HPV16L1-E7重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7的构建及克隆表达
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山东医科大学学报 2000年第2期第38卷 论著
作者：卞继峰 于修平 齐眉 王芸 杨海宁 胡海燕
单位：卞继峰 于修平 杨海宁 胡海燕(山东医科大学分子生物学实验室)；齐眉 王芸(山东医科大学微生物学教研室)
关键词：乳头瘤病毒；人；重组腺病毒；克隆；分子；疫苗；减毒
山东医科大学学报000201
摘 要：目的：研制人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1-E7重组腺病毒，以期获得防治宫颈癌的重组腺病毒减毒活疫苗和嵌合病毒样颗粒疫苗。方法：以HPV16型野毒株HPV16-114/K为模板，利用PCR克隆技术构建可表达HPV16主要衣壳蛋白L1(1-301aa)和转化蛋白E7(1-60aa)融合基因的重组质粒pUC19L1-E7，HPV16L1-E7DNA片段经质粒pBSLl-E7转入腺病毒Ad5穿梭质粒pCA14L1-E7，与腺病毒质粒pBHGl0共转染293细胞，制备重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7，密度梯度超迷离心纯化HPV16嵌合L1-E7VLP。结果：成功构建了HPV16L1-E7重组质粒pUC19L1-E7，制备HPV16L1-E7重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7，HPV16L1-E7融合蛋白可在293细胞中高效表达，可达细胞总蛋白的10%以上，并装配成嵌合病毒样颗粒(cVLP)。结论：成功制备了可高效表达IPV16L1-E7嵌合L1-E7VLP的重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7载体疫苗，为HPV重组腺病毒疫苗用于宫颈癌的防治打下了基础。构建的pUC19L1载体可以比较方便的插入外源基因，用来构建多价疫苗，因此在制备HPV16多价疫苗方面具有广泛的应用价值。
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分类号：R373.1；R511.B；Q785；R457.2 文献标识码：A
文章编号：1000-0496(2000)02-0113-04
CONSTRUCTION AND EXPRESSION OF AN ATTENUATED RECOMBINANT ADENOVIRUS OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 16 L1-E7
BIAN ji-feng,YU Xiu-ping,QI Mei
(Laboratory of Molecular Biology and Dept. of Microbiology, Shandong Medical University)
Abstract：Objective:To develop an attenuated recombinant adenoviral vaccine against HPV16 infection and human cervical cancer, the recombinant adenoviral vaccine of HPV was constructed. Methods: The plasmid pUC19L1-E7 contained the major capsid protein L1 ORF and E7 ORF was constructed using polymerase chain reaction. The L1-E7 DNA fragment was digested with HindlII and SmaI and inserted into pBluescript, named pBSL1-E7,and then the L1-E7 DNA fragment was cut with HindIII and XbaI and inserted into adenoviral shuttle plasmid pCA14, and cotransfected 293 cells with the adenovirus pBHG10 plasmid, harvested the recombinant adenovirus of HPV16. The expression level of the chimeric virus-like paricle was detected using ELISA, immunoblot assay and the electron microscopy. Results:The fusion L1-E7 protein was expressed at the high level morphologically indistinguishable from the uaitive virions and display the confommtional epitopes. Conclusion: These data indicated that we constructed the recombinant abenovirus of human papillomavirus type 16 L1-E7, the L1-E7 fusion protein can be expressed at high level,and can self assemble into the chimeric virus-like patticles in human cells. The recombinant pUC19L1 plasmid was an ideal vector for constructing other chimeric vaccine carried the epitopes derived from virus and tumor antigen.
