻堝畷鎴﹀箛閻楀牆浠梺鎼炲労娴滄粓鎯冮悜妯镐簻闁挎棁顕ч獮鏍煃鐟欏嫬鐏撮柟顔规櫇缁辨帒螣婵犳碍鏆樺┑鐘垫暩閸嬫盯鎯囨导鏉戠9婵犻潧顑冮埀顑跨椤繈鎳滈悽闈涘Ц闁诲骸绠嶉崕鍗炍涘☉銏犲偍闁告鍋愰弨浠嬫煟閹邦厽缍戦柣蹇嬪劤閳ь剝顫夊ú锕傚礈閻斿鍤曢柟闂寸鍥撮梺绯曞墲閸旀帞鑺辨繝姘拺闁告劕寮堕幆鍫ユ煕閻曚礁浜扮€规洏鍨介獮姗€顢欓悾灞藉箰闂佽绻掗崑娑欐櫠娴犲鐓″鑸靛姈閻撳啴鏌﹀Ο渚▓婵☆垪鍋撻柣搴ゎ潐濞测晝鎹㈠┑瀣畺婵炲棗娴氶崯鍛亜閺傚墽鐭欓柣娑橀叄濮婂宕掑▎鎴М闂佸湱鈷堥崑濠呮濡炪倖鍔х粻鎴︽偪閻愵剛绡€濠电姴鍊搁幃鈺傜箾閹存瑥鐏╃紒鈧崘鈹夸簻闁哄啫娲らˉ宥夋煙閼恒儲绀€闁宠鍨块幃娆撳级閹寸姳妗撻梺鑹帮骏閸婃繈寮婚敍鍕ㄥ亾閿濆簼閭柛娆忓閺岋綁骞欓崘銊ゅ枈閻庤娲栭悥鍏间繆閹间焦鏅濋柍褜鍓熼幆鍐箣閿旇В鎷虹紓浣割儐椤戞瑩宕曢幇鐗堢厵婵繂鑻崥鍦磼椤旂⒈鍎旀鐐村浮瀵剟宕崟顏勵棜闂備焦瀵х换鍌滆姳閼测晞濮冲ù鐘差儐閻撴洟鏌¢崘鈺傚暗闁伙綀椴搁妵鍕敂閸曨偅娈绘繝纰樷偓宕囧煟鐎规洖宕灃闁逞屽墮宀e潡骞嬮敂瑙f嫼缂備礁顑嗛娆撳磿閹扮増鐓欓柣鐔哄閸犳ḿ鈧鍠涢褔鍩ユ径鎰潊闁炽儱鍘栧Ч妤呮煟鎼淬値娼愭繛鍙夌墪鐓ら柕蹇嬪€曢悞鍨亜閹哄秶顦︾紒妤佽壘鑿愰柛銉戝秷鍚悗瑙勬穿缁叉儳顕ラ崟顒傜瘈闁稿被鍊栫紞瀣⒒閸屾瑧顦﹂柣銈呮喘閿濈偞寰勯幇顒€鐎梺鍓茬厛閸犳岸寮抽敃鍌涚厱妞ゆ劧绲剧粈鈧梺缁樻尰閿曘垽寮婚敐澶婄疀闂傚牊绋戦~顐g箾鐎涙ḿ鐭嬮柣鐔叉櫅椤繘鎼圭憴鍕彴闂佸搫琚崕娲焵椤掍緡娈樼紒杈ㄥ浮閹晠鎳犻顐庡應鍋撶憴鍕婵炶尙鍠庨悾鐑芥晸閻樺啿鈧鈧箍鍎卞Λ娑㈠煡婢舵劖鐓冮柦妯侯樈濡偓婵犳鍠掗崑鎾绘⒑缂佹﹫鑰挎繛浣冲嫭鍙忛柨鏃€鍨濈换鍡涙煟閹板吀绨婚柍褜鍓氶悧婊堝极椤曗偓楠炴帒顪冨┑鍡樺枠妞ゃ垺鐩幃娆撳级閹存柨浜鹃柛顐f礃閻撱儵鏌¢崘銊モ偓濠氬箺閸屾稓绠鹃柛顐g矌閻瑩鏌″畝瀣М妤犵偛娲、妤佹媴閸欏浜為梻鍌欒兌鏋悗娑掓櫅椤繗銇愰幒瀣у亾閸愵喖唯闁冲搫鍊搁埀顒傚厴閺屾稑鈻庤箛锝喰﹂梺鍝勵儑婵挳鈥旈崘顔嘉ч柛鎰╁妿娴犳儳鈹戦埥鍡椾簻闁哥噥鍋婇幃楣冩倻閽樺)鈺呮煃閸濆嫸鏀婚柡鍜冪秮濮婅櫣绱掑Ο鍝勵潚濠电偘鍖犻崶褏顔愮紓浣割儏缁ㄩ亶寮