不同妊娠时期人胎盘绒毛细胞连接蛋白基因表达的研究
作者：张小慧 张建湘 祝继明 李桂源
单位：张小慧(湖南医科大学组织学胚胎学教研室)；张建湘(湖南医科大学组织学胚胎学教研室)；祝继明(湖南医科大学组织学胚胎学教研室)；李桂源(肿瘤研究所，长沙 410078)
关键词：连接蛋白基因；基因表达；绒毛
解剖学报000415 【摘要】 目的 探索妊娠不同时期人胎盘绒毛细胞连接蛋白基因表达的规律及其与细胞分化的关系。 方法 采用多种细胞连接蛋白基因cDNA探针，通过Northern印迹法，研究了不同妊娠时期胎盘绒毛细胞内Cx基因的表达状态。 结果 1. Cx基因表达有器官特异性，绒毛细胞中Cx43、Cx32及Cx40表达，而Cx31.1、Cx33、Cx37、Cx46不表达；2.在不同发育阶段的胎盘绒毛中，Cx43、Cx32、Cx40的表达水平与周龄呈各自特点的曲线关系；3.Cx基因的表达与绒毛细胞的分化及绒毛的形成过程基本一致。 结论 某些Cx基因在调节绒毛细胞分化、增殖与胎盘形态发生过程中可能起重要作用。探索妊娠不同时期人胎盘绒毛细胞连接蛋白基因表达的规律及其与细胞分化的关系。 方法 采用多种细胞连接蛋白基因cDNA探针，通过Northern印迹法，研究了不同妊娠时期胎盘绒毛细胞内Cx基因的表达状态。 结果 1. Cx基因表达有器官特异性，绒毛细胞中Cx43、Cx32及Cx40表达，而Cx31.1、Cx33、Cx37、Cx46不表达；2.在不同发育阶段的胎盘绒毛中，Cx43、Cx32、Cx40的表达水平与周龄呈各自特点的曲线关系；3.Cx基因的表达与绒毛细胞的分化及绒毛的形成过程基本一致。 结论 某些Cx基因在调节绒毛细胞分化、增殖与胎盘形态发生过程中可能起重要作用。
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【中图分类号】 R329.2 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)04-351
CONNEXIN GENES EXPRESSION OF HUMAN PLACENTA
AT DIFFERENT PREGNANT STAGES
ZHANG Xiao-hui ZHANG Jian-xiang ZHU Ji-ming
(Department of Histology and Embryology)
LI Gui-yuan
(Cancer Research Institute, Hunan Medical University, Changsha, 410078 China)
, 百拇医药
【Abstract】 Objective
To investigate the role of connexin gene expression of placental chorial cells and its relationship with cellular differenciation. Methods Northern blot method with cDNA molecular probes of connexin genes Cx31.1,Cx32,Cx33,Cx37,Cx40,Cx43,Cx46 were used in the experiment. Results Northern blot demonstrated that:1.The expression of Cx gene had organic specificity.In human placental chorion, Cx43,Cx40 and Cx32 were expressed while other Cx genes weren't 2.The expression of Cx genes showed different levels in different stages of pregnancy.3.The expression levels of Cx genes were compatible with the differenciation and development of placental villous cells. Conclusion Cx gene expression appears more likely to play a key role in regulating differentiation, proliferation of chorial cells and placental morphogenesis.