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Keywords：Papillomavirus,Human; Recombinant adenovirus;Cloning,molecular;Vaccines,attentmted 人乳头瘤病毒(HPV)是一类严重威胁人类健康的DNA肿瘤病毒，HPV16感染是宫颈癌诱发过程中的首要潜在病因，在宫颈癌的早期诊断和防治中具有重要的应用价值。由于HPV目前尚不能在体外大量培养，况且HPV又有潜在的致癌性，严重限制了HPV疫苗的研究。近年来研究发现在真核或原核细胞中表达的HPV16主要衣壳蛋白(L1)具有自身装配成病毒样颗粒(Virus-likeparticles，cVLP)的特性[1]，与天然的病毒颗粒具有相似的结构，具有很强的免疫原性和免疫综合性，可以刺激机体产生中和性的抗体IgG、IgA[2]，可以预防HPV16感染，因此VLP疫苗具有重要的开发价值。研究发现HPV16L1蛋白C端的50个氨基酸的缺失并不影响VLP的形成[3，4]，因此可在L1的C端融合其他的抗原表位而不影响VLP的形成效率，使制备嵌合病毒样颗粒(chimericvirus-likeparticle，cVLP)成为可能。E7蛋白是HPV16的主要转化蛋白，E7的表达对宫颈癌的恶性维持具有关键作用，E7蛋白又是一种重要的肿瘤排斥抗原，可以刺激机体产生CTL效应杀伤HPV16相关的肿瘤细胞，具有治疗宫颈癌的作用，因此我们拟将HPV16L1和E7基因融合以增加VLP的免疫综合性，研究发现E7蛋白的表位主要集中于第1～60个氨基酸之间[5]。重组复制缺陷型腺病毒载体是目前基因治疗和新型减毒活疫苗研究中的又一个新型载体，成为高科技领域的一大研究热点[6]。因此本研究以HPV16-114/K野毒株为模板构建HPV16L1-E7融合基因，制备HPV16L1-E7的重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7，以期获得对HPV16相关疾病的预防和治疗双重作用，本研究在国内外首次制备成功了HPV16L1-E7重组腺病毒载体。
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1材料与方法
1.1质粒、载体、细胞和试剂HPV16型野毒株HPV16-114/KL1-L2-pSynxtVi由美国MartinMuller(Geman)教授惠赠，pHPV16质粒由美国GallowayDA教授惠赠，含全长HPV16L1ORF的重组质粒pHPV16L1BN1由于修平教授构建。腺病毒穿梭质粒pCA14(缺失E1区)、腺病毒质粒pB-HGl0购自加拿大Microbix公司；293细胞由中国预防医学科学院病毒所温乐英老师惠赠；大肠杆菌DH5a为本室保存；基因克隆所需的酶均购于Promega公司；引物合成由美国Sybersyn公司合成；CsCl、PMSF、Sucrose均为Sigma公司产品。小牛血清、胎牛血清、MEM细胞培养基等试剂分别购于Gibco公司、华美生物公司，HPV16L1鼠单克隆抗体购自Merck公司，HRPO-酶标羊抗鼠二抗购自北京中山生物公司。冷冻高速离心机、冷冻超迷离心机(L7型)分别为Dupont、Beckman公司产品(山东师范大学逆境植物实验室)。
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1.2质粒构建设计携带BglII位点的双引物，从HPV16-114/KL1-L2-pSynxtVi中PCR扩增HPV16L1，插入pUC19BamHI的位点，制备pUC19L1；设计一对含有EcoRV酶切位点的引物，从pHPV16质粒PCR扩增HPV16E7的第1～60个氨基酸的DNA序列；然后设计一对含有EcoRV酶切位点引物，在pUC19L1序列中的第301氨基酸处反向扩增pLUC19L1，并在下游引物处加一个终止密码子TAA，使L1ORF提前终止于第301个氨基酸，编码L1蛋白N端的1-301氨基酸，以在此插入HPV16E7的1～60个氨基酸，形成质粒pUC19L1-E7；pUC19L1-E7由HindⅢ和SmaⅠ双酶切插入pBluescript制备pBSL1-E7质粒；pBSL1-E7由HindⅢ和XbaⅠ双酶切，将HPV16L1-E7DNA片段插入腺病毒穿梭质粒pCA14L1-E7。
1.2.1pCA14L1-E7和pBHG10共转染制备重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7293细胞在MEMF11+10%BSA培养基中形成单层，将20μg腺病毒穿梭质粒pCA14L1-E7和20μg腺病毒质粒pBHG10混匀，加入100μl2.5mmol/L的CaCl2，室温静止30min，每一个293细胞培养瓶中加入0.5ml的混合液，5%CO237℃培养，每3d换液1次，直到细胞出现病变CPE，回收细胞上清液和细胞沉淀，鉴定两质粒重组的情况，筛选重组病毒。
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1.2.2细胞DNA的提取及PCR鉴定收集病毒感染的细胞及病变细胞的上清夜，常规方法抽提病毒DNA。分别以HPV16L1引物和E7引物扩增重组病毒中所携带的HPV16L1和E7DNA片段。
1.2.3HPV16L1-E7表达蛋白的ELISA鉴定收集病毒感染的293细胞，回收上清，并反复冻融5次，加入蛋白酶抑制剂PMSF，以碳酸钠倍比稀释上清和细胞裂解液，包被平板过夜，PBS洗涤3次，加入L1单克隆抗体(1：1000)，37℃2h，PBS洗涤3次，加入酶标二抗(1：2000)。37℃2h，PBS洗涤3次，加入酶底物，显色。