ㄦ禒瀣厽婵☆垵娅f禒娑㈡煛閸″繑娅婇柡灞剧〒閳ь剨缍嗛崜娆撳煝閸噥娈介柣鎰摠瀹曞本銇勯姀鈩冾棃鐎规洖宕灃闁告劦浜為幗宀勬⒒閸屾瑦绁版い鏇熺墵瀹曡绺介崨濠傗偓鍫曟煙闁箑鍔掓繛宸憾閺佸倿鏌涢弴銊ュ季闁告艾鎳樺缁樻媴閾忕懓绗¢梺鎸庡哺閺屾稑顫濋敐鍛缂傚倸鍊烽悞锕傘€冮崨姝ゅ洭妫冨☉杈ㄧ稁濠电偛妯婃禍婊呯不娴兼潙绠归弶鍫濆⒔閹ジ鏌i敐鍥ㄦ毈婵﹥妞介幃鐑藉级閹稿巩鈺侇渻閵堝棗鐏ユい锔诲灦閹箖鎮滈懞銉ヤ缓缂備礁顑呭ḿ锟犲船鐠鸿 鏀介柣姗嗗枛閻掑搫霉濠婂嫮绠撻摶鐐烘煕閹伴潧鏋涢柡瀣╃窔閺屾稓浠﹂崜褏鐓傛俊鐐额潐婵炲﹪骞冨Δ鍛櫜閹煎瓨绻勯惄搴㈢節绾版ǚ鍋撻悙钘変划濠殿喖锕︾划顖炲箯閸涙潙宸濆┑鐘插暙閺嬫垿姊绘担鍛靛綊顢栭崶顒€纾婚柕鍫濐槺瀹撲線鏌熼悧鍫熺凡缂佺媭鍣i弻锕€螣娓氼垱歇闂佺濮ゅú鐔奉潖濞差亜浼犻柛鏇ㄥ墮閸嬪秹姊洪幖鐐插缂傚秴锕幃浼搭敋閳ь剚鎱ㄩ埀顒勬煏閸繃顥犻柛妯绘倐濮婃椽骞栭悙鎻掑闂佸搫鎳忕粙鎴︽偤椤撶偐鏀介柣妯活問閺嗩垶鏌嶈閸撴繄浜稿▎鎾村剹婵炲棙鎸婚悡娑氣偓鍏夊亾閻庯綆鍓涜ⅵ濠电姵顔栭崰鎺楀磻閹剧粯鈷戦悗鍦У閵嗗啴鏌ょ€圭姴鐓愮紒鍌涘浮閸╋繝宕橀鍡闯闂備胶枪閺堫剙顫濋妸銉ф懃闂傚倷鐒︾€笛兠洪敂鐣岊洸妞ゅ繐鐗婇崑妯汇亜閺冨倹娅曠紒鈾€鍋撻梻浣规偠閸庮垶宕濆鍛瀺闁靛繈鍊栭埛鎴犵磽娴e箍鈧帡宕烽婵堝墾濠电偛妫欓幐濠氬磻椤忓牊鐓冪憸婊堝礈濮橆厾鈹嶅┑鐘叉处閸婇攱銇勮箛鎾愁仱闁稿鎹囧浠嬵敇閻愭鍞跺┑掳鍊х徊浠嬪疮椤愩倕顥氬┑鐘崇閻撶喖鏌¢崒娑橆嚋闁规彃鎲¢妵鍕煛閸愩劌骞嬮梺鍝勭灱閸犳牠鐛澶樻晩缁炬媽椴稿В澶愭⒒娴g懓鈻曢柡鈧柆宥呭瀭闁秆勵殔閽冪喐绻涢幋娆忕仾闁哄懏绮撻幃褰掑炊閵娿儳绁风紓浣诡殔閻倸顫忓ú顏呭殥闁靛牆鎳忛悗楣冩⒑闂堚晝绋绘繛鍏肩懅閸欏懎顪冮妶鍛閻庢埃鍋撻悷婊勬瀵鈽夐姀鐘栥劍銇勯弮鈧崕宕囨暜閵夈儮鏀介柣鎰硾娴滃綊鏌涢悩宕囧ⅹ妞ゎ偄绻愮叅妞ゅ繐瀚ˇ銊╂⒑閸涘﹦鎳冩い锔垮嵆瀹曟洟骞樼紒妯锋嫼闂佽崵鍠愬姗€寮虫潏銊﹀弿婵鐗嗛々顒勬煙楠炲灝鐏╂い顐g箞閹虫粎鍠婂Ο璇差伜婵犵數鍋犻幓顏嗗緤娴犲绠犳繛鍡樺竾娴滃綊鏌熼悜妯虹仴闁绘繃锚椤啴濡堕崱妤冪懆闂佺ǹ锕ら…鐑藉箚鐏炶В鏋庨柟鎯ь嚟閸