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【Key words】 Connexin gene; Gene expression; Chorial cell
缝隙连接通道蛋白由连接蛋白基因(connexin, Cx)编码，至少已发现了这个多基因家族有13个成员[1]。它们的碱基顺序有高度同源性，结构相似，在组织的分布既有专一性，又有交叉性[2]。
胎盘的正常发育对于妊娠的维持和进展起重要作用[3]。而胎盘在发育和功能活动过程中自始至终没有神经系统支配，长距离信息传递和调控不可能进行，胚胎各部分细胞的生长发育与分化离不开细胞间化学信息的交换，因此，缝隙连接介导的细胞与细胞之间的直接通讯就成为其进行信息交换的关键通道。研究发现，小鼠胚胎从8细胞期开始形成缝隙连接，但连接蛋白的前体分子在4细胞期已经存在[4]。在大鼠胎盘的发育过程中已发现Cx基因表达的启动与滋养层细胞同侵入到表型分化过程的启动相平行[1]。因此，Cx基因的表达状态在胚胎发育、细胞分化和生长控制等生物过程中起重要作用。
, 百拇医药
为探索人胚胎不同发育时期胎盘绒毛细胞连接蛋白基因表达的时间顺序、规律及其与细胞分化的关系，本研究采用不同连接蛋白基因cDNA探针，通过Northern印迹法，旨在研究Cx基因表达在胎盘发育中的功能意义。
材料和方法
1 材料
取自愿流产的妊娠4～9周(胚胎龄)的健康胎盘绒毛，液氮中保存，胚胎龄按月经龄减14d计算。标本总共33例，根据受精龄分为6组，每周为1组，每组5～6例标本。
2 Northern印记法
2.1 绒毛组织细胞总RNA的提取：所用玻璃器皿均于使用前180℃干烤8h，塑料制品用氯仿浸泡15min后，再经121℃高压蒸汽灭菌15min，所用试剂主要为TrizolTM试剂(Gibcol/BRL公司)，根据试剂盒说明提取组织总RNA，A260/A280在1.7～1.8之间，浓度为3.2～4.6g/L，于-70℃保存。
, 百拇医药
2.2 DNA探针的制备：
2.2.1 质粒DNA的抽提 分别将7种携带pCx质粒及内对照GAPDH质粒的细菌小量复苏后，划琼脂糖平皿，37℃培养过夜后挑取单菌落进行小量扩增，采用碱裂解法快速提取质粒，用相应的内切酶消化鉴定。将鉴定确认后的克隆进行大量扩增和抽提质粒DNA。A260/A280在1.8以上，产量为1.5mg/L。探针资料见表1。
表1 所用探针资料一览表
Table 1 A list of probes 探针
probes
限制性内切酶位点
enonuclease site
插入片断(kb)
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inserts(kb)
来 源
origin
Cx31.1
Bg1 Ⅱ
0.85
小鼠(mouse)
Cx32
EcoR Ⅰ
1.5
大鼠(rat)
Cx33
, http://www.100md.com Bg1 Ⅱ
0.9
大鼠(rat)
Cx37
Hind Ⅲ/Xba Ⅰ
1.25
小鼠(mouse)
Cx40
EcoR Ⅰ/Xba Ⅰ
1.1
小鼠(mouse)
Cx43
, http://www.100md.com BamH Ⅰ
1.11
人(human)
Cx46
EcoR Ⅰ
1.6
人(human)
GAPDH
EcoR Ⅰ/Hind Ⅲ
0.6
人(human)
2.2.2 探针标记：用合适的限切酶消化各种pCx质粒DNA，电泳回收其插入片段。取合适的量，用α-32P dCTP(北京亚辉生物医学工程公司产品)以随机引物标记法(Randomprimer labeling kit, Promega)标记之。标记产物通过过柱纯化后，-20℃贮存备用。
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2.3 Northern杂交：
2.3.1 RNA变性电泳和转膜：根据所测A值，每组各取两例绒毛组织RNA上样(每泳道40μgRNA)，在1%的琼脂糖甲醛变性凝胶上50V电泳3～4h，用DEPC处理水淋洗凝胶数次，用0.05 mol/L的NaOH溶液摇洗凝胶20min，DEPC处理的水淋洗几次后再用20×SSC溶液摇洗45min，采用纸巾转移法将凝胶中的RNA转移至尼龙膜上，最后用1.5J/cm2紫外辐射将RNA交联固定在尼龙膜上。
2.3.2 RNA-DNA杂交：用一张膜先后与Cx探针和GAPDH探针杂交，即与Cx探针杂交、曝光、显影后，在0.1%SDS/0.2×SSC溶液中煮沸10min，使Cx探针洗脱，再与GAPDH探针杂交。具体杂交过程如下：尼龙膜在6×SSC溶液中浸泡5min，然后在10ml预杂交液(1%BSA，0.5 mol/L NaH2PO4-Na2HPO4,1 mmol/L EDTA, 7%SDS,100mg/L ssDNA)中68℃预杂交4～5h，将纯化的标记探针变性后直接加入预杂交液中68℃杂交24h。用1×SSC/0.1%SDS室温下浸泡10min后于37℃洗膜20min，然后用0.1%SDS/0.2×SSC于65℃摇洗20min。-70℃放射自显影。