1.2.4WesterrnBlot鉴定收集病毒感染的293细胞沉淀，加入蛋白酶抑制剂PMSF，超声破碎细胞，加入2×SDS-PAGE上样缓冲液，100℃煮沸3min，10%SDS-PAG电泳，考马氏亮蓝染色；电泳转印100V2h，PBS洗涤3次，TTBS+3%BSA封闭30min，加入TTBS+1%BSA稀释的HPV16L1单克隆抗体(1：1000)，37℃1h，TTBS洗涤3次，加入酶标二抗(1：1000)，37℃孵育2h，TTBS洗涤3次，加入底物DAB/H2O2显色。
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1.2.5超速离心收集病毒感染的293细胞，回收上清，并反复冻融5次，加入蛋白酶抑制剂PMSF，3000g离心10min，冰上超声破碎细胞；20%蔗糖/PBS密度梯度离心280000g20h，弃上清；沉淀冰上超声3次，每次15s，27%CsCl/PBS梯度离心2.4h，回收蛋白质层。透射电镜观察VLP。或取病毒感染细胞的上清液，8000r/min离心，取上清吸附于铜网，磷钨酸负染，透射电镜观察病毒样颗粒。
2结果
2.1重组腺病毒的鉴定以rAd5HPV16L1-E7感染的293细胞中提取DNA为模板，以构建pUC19L1的引物扩增可得到L1-E7重组片段，以L1的下游引物和E7上游引物可扩增出E7DNA条带；结果表明rAd5HPV16L1-E7携带HPV16L1-E7DNA片段。DNA序列分析和内切酶酶切分析表明构建的pUC19L1-E7包含的HPV16L1DNA全长序列(从第二个ATG开始)，但在第301个氨基酸处加入一个终止密码子TTA和一个EcoRV内切酶序列，在加入的终止密码子TAA之前插入了HPV16E7的1～60氨基酸的DNA编码序列，HPV16L1-E7融合基因读码框架正确。图1示重组腺病毒中扩增出的HPV16L1DNA片段；图2示重组腺病毒扩增出的E7N端DNA片段。
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图1HPV16L1-E7重组腺病毒L1PCR鉴定结果
M:LamadaDNA/HindⅢl:从pHPV16BN1中扩增的L1DNA片段2,3,4:从重组腺病毒DNA中扩增的LIDNA片段
Fig.1HPVl6L1ORFwasamplifiedfromtherecombinantadenovirusofHPV16L1-E7M:LamdaDNA/HindⅢ
1:HPV16L1ORFfrompHPV16L1BN1,2,3,4:HPV16L1ORF,amplifiedfromtherecombinmatadenovirusofHPV16infected293cells
图2HPV16L1-E7重组腺病毒E7PCR鉴定结果
M:LamadaDAN/HindⅢ1:从plIPVl6中扩增的E7DAN片段,2,4:从重组腺病毒DNA中扩增的E7DNA片段,3:阴性对照
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Fig.2HPV16E7DNAfragmentamplifiedfromrecombinantadenovirusofHPV16infected293cellsM:DNAmarkerLamadaDNA/HindⅢ1:E7DNAfragmentamplifiedfromthepHPV16,2,4:TheE7DNAfragmentsamplifiedfromtherecombinantadenovirusofHPV16infected293cells,3:wasnegativecontrol
2.2rAd5HPV16L1-E7的构建收集病毒感染的293细胞，提取细胞DNA，分别以HPV16L1和E7引物PCR扩增，证明重组基因HPV16L1-E7已经存在于293细胞中；Westernblot免疫印迹和ELISA实验证明克隆的HPV16L1-E7基因可以在293细胞中稳定的高效表达，ELISA实验证明表达的L1-E7蛋白大部分存在于感染的293细胞中，抗原的稀释度为1：16，而细胞培养的上清液中L1-E7蛋白的含量较少，抗原的稀释度为1：2。图3(A)示SDS-PAGE和图3(B)示Western免疫印迹结果。图4示感染后病变的293细胞。
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图3重组腺病毒Ad5HPV16L1-E7表达的HPV16L1-E7蛋白的免疫印迹分析
ASDS-PAGE分析1，3：重组腺病毒Ad5HPV16L1-E7感染的293细胞，2：对照293细胞蛋白电泳结果，表明Ad5HPV16L1-E7感染的293细胞在67Kd处比对照细胞多出一条较浓的条带
B通过Westernblotting证明这条带可与HPV16L1蛋白的抗体特异反应
Fig.3WesternblottingoftherecombinantAd5HPV16L1-E7infected293cellsA:SDS-PAGEresult1,3:recombinantAd5HPV16L1-E7cellextracts,2:control293cellsextractnoinfectionofrecombinantadenovirusB:Westernblottingresult:theelectrophoresedproteintransferredontomemebrane,andthedetectedwithHPVl6L1antibody,onlythebnadsat67Kdcanreactivewiththeantibody