樼敻姊虹紒妯虹仸闁挎洍鏅涢埢鎾诲即閵忥紕鍘辨繝鐢靛Т閸婄粯绂掑☉銏$厪闁搞儜鍐句純閻庢鍣崜鐔风暦瑜版帩鏁婇悷娆忓閻﹁京绱撻崒娆掑厡闁稿鎹囧畷鏇㈠箮閽樺)褔鏌熼梻瀵割槮闁藉啰鍠栭弻銊╂偄閸濆嫅銏㈢磼閳ь剟宕橀鐣屽帾婵犵數鍋涢悘婵嬪礉濡ゅ懏鐓曢悗锝庡亝鐏忕數绱掗鐣屾噰妤犵偞鍔栭幆鏃堝閵忊槅娼犳繝鐢靛Х閺佸憡鎱ㄩ悜钘夋瀬闁告稑锕ラ崣蹇斻亜閹惧崬鐏╃紒鐙€鍨堕弻娑㈠箛闂堟稒鐏堢紓浣插亾閻庯綆鍠楅悡鏇熴亜椤撶喎鐏ュù婊呭仱閺屸剝寰勬繝鍕ㄩ梺鍝勭焿缁查箖骞嗛弮鍫濐潊闁宠桨鐒﹀▍娑㈡⒒娴e憡鎲稿┑顔炬暬閹囨偐鐠囪尙鐣洪梺闈涱槴閺呮粓宕戦崒鐐茬閺夊牆澧界粙缁樼箾閸喎鍔ら柍瑙勫灴椤㈡瑦鎱ㄩ幇顏嗘崟闂備胶枪椤戝棝骞愰幖浣哥厴闁硅揪绠戦悞娲煕閹板吀绨奸柟鍙夌懃椤啴濡惰箛娑欘€嶆繝鐢靛仜閿曨亜顕g拠娴嬫闁靛繒濮烽鎺楁⒑閸濆嫷妲归柛銊潐缁傛帡宕妷褏锛濇繛杈剧秬濞咃絿鏁☉姘辩<閻庯綆鍋呭畷宀勬煕閳规儳浜炬俊鐐€栫敮濠囨嚄閸洖鐓€闁哄洨鍋熼弳鍡涙煥濠靛棙鍣洪柛瀣ㄥ劦閺岀喖顢涘顓熸嫳缂備胶绮换鍫濈暦閹达附鍤嶉柕澶涘瘜濡啴姊虹拠鈥虫灀闁哄懐濮撮悾鐑芥晲閸℃绐為柣搴秵娴滄繈鎮楁ィ鍐┾拻闁稿本鐟︾粊鐗堜繆濡炵厧濡挎繛鍡愬灲閺佹捇鎮╅弻銉︼紬闂備焦瀵х换鍌炈囬銏犵劦妞ゆ垼娉曠粣鏃傗偓娈垮枟閹歌櫕鎱ㄩ埀顒勬煃閳轰礁鏆為柣婵囨礋濮婄粯鎷呴挊澹捇鏌ㄥ顓滀簻闁挎棁娉曢惌娆撴煕閳规儳浜炬俊鐐€栫敮濠囨嚄閸洖鐓″鑸靛姈閻撳啴鎮峰▎蹇擃仼闁诲繑鎸抽弻鈩冩媴閸濄儛褏鈧娲滈崰鏍€侀弴銏℃櫖闁告洦鍓欑粈瀣攽閻樺灚鏆╁┑顕呭弮楠炲繘宕橀鐓庣獩濡炪倖姊婚弲顐ャ亹瑜忕槐鎾诲磼濞嗘垼绐楅梺鍝ュУ椤ㄥ﹪骞冮悜鑺ユ櫆闁绘劦鍓欐惔濠傗攽閻樼粯娑фい鎴濇嚇閹瑦绻濋崶銊у帾婵犵數鍊崘銊︽缂備胶濮锋晶妤冩崲濠靛鍋ㄩ梻鍫熷垁閻愮儤鐓曢柕濞у啫浠橀梺宕囩帛閺屻劑鍩ユ径鎰潊闁斥晛鍟悵鏍⒒娓氣偓濞佳囨偋閸℃蛋鍥敍濮e灕鍥ц摕闁靛濡囬崢鎼佹⒑閹肩偛鍔楅柡鍛洴瀵悂骞嬮敂鐣屽幈濠电偛妫楃换鎺旂不婵犳碍鐓涚€光偓鐎n剛袦闂佽鍠撻崹浠嬪箖閳╁啯鍎熸繝闈涙閻庡啿鈹戦悩娈挎毌婵℃彃鎳樺畷褰掝敂閸繄锛涢梺鐟板⒔缁垶鍩涢幒鎳ㄥ綊鏁愰崼婢捇鏌曢崱妤€鏆熺紒杈ㄥ浮閸┾偓妞ゆ帊鐒︽刊鎾煣