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2.3.3 数据处理：Northern结果用TIPAS98图像分析仪的图像分析系统进行灰度扫描，分析测定面积的积分光密度值(IA)。样本量的数值(ⅠA比值)以目的片段的ⅠA/GAPDH的ⅠA的比值来表示。
结果
采用细胞连接蛋白基因Cx31.1、Cx32、Cx33、Cx37、Cx40、Cx43和Cx46作为分子探针，通过Northern印迹法，结果发现(1)Cx31.1、Cx33、Cx37、Cx46在妊娠第4～9周的人胎盘绒毛中不表达(阴性结果未显示)，而Cx基因家族中只有Cx43、Cx32及Cx40表达(图1，2)，显示出Cx基因在胎盘绒毛中的表达有特异性。(2)在胚胎不同发育阶段的胎盘绒毛中Cx43、Cx32、Cx40呈不同的表达水平，且有一定的时间规律性(表3)；(3)Cx43在绒毛表达的3种连接蛋白基因中其表达程度最高，提示Cx43在胎盘绒毛发育中起主导作用(图1)。
, 百拇医药
图1 Cx43和Cx32基因在不同妊娠阶段胎盘绒毛中的表达
A.Cx43 B.Cx32 1.妊娠第4周 2.妊娠第5周 3、4.妊娠第6周
5、6.妊娠第7周 7.妊娠第8周 8.妊娠第9周
Fig.1 Expression of Cx43 and Cx32 in placental chorion at different pregnant stages
1，4th week of pregnancy 2,5th week of pregnancy 3，4， 6th week of pregnancy
5，6，7th week of pregnancy 7，8th week of pregnancy 8，9th week of pregnancy
, 百拇医药
图2 Cx40在不同妊娠阶段胎盘绒毛中的表达
1.胚胎第4周 2.胚胎第5周 3、4.胚胎第6周
5.胚胎第7周 6.胚胎第8周 7.胚胎第9周
Fig.2 Expression of Cx40 in placental
chorion at different pregnant stages
1，4thweek of pregnancy 2,5thweek of pregnancy
3、4. 6th week of pregnancy 5，7th week of pregnancy
6，8th week of pregnancy 7，9th week of pregnancy
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表2 不同妊娠时期绒毛Cx基因表达的
Northern结果ⅠA值
Table 2 ⅠA score of Cx Northern blot in placent at
different pregnant stages Cx基因
Cx genes
第4周
4th week
第5周
5th week
第6周
, 百拇医药 6th week
第7周
7th week
第8周
8th week
第9周
9th week
Cx43
0.77
1.12
2.15
2.97
2.32
, 百拇医药
0.42
Cx32
-
-
-
0.20
-
-
Cx40
0.48
1.06
1.57
0.97
, 百拇医药
-
0.15
讨论
细胞连接蛋白基因家族在胎盘绒毛组织中只有Cx43,Cx40和Cx32表达，且表达水平不同，而被研究家族的其他成员不表达，显现出Cx基因表达的组织特异性和多样性，该研究结果与张志谦[2]的报道一致。Kumar等[5]认为每种连接蛋白基因的表达均依赖细胞的类型和发育的时间，Grummer[1]最近证实，在大鼠妊娠期间的滋养层细胞分化过程中，连接蛋白基因的表达启动以时空形式进行。Cx基因的多样性导致不同的通道特性。妊娠早期，绒毛的滋养层细胞分化出细胞滋养层和合体滋养层细胞，绒毛中轴逐渐分化出不同的细胞类型，如结缔组织细胞、血管内皮细胞。胎盘中各种细胞的分化和功能活动没有神经系统支配，Loewenstein[6]认为，细胞的分化过程能被缝隙连接介导的细胞与细胞之间的直接通讯协调。缝隙连接允许小分子物质如cAMP,IP3及分子量达1kD的离子如Ca2+转运至相邻细胞，因此被认为不仅在发育过程中而且在细胞分化、增殖和组织形成过程中起重要作用。
, 百拇医药
表3 不同妊娠时期胎盘绒毛Cx基因