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图4重组腺病毒Ad5HPV16L1-E7感染的293细胞，细胞出现病变，圆缩
Fig.4293cellsinfectedwithrecombinantAd5HPV16L1-E7withcytopathiceffect(CPE)
2.3rAd5HPV16L1-E7表达的蛋白装配成VLP的研究重组病毒rAd5HPV16L1-E7感染293细胞，当293细胞90%出现病变CPE时，回收细胞，加入蛋白酶抑制剂PMSF，冰上超声波破碎细胞，蔗糖和氯化铯超速离心，回收蛋白质层，制备电镜标本，电镜观察嵌合病毒样颗粒(cVLP)的形态。图5示超迷离心后HPV16L1-E7病毒样颗粒，cVLP大小和形态与已经报道的HPV病毒颗粒结构相似，只是在VLP缺少电子致密的中心。
图5透射电镜观察HPV16L1-E7形成的病毒样颗粒
Fig.5L1-E7fusionprotemassembledintovirus-likeparticlesviatransmissionelectronicmicroscopy
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3讨论
近年研究表明，HPVL1具有自我装配成病毒样颗粒的特性，这种病毒样颗粒刺激机体产生中和性抗体，是目前最有应用前景的防治宫颈癌的HPV疫苗。本研究成功地制备了HPV16L1重组质粒pUC19L1，并在L1的末端第301个氨基酸所在的密码子处设计了一个常用的EcoRV酶切位点，可以方便的插入其他一定长度的多肽，不影响VLP的形成，故本研究设计一对含有EooRV的HPV16E7N端引物，扩增HPV16E7的N端的180个碱基，并插入pUC19L1的L1蛋白末端的第301个氨基酸所在的密码子处，制备了HPV16L1-E7重组质粒pUC19L1-E7。本研究构建的pUC19L1载体可以比较方便的插入外源基因用来构建多价疫苗，因此在制备HPV16多价疫苗方面具有广泛的应用价值。
重组复制缺陷型腺病毒作为基因治疗和蛋白表达载体成为高科技领域的一大研究热点。Ad载体具有很多优点：能感染分裂期后的非复制细胞，在哺乳动物细胞内增殖极为稳定尚没发现整合现象，感染宿主细胞极为广泛。由于腺病毒载体可插入的外源基因的长度有限，制备HPV16L1-E7的重组腺病毒载体有一定的难度，我们在国内外首次成功地将HPV16L1-E7插入到腺病毒载体rAd5HPV16L1-E7，可在293细胞内持续表达HPV16L1-E7蛋白，可达细胞总蛋白的10%以上，并可装配成嵌合VLP，为HPV16cVLP疫苗治疗宫颈癌打下了基础。
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由于HPV目前尚不能体外大量培养，难以获得大量的有感染性的病毒颗粒；高危型HPV引起的疾病是一个漫长的过程，病毒感染到肿瘤发生约十几年的时间；并且HPV感染是非溶细胞性的，不会在短时间内出现明显的细胞病变，不能进行病毒体外中和实验，难以确切的对疫苗疗效进行评估[7]；目前使用的动物模型多是以HPV16E6/E7和EjRas基因转化细胞而得到的“永生化”的细胞系，因缺少HPV16的L1/L2基因，因此疫苗的保护性研究不充分。故亟待建立HPV疫苗抗病毒和抗肿瘤的动物模型。
基金项目：国家自然科学基金资助课题(39670038) 山东省自然科学基金资助课题
参考文献：
[1]Zhou J,Sun XY,Stenzel DJ,et al. Expression of vaccinia recombinant HPV16 L1 and L2 ORF protein in epithelial cells is sufficient for assembly of HPV virion-like particles[J]. J Virol,1991(B),185,251
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[2]Jochmus I, Schafer K, Kaath S, et al. Chimeric virus-like particles of the human pepillomavirus type 16 as a prophylactic and therapeutic vaccine[J]. Arch Med Res,1999,30:269
[3]Paintsfi J,Muller M, Picken M,et al. Carboxyl terminus of bovine papillomavirus type-1 L1 protein is not required for capsid formation[J].J Virol,1996,223:238
[4]Muller M, Zhou J, Tracey DR, et al. Chimeric papillo-mavirus-like particles[J].J Virol,1997,234:93
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[5]于修平, Jenison SA. 人乳头瘤病毒16型E7开放读码框呆编码的免疫表位的定位[J].病毒学报,1990,3:245
[6]Bett AJ, Prevec L,Graham FL. Packaging capacity and stability of human adenovirus type 5 vectors[J].J Virol,1993,67:5911
[7]Schiller JT.Papillomavirus-like particle vaccines for cervical cancer[J].Mol Med Today,1990,5:209