韫囨挻璐¢柣鎾愁儔濮婃椽宕烽鈩冾€楅梺鍝ュУ椤ㄥ﹤鐣烽幋锕€鐓涢柛灞剧矌閻﹀牓姊婚崒姘卞濞撴碍顨婂畷鏇$疀閺囩姷锛滈梺閫炲苯澧寸€规洘锕㈤崺鐐村緞閸濄儳娉垮┑锛勫亼閸婃牠骞愭ィ鍐ㄧ獥閹兼番鍔嶉崐鍫曟煥濠靛棭妲归柣鎾寸懇閹鎮介惂璇茬秺瀹曘垻鈧稒蓱閸欏繐鈹戦悩鎻掝伀閻㈩垱鐩弻鐔风暋閻楀牆娅х紓渚囧枤閺佹悂鍩€椤掑﹦绉靛ù婊勭箞閹偓瀵肩€涙ǚ鎷绘繛杈剧到閹诧繝骞夌粙搴撴斀妞ゆ梻鍋撻弳顒侇殽閻愭潙鐏寸€规洘鍎奸ˇ鎾煛閸☆參妾紒缁樼箞濡啫鈽夐崘鎻掝潬闂備焦鐪归崐鎰板磻閹惧绡€闁汇垽娼ф禒锕傛煕閵娿儱鎮戦柕鍥ㄦ楠炴牗鎷呴崫銉︾叄闂備焦瀵х换鍌毭洪妸褍顥氬ù鐘差儐閻撴洟鎮橀悙鎻掆挃闁瑰啿鎳橀弻娑㈠棘鐠恒剱銏ゆ煟閿濆棛绠為柡浣瑰姍瀹曘劑顢欓梻瀛樻▕闂傚倷鑳剁涵鍫曞棘閸岀偛鍨傞柦妯侯樈閸ゆ洘銇勯弴妤€浜鹃悗瑙勬礀閵堟悂骞冮姀銈呬紶闁告洦鍋嗛鎴︽⒒閸屾艾鈧兘鎳楅崼鏇炵疇闁圭偓妞块弫瀣亜閹惧崬鐏╃痪鎯ф健閺岀喓鈧數枪娴犙囨煟閻旀椿娼愮紒缁樼洴楠炲鈻庤箛鏇氱棯闂備胶绮幐璇裁洪悢鐓庤摕闁跨喓濮寸壕鍏兼叏濡搫缍侀柧蹇撻叄濮婃椽宕崟顒婄川缂傚倸绉崇欢姘嚕婵犳艾鐏崇€规洖娲﹀▓鏇㈡煟鎼搭垳绉甸柛鎾寸洴閹線宕奸妷锕€鈧敻鎮峰▎蹇擃仾缂佲偓閸愵喗鍋ㄦい鏍ㄧ☉濞搭噣鏌ㄥ┑鍫濅粶闁宠鍨归埀顒婄到閻忔岸寮查敐澶嬧拺缂備焦锕懓鎸庣箾娴e啿娲ㄥ畵渚€鏌嶈閸撴稓妲愰幘璇茬<婵﹩鍏橀崑鎾诲箹娴e摜锛欓梺缁樺灱婵倝宕愰崸妤佺叆闁哄洨鍋涢埀顒€鐖奸崺鈧い鎺嗗亾闁哥喐娼欓悾鐑藉Ω閵夘喗妗ㄩ梺闈涚墕閹冲繘宕板鈧弻锛勪沪閼恒儺妫炲銈嗘尭閵堢ǹ鐣烽妸鈺婃晬婵﹩鍎烽弴鐐╂斀闁挎稑瀚禍濂告煕婵犲啰澧遍柡渚囧櫍楠炴帒螖閳ь剛绮eΔ浣瑰弿婵妫楅崢宕囩磽閸屾稑鍝洪柡宀€鍠栭弻鍥晝閳ь剟寮搁妶鍥╂/闁诡垎鍐╁€梺闈涙搐鐎氭澘顕i鈧畷鎯邦槺婵顨堢槐鎾存媴閸濆嫅銏°亜椤撶姴鍘寸€殿喖顭锋俊鎼佸Ψ閵忊剝鏉搁梻浣稿閸嬪懐鎹㈤埀顒佷繆閸欏濮嶆慨濠勫劋濞碱亪骞嶉鍛滈梻浣告憸閸犳劕岣垮▎鎾村仼闁绘垼妫勭粻鎶芥煙閹碱厼骞楅柛宥囨暬濮婃椽宕ㄦ繝搴㈢暭闂佺ǹ顑囬崑銈夌嵁婢舵劕顫呴柕鍫濇閹风粯绻涙潏鍓хК婵☆偄瀚板畷銉╂偡閹佃櫕鏂€闂佺粯鍔忛弲娑欑閸撗呯=闁稿本鑹鹃埀顒佹倐