的表达水平(根据电泳带强度)
Table 3 Expression of Cx genes in placental
villi at different pregnant stages(according to
intensity of electrophoresis band) Cx基因
Cx genes
第4周
4th week
第5周
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5th week
第6周
6th week
第7周
7th week
第8周
8th week
第9周
9th week
Cx31.1
-
-
-
, 百拇医药
-
-
-
Cx32
-
-
-
±or-
-
-
Cx33
-
-
, 百拇医药 -
-
-
-
Cx37
-
-
-
-
-
-
Cx40
±
+
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+ +
+
-
±
Cx43
±
+
+ +
+ + +
+ +
±
Cx46
-
-
, 百拇医药
-
-
-
-
+ + +.高度表达 + +.中度表达 +.低度表达 ±.微弱表达 -.不表达
+ + +，high expression + +,middle expression +,lower expression ±weak expression -no expression
Northern结果的ⅠA值(表3)显示Cx43和Cx40的表达均为逐渐上升达峰值后又逐渐下降的过程，但4～9周Cx43表达程度均高于Cx40，提示Cx43在胎盘绒毛的发育过程中起主导作用。Cx43的表达和妊娠周龄的这种曲线关系与细胞滋养层的分化相平行，因此认为该基因的表达与消长与细胞滋养层的分化有关。此研究结果与Grummer[1]的研究一致，他报道大鼠正常绒毛的滋养层细胞株表达Cx43，绒癌细胞株Cx43明显降低，而体外培养绒癌细胞，并用视黄酸处理7d后，绒癌细胞表现为Cx43转录产物的表达上调。此实验表明细胞连接蛋白基因在哺乳动物胎盘发育中起重要作用[7]。
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Cx40在妊娠第6周的胎盘绒毛中表达程度较高，我们认为该基因的表达与绒毛中轴的结缔组织和血管发生有关。Cx32只在第7周有微弱表达，图1中lane6结果为阴性，原因可能为该道RNA的上样量少，而该基因本身表达丰度弱，故而未检测到该基因的表达，此外，与样本的差异有关，因每道样本来源于不同的流产者。Cx32可能与绒毛中轴的间充质细胞分化为成纤维细胞有关。
因此，连接蛋白基因在胎盘早期的表达使细胞间通讯通道得以建立，使那些在细胞分化、生长控制和形态建立中起调节作用的物质得以通过细胞间转运成为可能。本研究表明，连接蛋白基因的表达水平与胎盘绒毛组织中细胞分化及其结构发生过程基本一致，说明某些Cx基因可能在调节早期绒毛发育过程中对细胞分化、增殖起重要作用。
【基金项目】 国家自然科学基金资助项目(39680031)
【作者简介】 张小慧(1970—)，女(汉族)，湖南临澧人，博士
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参考文献
[1]Grummer R,Hellmann P,Traub O, et al.Regulation of connexin31 gene expression upon retinoic acid treatment in rat choriocarcinoma cells[J].Exp Cell Res,1996,227(1):23-32.
[2]张志谦，林仲翔.连接蛋白家族、细胞间隙连接通讯与肿瘤抑制[J].生理科学进展，1994，25(2)：121～125.
[3]Cross J C,Werb Z, Fisher S J. Implantation and the placenta:key pieces of the development puzzle[J].Science,1994,266(12):1508-1518.
, 百拇医药
[4]王绳琦.间隙连接与发育[J].细胞生物学杂志，1988，10(1)：20～24.
[5]Kumar N M, Gilula N B.Molecular biology and genetics of gap junction channels[J].Sem Cell Bio,1992,13(1):3-16.
[6]Loewenstein W R.The cell-to-cell channel of gap junctions[J].Cell,1987,48(5):725-726.