收稿日期：1999-12-14, http://www.100md.com
单位：卞继峰 于修平 杨海宁 胡海燕(山东医科大学分子生物学实验室)；齐眉 王芸(山东医科大学微生物学教研室)
关键词：乳头瘤病毒；人；重组腺病毒；克隆；分子；疫苗；减毒
山东医科大学学报000201
摘 要：目的：研制人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1-E7重组腺病毒，以期获得防治宫颈癌的重组腺病毒减毒活疫苗和嵌合病毒样颗粒疫苗。方法：以HPV16型野毒株HPV16-114/K为模板，利用PCR克隆技术构建可表达HPV16主要衣壳蛋白L1(1-301aa)和转化蛋白E7(1-60aa)融合基因的重组质粒pUC19L1-E7，HPV16L1-E7DNA片段经质粒pBSLl-E7转入腺病毒Ad5穿梭质粒pCA14L1-E7，与腺病毒质粒pBHGl0共转染293细胞，制备重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7，密度梯度超迷离心纯化HPV16嵌合L1-E7VLP。结果：成功构建了HPV16L1-E7重组质粒pUC19L1-E7，制备HPV16L1-E7重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7，HPV16L1-E7融合蛋白可在293细胞中高效表达，可达细胞总蛋白的10%以上，并装配成嵌合病毒样颗粒(cVLP)。结论：成功制备了可高效表达IPV16L1-E7嵌合L1-E7VLP的重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7载体疫苗，为HPV重组腺病毒疫苗用于宫颈癌的防治打下了基础。构建的pUC19L1载体可以比较方便的插入外源基因，用来构建多价疫苗，因此在制备HPV16多价疫苗方面具有广泛的应用价值。
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文章编号：1000-0496(2000)02-0113-04
CONSTRUCTION AND EXPRESSION OF AN ATTENUATED RECOMBINANT ADENOVIRUS OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 16 L1-E7
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Abstract：Objective:To develop an attenuated recombinant adenoviral vaccine against HPV16 infection and human cervical cancer, the recombinant adenoviral vaccine of HPV was constructed. Methods: The plasmid pUC19L1-E7 contained the major capsid protein L1 ORF and E7 ORF was constructed using polymerase chain reaction. The L1-E7 DNA fragment was digested with HindlII and SmaI and inserted into pBluescript, named pBSL1-E7,and then the L1-E7 DNA fragment was cut with HindIII and XbaI and inserted into adenoviral shuttle plasmid pCA14, and cotransfected 293 cells with the adenovirus pBHG10 plasmid, harvested the recombinant adenovirus of HPV16. The expression level of the chimeric virus-like paricle was detected using ELISA, immunoblot assay and the electron microscopy. Results:The fusion L1-E7 protein was expressed at the high level morphologically indistinguishable from the uaitive virions and display the confommtional epitopes. Conclusion: These data indicated that we constructed the recombinant abenovirus of human papillomavirus type 16 L1-E7, the L1-E7 fusion protein can be expressed at high level,and can self assemble into the chimeric virus-like patticles in human cells. The recombinant pUC19L1 plasmid was an ideal vector for constructing other chimeric vaccine carried the epitopes derived from virus and tumor antigen.