瀹曟劘銇愰幒鎾虫疄婵°倧绲介崯顐︽偂濠靛牃鍋撻獮鍨姎妞わ缚鍗冲鏌ュ蓟閵夛妇鍘遍梺闈涱槶閸ㄥ搫鈻嶉崶顒佺厽闁圭偓鍓氶崕鏃€鎱ㄦ繝鍐┿仢鐎规洘绮撻幊鐘活敆閳ь剛鏁妷鈺傗拺闁告縿鍎辨牎闂佸湱鎳撳ú顓炵暦濞差亜鐒垫い鎺嶉檷娴滄粓鏌熼崫鍕ゆい锔煎缁辨帒螖娴e摜鐟查梺闈涙搐鐎氫即銆侀弴銏℃櫜闁搞儮鏅濋弶鑺ヤ繆閻愵亜鈧垿宕瑰ú顏呮櫇闁靛繈鍊曠粻鏍煃閸濆嫭濯奸柡浣稿暣閺屻劌鈹戦崱妤婂妷缂傚倸绉撮惌鍌氼潖婵犳艾纾兼慨姗嗗厴閸嬫挻顦版惔銏╁仺濠殿喗锕╅崗妤冪磽濮樿鲸鍠愮€广儱娲ゅ鏌ユ⒒娓氣偓濞佳囨偋閸℃稑绠栭柛顭戝晹濞差亶鏁傞柛鏇炵岸閺呯娀寮诲鍡樺闁瑰嘲鑻崢锟犳⒑閸涘﹥顥栫紒鐘冲灴閳ユ棃宕橀鍢壯囨煕閳╁喚娈橀柣鐔村姂濮婅櫣绮欏▎鎯у壈濠碘槅鍋呯换鍌烆敋閿濆惟闁冲搫鍊告禍閬嶆⒑閸撴彃浜栭柛銊ヮ煼椤㈡瑩寮撮悢铏圭槇闂侀潧楠忕徊鍓ф兜閻愵兙浜滈柟瀛樼箖閹兼劙鎮¢妶澶嬪€甸柣銏㈡暩閵嗗﹪鏌涚€n偅灏甸柟鍙夋尦瀹曠喖顢楅崒锔惧枠闂傚倷鐒﹂幃鍫曞礉韫囨梹鍙忛柕鍫濇閳瑰秴鈹戦悩鍙夋悙闂佸崬娲弻锟犲炊閳轰椒鎴烽梺绋匡功閸嬨倕顫忓ú顏咁棃婵炴番鍔岀紞濠傜暦閺囥垺鍊绘俊顖欒閸ゃ倝姊洪崫鍕偍闁搞劍妞介幃锟犳偄閸忚偐鍘介梺鍝勫€圭€笛囧箟閹间焦鐓熸い鎾跺仩鐎氱増銇勯鈥冲姷妞わ箒娅曢妵鍕Ω閵壯冣叺閻庢鍣崑濠囥€佸▎鎾冲簥濠㈣泛顑嗛ˉ鍫⑩偓瑙勬处娴滎亜鐣峰鈧、鏃堝幢韫囨棑绱欐繝鐢靛Х閺佸憡鎱ㄦ导鏉戝瀭濠靛倻枪閺勩儵鏌″搴″箹缂佲偓婢舵劖鐓涚€广儱楠搁獮鏍棯閹岀吋闁哄被鍔岄埞鎴﹀幢閳哄倐褔姊虹紒妯诲鞍婵炶尙鍠栧濠氬即閻旈绐炲┑鈽嗗灥濞咃絾绂掗埡渚囨富闁靛牆鍊瑰▍鎾绘煕閹惧鎳囬柛鈹垮劜瀵板嫰骞囬鍌ゅ晪闂備浇宕甸崰鎰珶閸℃ぅ鎺楀閵忋垻锛濇繛杈剧导缁瑩宕ú顏呭仺妞ゆ牗渚楀▓鏂跨暆閿濆牆鍔电紒鐘崇☉閳藉螣濠х偓娅囬柟鍙夌摃缁犳稑鈽夊▎蹇庢偅濠电娀娼ч崐鎼佸箟閿熺姴鐓曢柟瀵稿У閸犳劙鏌eΔ鈧悧鍡樼┍椤栨稐绻嗘い鎰剁到閻忋儵鏌嶇憴鍕伌闁诡喗鐟╅崺鈩冩媴瀹勯偊妫滈梻鍌氬€搁崐宄懊归崶顒夋晪闁哄稁鍘肩粣妤佷繆閵堝懎鏆欓柛銊︾箞閺岀喖骞戦幇闈涙缂備胶濮靛姗€鍩為幋锔藉亹闁圭粯甯楀▓顓犵磽娴gǹ顣抽柛瀣洴閳ワ妇鎹勯妸锕€纾梺鎯х箰濠€杈ㄥ閸パ€鏀