【收稿日期】 1999-08-27
【修回日期】 2000-01-07, http://www.100md.com
单位：张小慧(湖南医科大学组织学胚胎学教研室)；张建湘(湖南医科大学组织学胚胎学教研室)；祝继明(湖南医科大学组织学胚胎学教研室)；李桂源(肿瘤研究所，长沙 410078)
关键词：连接蛋白基因；基因表达；绒毛
解剖学报000415 【摘要】 目的 探索妊娠不同时期人胎盘绒毛细胞连接蛋白基因表达的规律及其与细胞分化的关系。 方法 采用多种细胞连接蛋白基因cDNA探针，通过Northern印迹法，研究了不同妊娠时期胎盘绒毛细胞内Cx基因的表达状态。 结果 1. Cx基因表达有器官特异性，绒毛细胞中Cx43、Cx32及Cx40表达，而Cx31.1、Cx33、Cx37、Cx46不表达；2.在不同发育阶段的胎盘绒毛中，Cx43、Cx32、Cx40的表达水平与周龄呈各自特点的曲线关系；3.Cx基因的表达与绒毛细胞的分化及绒毛的形成过程基本一致。 结论 某些Cx基因在调节绒毛细胞分化、增殖与胎盘形态发生过程中可能起重要作用。探索妊娠不同时期人胎盘绒毛细胞连接蛋白基因表达的规律及其与细胞分化的关系。 方法 采用多种细胞连接蛋白基因cDNA探针，通过Northern印迹法，研究了不同妊娠时期胎盘绒毛细胞内Cx基因的表达状态。 结果 1. Cx基因表达有器官特异性，绒毛细胞中Cx43、Cx32及Cx40表达，而Cx31.1、Cx33、Cx37、Cx46不表达；2.在不同发育阶段的胎盘绒毛中，Cx43、Cx32、Cx40的表达水平与周龄呈各自特点的曲线关系；3.Cx基因的表达与绒毛细胞的分化及绒毛的形成过程基本一致。 结论 某些Cx基因在调节绒毛细胞分化、增殖与胎盘形态发生过程中可能起重要作用。
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【中图分类号】 R329.2 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)04-351
CONNEXIN GENES EXPRESSION OF HUMAN PLACENTA
AT DIFFERENT PREGNANT STAGES
ZHANG Xiao-hui ZHANG Jian-xiang ZHU Ji-ming
(Department of Histology and Embryology)
LI Gui-yuan
(Cancer Research Institute, Hunan Medical University, Changsha, 410078 China)
, 百拇医药
【Abstract】 Objective
To investigate the role of connexin gene expression of placental chorial cells and its relationship with cellular differenciation. Methods Northern blot method with cDNA molecular probes of connexin genes Cx31.1,Cx32,Cx33,Cx37,Cx40,Cx43,Cx46 were used in the experiment. Results Northern blot demonstrated that:1.The expression of Cx gene had organic specificity.In human placental chorion, Cx43,Cx40 and Cx32 were expressed while other Cx genes weren't 2.The expression of Cx genes showed different levels in different stages of pregnancy.3.The expression levels of Cx genes were compatible with the differenciation and development of placental villous cells. Conclusion Cx gene expression appears more likely to play a key role in regulating differentiation, proliferation of chorial cells and placental morphogenesis.