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1.1质粒、载体、细胞和试剂HPV16型野毒株HPV16-114/KL1-L2-pSynxtVi由美国MartinMuller(Geman)教授惠赠，pHPV16质粒由美国GallowayDA教授惠赠，含全长HPV16L1ORF的重组质粒pHPV16L1BN1由于修平教授构建。腺病毒穿梭质粒pCA14(缺失E1区)、腺病毒质粒pB-HGl0购自加拿大Microbix公司；293细胞由中国预防医学科学院病毒所温乐英老师惠赠；大肠杆菌DH5a为本室保存；基因克隆所需的酶均购于Promega公司；引物合成由美国Sybersyn公司合成；CsCl、PMSF、Sucrose均为Sigma公司产品。小牛血清、胎牛血清、MEM细胞培养基等试剂分别购于Gibco公司、华美生物公司，HPV16L1鼠单克隆抗体购自Merck公司，HRPO-酶标羊抗鼠二抗购自北京中山生物公司。冷冻高速离心机、冷冻超迷离心机(L7型)分别为Dupont、Beckman公司产品(山东师范大学逆境植物实验室)。
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1.2质粒构建设计携带BglII位点的双引物，从HPV16-114/KL1-L2-pSynxtVi中PCR扩增HPV16L1，插入pUC19BamHI的位点，制备pUC19L1；设计一对含有EcoRV酶切位点的引物，从pHPV16质粒PCR扩增HPV16E7的第1～60个氨基酸的DNA序列；然后设计一对含有EcoRV酶切位点引物，在pUC19L1序列中的第301氨基酸处反向扩增pLUC19L1，并在下游引物处加一个终止密码子TAA，使L1ORF提前终止于第301个氨基酸，编码L1蛋白N端的1-301氨基酸，以在此插入HPV16E7的1～60个氨基酸，形成质粒pUC19L1-E7；pUC19L1-E7由HindⅢ和SmaⅠ双酶切插入pBluescript制备pBSL1-E7质粒；pBSL1-E7由HindⅢ和XbaⅠ双酶切，将HPV16L1-E7DNA片段插入腺病毒穿梭质粒pCA14L1-E7。
1.2.1pCA14L1-E7和pBHG10共转染制备重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7293细胞在MEMF11+10%BSA培养基中形成单层，将20μg腺病毒穿梭质粒pCA14L1-E7和20μg腺病毒质粒pBHG10混匀，加入100μl2.5mmol/L的CaCl2，室温静止30min，每一个293细胞培养瓶中加入0.5ml的混合液，5%CO237℃培养，每3d换液1次，直到细胞出现病变CPE，回收细胞上清液和细胞沉淀，鉴定两质粒重组的情况，筛选重组病毒。
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1.2.3HPV16L1-E7表达蛋白的ELISA鉴定收集病毒感染的293细胞，回收上清，并反复冻融5次，加入蛋白酶抑制剂PMSF，以碳酸钠倍比稀释上清和细胞裂解液，包被平板过夜，PBS洗涤3次，加入L1单克隆抗体(1：1000)，37℃2h，PBS洗涤3次，加入酶标二抗(1：2000)。37℃2h，PBS洗涤3次，加入酶底物，显色。
1.2.4WesterrnBlot鉴定收集病毒感染的293细胞沉淀，加入蛋白酶抑制剂PMSF，超声破碎细胞，加入2×SDS-PAGE上样缓冲液，100℃煮沸3min，10%SDS-PAG电泳，考马氏亮蓝染色；电泳转印100V2h，PBS洗涤3次，TTBS+3%BSA封闭30min，加入TTBS+1%BSA稀释的HPV16L1单克隆抗体(1：1000)，37℃1h，TTBS洗涤3次，加入酶标二抗(1：1000)，37℃孵育2h，TTBS洗涤3次，加入底物DAB/H2O2显色。
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1.2.5超速离心收集病毒感染的293细胞，回收上清，并反复冻融5次，加入蛋白酶抑制剂PMSF，3000g离心10min，冰上超声破碎细胞；20%蔗糖/PBS密度梯度离心280000g20h，弃上清；沉淀冰上超声3次，每次15s，27%CsCl/PBS梯度离心2.4h，回收蛋白质层。透射电镜观察VLP。或取病毒感染细胞的上清液，8000r/min离心，取上清吸附于铜网，磷钨酸负染，透射电镜观察病毒样颗粒。
2结果