芥い鏃傘€嬮崝鐔兼煕鐎n偅灏甸柟骞垮灩閳规垹鈧綆鍋勬禒娲⒒閸屾氨澧涚紒瀣姉閸掓帞鎹勬笟顖涘瘜闂侀潧鐗嗗Λ娆愬緞閸曨垱鐓曟俊顖氭贡閻瑦顨ラ悙鑼ⅵ濠碘剝鎮傞弫鍌炲传閸曨亞鍑归梻鍌欑閹诧繝宕濋幋锕€绀夌€广儱鎲橀敐澶樻晢闁告洦鍏橀幏娲⒑閸涘﹦绠撻悗姘煎櫍閸┿垺寰勯幇顓犲幈濠碘槅鍨辨禍浠嬪磻閵忊懇鍋撶憴鍕缂傚秴锕ら悾鐑藉箳濡や礁鈧兘鎮楅悽鐧诲湱鏁幆褉鏀介柣妯虹仛閺嗏晠鏌涚€n剙鏋涚€规洘鍨块獮姗€寮妷锔锯偓娲⒑缁洖澧茬紒瀣浮閹繝寮撮姀鈥斥偓鐢告煥濠靛棗鏆欏┑锛勫帶閳规垿鍨鹃悙钘変划濠碘槅鍋傞悞锕€顕ラ崟顖氱疀妞ゆ挾濮村铏節閻㈤潧鈻堟繛浣冲吘娑樷枎閹炬娊妫烽悷婊呭鐢鎮″☉銏$厱闁斥晛鍟伴幊鍐煛鐎n偄鐏ラ懣鎰版煕閵夋垵绉烽崥顐㈩渻閵堝啫鐏紒瀣灴閿濈偛鈹戠€n亞顢呴梺缁樺姀閺呮稑顕ュ鍛斀闁绘ɑ鍓氶崯蹇涙煕閻樺磭澧甸柡浣稿暣婵$兘濡烽钘夌槣濠电偛顕慨鎾敄閸愵喖鐒垫い鎴f硶缁愭梻鈧鍠楅幐铏叏閳ь剟鏌嶉埡浣告殲闁绘繃濞婂缁樻媴閾忓箍鈧﹪鏌涢幘瀵哥疄闁诡喚鍏橀弫鍐磼閵堝棙娅嶅┑鐘垫暩婵數鍠婂澶婄厱闁圭儤鍤氳ぐ鎺撴櫜闁割偆鍣ユ禒鈺呮煟閵忊晛鐏¢柣鈺婂灦瀵鎮㈤崫鍕€抽梺鍛婎殘閸嬫ḿ鑺辨禒瀣拺闁荤喐澹嗛悾顓㈡煕閵娿儳绉洪柛鈺冨仱楠炲鎮╅顫闂佹寧绻傛鍛婃櫠椤斿墽纾煎〒姘功閻g敻鏌″畝瀣ɑ闁诡垱妫冮、娑樷堪閸涘拑缍佸娲传閵夈儛锝夋煟濡や胶鐭岄柛鎺撳笚缁绘繂顫濋鐔哥彸闂備胶纭堕崜婵嬫偡瑜旈幆渚€宕奸悢铏圭槇闂佹眹鍨藉ḿ褍鐡梻浣呵归敃銉╁箖閸岀偑鈧線寮崼顐f櫇闂佹寧姊婚弲顐﹀储閻㈠憡鈷戦柛婵嗗閸庢盯鏌涚€n亜顏柟渚垮姂瀹曟帒鈽夊▎蹇撲紟濠电姷鏁告慨鎾疮椤栫偛桅婵犻潧娴傚▓浠嬫煟閹邦厽缍戝┑顔肩墦閺岀喖顢涘☉娆樻闂佽桨鐒﹂崝娆忕暦閹烘垟妲堥弶鍫涘妿缁夐箖姊婚崒姘偓鎼佸磹妞嬪海鐭嗗〒姘e亾妤犵偞鐗犻、鏇㈡晜閽樺缃曟繝鐢靛Т閿曘倝鎮ч崱娆戠焼闁割偁鍎查悡鐔兼煛閸愩劎澧辨俊顐e灴閺岋繝宕遍鐘垫殼闂佸搫鐭夌紞渚€骞冮姀銏㈢煓婵炲棛鍋撻ˉ鎾绘⒒娴gǹ顥忛柛瀣笚缁傚秹顢旈崼婵婃憰濠电偞鍨崹褰掑础閹惰姤鐓忓┑鐐茬仢閸旀岸鎮楀☉宕囧埌闁宠鍨块幃娆戔偓娑欋缚缁嬪洭鏌f惔銏犲毈闁告挾鍠栭崹楣冨籍閸繄顦ㄥ銈嗘煥濡插牐顦归柡灞剧洴閸╁嫰宕橀悙顒傛毉闂備浇宕甸崰鎰板礉濞嗗浚娼栭柧蹇撴贡绾惧吋淇婇娑欍仢闁搞倕顑囩槐鎾存媴閸濆嫅锝夋煙閸涘﹥鍊愭い銏″哺閺佹劖寰勬繝鍕靛敶缂傚倷鐒︾粙鎴︻敄閸℃稑鐤炬繝濠傜墛閳锋垿鏌涢幘鏉戠祷濞存粎鍋ら弻娑㈡偐閾忣偄纾抽悗瑙勬磸閸ㄤ粙寮婚崱妤婂悑闁糕€崇箲鐎氬ジ姊绘担钘夊惞闁哥姵鎸婚弲璺何旈崨顓犵暰闂佸壊鍋侀崹鑽ゅ閻撳寒鐔嗛悹杞拌閸庢劗绱撳鍡楃伌闁哄矉缍侀弫鎰板炊閵婏附鐦撻柣搴ゎ潐濞叉牕鐣烽鍕叀濠㈣泛艌閺嬪酣鏌熺€涙ḿ绠撶紒妤佸哺濮婃椽鎳¢妶鍛€剧紓渚囧枛缁夊爼宕氶幒妤€绠荤€规洖娲﹀▓鎯р攽閻樿宸ラ柛鐘宠壘宀e潡鍩¢崒妯圭盎闂佸湱鍎ら崺鍫澪hぐ鎺撶厱鐎广儱娲﹂弳顒佹叏婵犲啯銇濇俊顐㈠暙闇夐柕澶堝劤婢э妇鈧鍠楄ぐ鍐偑娴兼潙閱囨繝闈涚墳缁遍亶姊绘担鍛靛綊鎯夋總绋跨;闁绘劗鍎ら崑鍌炴煏婢跺棙娅嗛柣鎾跺枛閺岋繝宕掑☉姗嗗殝闂佽鍨伴悧蹇涘焵椤掍胶鈯曠紒璇茬墦瀵鏁愭径瀣簻闂佸憡绺块崕鏌ュ吹閸屾粎纾藉ù锝呮惈鏍¢梺鍦嚀濞差參骞冩导鎼晪闁逞屽墮椤曪絾绂掔€e灚鏅i梺缁樺姈椤旀牠宕崶銊ょ箚闁绘劦浜滈埀顒佺墵楠炴劖銈i崘銊э紱闂佺粯鏌ㄩ幗婊堛€呴柨瀣ㄤ簻闁哄秲鍔庨惌宀€鐥幑鎰棄闂囧鏌ㄥ┑鍡橆棞缂佽尪顕ч湁婵犲﹤鎳庢禍鍓х磼缂佹ḿ绠炲┑顔瑰亾闂佹寧绻傚Λ娑㈠Υ閹扮増鈷戦柟棰佺閻忊剝绻涢崣澶岀疄濠碉紕鏁婚獮鍥级鐠侯煈鍞洪梻浣烘嚀椤曨厽鍒婇鐐嶏綁顢涢悙绮规嫽婵炶揪绲介幊娆撳捶椤撶喎搴婂┑掳鍊曢幊搴e婵犳碍鐓欓梺顓ㄧ畱閸樻挳鏌$€n偅顥堥柡灞炬礋瀹曠厧鈹戦幇顓壯囨⒑閹惰姤鏁遍柛銊ユ贡濡叉劙骞樼€涙ê顎撻柣鐘冲姦閸ㄥ磭妲愰幍顔剧=濞达絽鎼牎闂佺粯顨堟繛鈧€殿喖顭烽弫鎰緞婵犲嫬骞愬┑鐘垫暩婵挳宕愮紒妯碱浄闁冲搫鎳忛埛鎴澝归崗鑲╂噮闁诡喖銈搁弻娑滅疀閺冩捁鈧法鈧鍣崑濠囩嵁濡偐纾兼俊顖濇〃濮规姊绘担钘変汗闁冲嘲鐗撳畷婊堟晝閳ь剙宓勬繛瀵稿帶閻°劑鍩涢幒鎳ㄥ綊鏁愰崼鐕佹婵炲瓨绮岀紞濠囧蓟瀹ュ懐鏆嬮柟娈垮枛閳敻鎮楃憴鍕缂侇喖鐭傞敐鐐测攽閸ラ鐭楀┑鐘绘涧濞诧箑鈻嶉幘缁樷拻濞达絼璀﹂弨浼存煙濞茶閭慨濠佺矙瀹曠喖顢涘鍗炲箞闂備胶顢婇幓顏堟⒔閸曨垰纾婚柨婵嗩槹閻撴洟鏌曟径妯虹仯鐎光偓濞戙垺鐓曢悗锝庡亝瀹曞矂鏌熼悡搴gШ妞ゃ垺娲熸俊鍫曞