2.1重组腺病毒的鉴定以rAd5HPV16L1-E7感染的293细胞中提取DNA为模板，以构建pUC19L1的引物扩增可得到L1-E7重组片段，以L1的下游引物和E7上游引物可扩增出E7DNA条带；结果表明rAd5HPV16L1-E7携带HPV16L1-E7DNA片段。DNA序列分析和内切酶酶切分析表明构建的pUC19L1-E7包含的HPV16L1DNA全长序列(从第二个ATG开始)，但在第301个氨基酸处加入一个终止密码子TTA和一个EcoRV内切酶序列，在加入的终止密码子TAA之前插入了HPV16E7的1～60氨基酸的DNA编码序列，HPV16L1-E7融合基因读码框架正确。图1示重组腺病毒中扩增出的HPV16L1DNA片段；图2示重组腺病毒扩增出的E7N端DNA片段。
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图1HPV16L1-E7重组腺病毒L1PCR鉴定结果
M:LamadaDNA/HindⅢl:从pHPV16BN1中扩增的L1DNA片段2,3,4:从重组腺病毒DNA中扩增的LIDNA片段
Fig.1HPVl6L1ORFwasamplifiedfromtherecombinantadenovirusofHPV16L1-E7M:LamdaDNA/HindⅢ
1:HPV16L1ORFfrompHPV16L1BN1,2,3,4:HPV16L1ORF,amplifiedfromtherecombinmatadenovirusofHPV16infected293cells
图2HPV16L1-E7重组腺病毒E7PCR鉴定结果
M:LamadaDAN/HindⅢ1:从plIPVl6中扩增的E7DAN片段,2,4:从重组腺病毒DNA中扩增的E7DNA片段,3:阴性对照
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Fig.2HPV16E7DNAfragmentamplifiedfromrecombinantadenovirusofHPV16infected293cellsM:DNAmarkerLamadaDNA/HindⅢ1:E7DNAfragmentamplifiedfromthepHPV16,2,4:TheE7DNAfragmentsamplifiedfromtherecombinantadenovirusofHPV16infected293cells,3:wasnegativecontrol
2.2rAd5HPV16L1-E7的构建收集病毒感染的293细胞，提取细胞DNA，分别以HPV16L1和E7引物PCR扩增，证明重组基因HPV16L1-E7已经存在于293细胞中；Westernblot免疫印迹和ELISA实验证明克隆的HPV16L1-E7基因可以在293细胞中稳定的高效表达，ELISA实验证明表达的L1-E7蛋白大部分存在于感染的293细胞中，抗原的稀释度为1：16，而细胞培养的上清液中L1-E7蛋白的含量较少，抗原的稀释度为1：2。图3(A)示SDS-PAGE和图3(B)示Western免疫印迹结果。图4示感染后病变的293细胞。
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图3重组腺病毒Ad5HPV16L1-E7表达的HPV16L1-E7蛋白的免疫印迹分析
ASDS-PAGE分析1，3：重组腺病毒Ad5HPV16L1-E7感染的293细胞，2：对照293细胞蛋白电泳结果，表明Ad5HPV16L1-E7感染的293细胞在67Kd处比对照细胞多出一条较浓的条带
B通过Westernblotting证明这条带可与HPV16L1蛋白的抗体特异反应
Fig.3WesternblottingoftherecombinantAd5HPV16L1-E7infected293cellsA:SDS-PAGEresult1,3:recombinantAd5HPV16L1-E7cellextracts,2:control293cellsextractnoinfectionofrecombinantadenovirusB:Westernblottingresult:theelectrophoresedproteintransferredontomemebrane,andthedetectedwithHPVl6L1antibody,onlythebnadsat67Kdcanreactivewiththeantibody
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图4重组腺病毒Ad5HPV16L1-E7感染的293细胞，细胞出现病变，圆缩
Fig.4293cellsinfectedwithrecombinantAd5HPV16L1-E7withcytopathiceffect(CPE)
2.3rAd5HPV16L1-E7表达的蛋白装配成VLP的研究重组病毒rAd5HPV16L1-E7感染293细胞，当293细胞90%出现病变CPE时，回收细胞，加入蛋白酶抑制剂PMSF，冰上超声波破碎细胞，蔗糖和氯化铯超速离心，回收蛋白质层，制备电镜标本，电镜观察嵌合病毒样颗粒(cVLP)的形态。图5示超迷离心后HPV16L1-E7病毒样颗粒，cVLP大小和形态与已经报道的HPV病毒颗粒结构相似，只是在VLP缺少电子致密的中心。
图5透射电镜观察HPV16L1-E7形成的病毒样颗粒
Fig.5L1-E7fusionprotemassembledintovirus-likeparticlesviatransmissionelectronicmicroscopy
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3讨论
近年研究表明，HPVL1具有自我装配成病毒样颗粒的特性，这种病毒样颗粒刺激机体产生中和性抗体，是目前最有应用前景的防治宫颈癌的HPV疫苗。本研究成功地制备了HPV16L1重组质粒pUC19L1，并在L1的末端第301个氨基酸所在的密码子处设计了一个常用的EcoRV酶切位点，可以方便的插入其他一定长度的多肽，不影响VLP的形成，故本研究设计一对含有EooRV的HPV16E7N端引物，扩增HPV16E7的N端的180个碱基，并插入pUC19L1的L1蛋白末端的第301个氨基酸所在的密码子处，制备了HPV16L1-E7重组质粒pUC19L1-E7。本研究构建的pUC19L1载体可以比较方便的插入外源基因用来构建多价疫苗，因此在制备HPV16多价疫苗方面具有广泛的应用价值。
重组复制缺陷型腺病毒作为基因治疗和蛋白表达载体成为高科技领域的一大研究热点。Ad载体具有很多优点：能感染分裂期后的非复制细胞，在哺乳动物细胞内增殖极为稳定尚没发现整合现象，感染宿主细胞极为广泛。由于腺病毒载体可插入的外源基因的长度有限，制备HPV16L1-E7的重组腺病毒载体有一定的难度，我们在国内外首次成功地将HPV16L1-E7插入到腺病毒载体rAd5HPV16L1-E7，可在293细胞内持续表达HPV16L1-E7蛋白，可达细胞总蛋白的10%以上，并可装配成嵌合VLP，为HPV16cVLP疫苗治疗宫颈癌打下了基础。
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由于HPV目前尚不能体外大量培养，难以获得大量的有感染性的病毒颗粒；高危型HPV引起的疾病是一个漫长的过程，病毒感染到肿瘤发生约十几年的时间；并且HPV感染是非溶细胞性的，不会在短时间内出现明显的细胞病变，不能进行病毒体外中和实验，难以确切的对疫苗疗效进行评估[7]；目前使用的动物模型多是以HPV16E6/E7和EjRas基因转化细胞而得到的“永生化”的细胞系，因缺少HPV16的L1/L2基因，因此疫苗的保护性研究不充分。故亟待建立HPV疫苗抗病毒和抗肿瘤的动物模型。
基金项目：国家自然科学基金资助课题(39670038) 山东省自然科学基金资助课题
参考文献：
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[2]Jochmus I, Schafer K, Kaath S, et al. Chimeric virus-like particles of the human pepillomavirus type 16 as a prophylactic and therapeutic vaccine[J]. Arch Med Res,1999,30:269
[3]Paintsfi J,Muller M, Picken M,et al. Carboxyl terminus of bovine papillomavirus type-1 L1 protein is not required for capsid formation[J].J Virol,1996,223:238
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[5]于修平, Jenison SA. 人乳头瘤病毒16型E7开放读码框呆编码的免疫表位的定位[J].病毒学报,1990,3:245
[6]Bett AJ, Prevec L,Graham FL. Packaging capacity and stability of human adenovirus type 5 vectors[J].J Virol,1993,67:5911
[7]Schiller JT.Papillomavirus-like particle vaccines for cervical cancer[J].Mol Med Today,1990,5:209
收稿日期：1999-12-14, http://www.100md.com