礋椤撶喎鐦婚梻鍌氬€搁崐鎼佸磹妞嬪海鐭嗗〒姘e亾妤犵偛顦甸弫鎾绘偐閼艰埖鎲伴梻渚€娼чオ鐢碘偓闈涜嫰閳绘挻绂掔€n偆鍘甸梻鍌氬€搁顓⑺囬敃鍌涚厽闁规儳顕粻鐐烘煛瀹€鈧崰鏍嵁閹达箑绠涢梻鍫熺⊕椤斿嫮绱撻崒娆掑厡濠殿垰顕槐鐐寸瑹閳ь剙顕f繝姘櫜濠㈣泛锕﹂悿鈧俊鐐€栭幐楣冨窗閹惧墎鐭欓柛銉戝本瀵岄梺闈涚墕閹冲酣顢楅姀銈嗙厵闁告稑锕ラ崐鎰版煕閳哄啫浠辨鐐差儔閺佸倿鎸婃径澶嬬潖闂備浇宕垫慨鏉戔枖瑜斿畷妯款槾闁活厽顨婂濠氬磼濞嗘埈妲梺纭呭Г缁挸鐣烽幎钘壩ㄩ柍杞扮閻庮參姊洪崜鎻掍簼婵炲弶绮岄悾鍨瑹閳ь剟寮诲☉銏犵労闁告劦浜栧Σ鍫㈢磼閻愵剙鍔ら柛姘儔楠炲牓濡搁埡鍌涙珳闁硅偐琛ラ埀顒€纾鎰磽閸屾艾鈧摜绮旈幘顔芥櫇妞ゅ繐鐗忓畵渚€鏌涢幇闈涙灈闁绘挻鐩弻娑樷槈閸楃偛绠诲銈嗘煥閻倸顫忓ú顏勬嵍妞ゆ挾鍋涙俊铏圭磽娴g瓔鍤欓柛濠咁潐缁岃鲸绻濋崶銊у弳闁诲函缍嗛崜娑㈡儊閸儲鈷戞慨鐟版搐閻忓弶绻涙担鍐叉閸欐挳姊婚崒娆掑厡閺嬵亝銇勯幋婵囶棦妤犵偞鍨垮畷鍫曨敆閳ь剟鎷戦悢鍏肩厽闁哄倽娉曞▓閬嶆煛鐎n偅顥堥柡灞剧洴閳ワ箓骞嬪┑鍥╀憾闂備浇顕х换鎴﹀箰閸撗勵潟闁圭儤鎸堕崑鍛存煕閹板吀绨介柡鍡╁亞缁辨挻鎷呴崫鍕戯綁鏌eΔ鍐ㄐ㈡い鏇稻缁绘繂顫濋鐐扮盎闂佽崵鍋炵粙鍫ュ焵椤掆偓閸樻牗绔熼弴銏♀拺婵懓娲ら悘顔界箾閸涱偄鍔﹂柟顔惧厴閹囧醇閻旂儤顫栭梻鍌氬€峰ù鍥х暦閻㈢ǹ绐楅柟閭﹀枛閸ㄦ繈骞栧ǎ顒€鐏繛鍛У娣囧﹪濡堕崨顔兼闂佺ǹ顑呴崐鍧楀蓟閵娾晜鍋勯柛婵嗗珔閵忋倖鐓㈤柛鎰典簻閺嬫垹绱掔紒妯兼创妤犵偛顑呴埢搴ょ疀閺囨碍鍋呯紓鍌氬€烽懗鑸垫叏閸偆绠惧┑鐘叉搐閽冪喖鏌ㄩ悢鍝勑㈢痪鎯у悑閹便劌螣閸ф鎽甸梺姹囧妽閸ㄥ灝顫忓ú顏勪紶闁告洟娼ч崜浼存⒑閻熸澘鏆遍梺甯秮瀹曟椽鎮欓崫鍕吅闂佹寧妫佸Λ鍕焵椤掑倸鍘撮柡灞剧☉閳诲氦绠涢敐鍠帮箑鈹戦悙鍙夊珔缂傚秳绀侀~蹇曠磼濡顎撶紓浣割儓濞夋洟鎯勬惔锝囩=濞达綀妫勯惃娲煕鐎n偅灏电紒顔界濞煎繘濡歌閻﹀牓姊洪幖鐐插妧闁告粈绀侀弲顏勨攽閿涘嫬浜奸柛濠冪墪铻炲ù锝堫潐閸欏繘鏌曢崼婵囧櫝闁哄绉归弻鏇$疀鐎n亖鍋撻弽顓炵厱闁硅揪闄勯崑锝夋煙椤撶喎绗掑┑鈥冲悑缁绘盯宕ㄩ鐓庮潚闂佸搫鐬奸崰鏍х暦濞嗘挸围闁糕剝顨忔导锟