, http://www.100md.com
【Key words】 Connexin gene; Gene expression; Chorial cell
缝隙连接通道蛋白由连接蛋白基因(connexin, Cx)编码，至少已发现了这个多基因家族有13个成员[1]。它们的碱基顺序有高度同源性，结构相似，在组织的分布既有专一性，又有交叉性[2]。
胎盘的正常发育对于妊娠的维持和进展起重要作用[3]。而胎盘在发育和功能活动过程中自始至终没有神经系统支配，长距离信息传递和调控不可能进行，胚胎各部分细胞的生长发育与分化离不开细胞间化学信息的交换，因此，缝隙连接介导的细胞与细胞之间的直接通讯就成为其进行信息交换的关键通道。研究发现，小鼠胚胎从8细胞期开始形成缝隙连接，但连接蛋白的前体分子在4细胞期已经存在[4]。在大鼠胎盘的发育过程中已发现Cx基因表达的启动与滋养层细胞同侵入到表型分化过程的启动相平行[1]。因此，Cx基因的表达状态在胚胎发育、细胞分化和生长控制等生物过程中起重要作用。
, 百拇医药
为探索人胚胎不同发育时期胎盘绒毛细胞连接蛋白基因表达的时间顺序、规律及其与细胞分化的关系，本研究采用不同连接蛋白基因cDNA探针，通过Northern印迹法，旨在研究Cx基因表达在胎盘发育中的功能意义。
材料和方法
1 材料
取自愿流产的妊娠4～9周(胚胎龄)的健康胎盘绒毛，液氮中保存，胚胎龄按月经龄减14d计算。标本总共33例，根据受精龄分为6组，每周为1组，每组5～6例标本。
2 Northern印记法
2.1 绒毛组织细胞总RNA的提取：所用玻璃器皿均于使用前180℃干烤8h，塑料制品用氯仿浸泡15min后，再经121℃高压蒸汽灭菌15min，所用试剂主要为TrizolTM试剂(Gibcol/BRL公司)，根据试剂盒说明提取组织总RNA，A260/A280在1.7～1.8之间，浓度为3.2～4.6g/L，于-70℃保存。
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2.2 DNA探针的制备：
2.2.1 质粒DNA的抽提 分别将7种携带pCx质粒及内对照GAPDH质粒的细菌小量复苏后，划琼脂糖平皿，37℃培养过夜后挑取单菌落进行小量扩增，采用碱裂解法快速提取质粒，用相应的内切酶消化鉴定。将鉴定确认后的克隆进行大量扩增和抽提质粒DNA。A260/A280在1.8以上，产量为1.5mg/L。探针资料见表1。
表1 所用探针资料一览表
Table 1 A list of probes 探针
probes
限制性内切酶位点
enonuclease site
插入片断(kb)
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inserts(kb)
来 源
origin
Cx31.1
Bg1 Ⅱ
0.85
小鼠(mouse)
Cx32
EcoR Ⅰ
1.5
大鼠(rat)
Cx33
, http://www.100md.com Bg1 Ⅱ
0.9
大鼠(rat)
Cx37
Hind Ⅲ/Xba Ⅰ
1.25
小鼠(mouse)
Cx40
EcoR Ⅰ/Xba Ⅰ
1.1
小鼠(mouse)
Cx43
, http://www.100md.com BamH Ⅰ
1.11
人(human)
Cx46
EcoR Ⅰ
1.6
人(human)
GAPDH
EcoR Ⅰ/Hind Ⅲ
0.6
人(human)
2.2.2 探针标记：用合适的限切酶消化各种pCx质粒DNA，电泳回收其插入片段。取合适的量，用α-32P dCTP(北京亚辉生物医学工程公司产品)以随机引物标记法(Randomprimer labeling kit, Promega)标记之。标记产物通过过柱纯化后，-20℃贮存备用。
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2.3 Northern杂交：
2.3.1 RNA变性电泳和转膜：根据所测A值，每组各取两例绒毛组织RNA上样(每泳道40μgRNA)，在1%的琼脂糖甲醛变性凝胶上50V电泳3～4h，用DEPC处理水淋洗凝胶数次，用0.05 mol/L的NaOH溶液摇洗凝胶20min，DEPC处理的水淋洗几次后再用20×SSC溶液摇洗45min，采用纸巾转移法将凝胶中的RNA转移至尼龙膜上，最后用1.5J/cm2紫外辐射将RNA交联固定在尼龙膜上。
2.3.2 RNA-DNA杂交：用一张膜先后与Cx探针和GAPDH探针杂交，即与Cx探针杂交、曝光、显影后，在0.1%SDS/0.2×SSC溶液中煮沸10min，使Cx探针洗脱，再与GAPDH探针杂交。具体杂交过程如下：尼龙膜在6×SSC溶液中浸泡5min，然后在10ml预杂交液(1%BSA，0.5 mol/L NaH2PO4-Na2HPO4,1 mmol/L EDTA, 7%SDS,100mg/L ssDNA)中68℃预杂交4～5h，将纯化的标记探针变性后直接加入预杂交液中68℃杂交24h。用1×SSC/0.1%SDS室温下浸泡10min后于37℃洗膜20min，然后用0.1%SDS/0.2×SSC于65℃摇洗20min。-70℃放射自显影。
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2.3.3 数据处理：Northern结果用TIPAS98图像分析仪的图像分析系统进行灰度扫描，分析测定面积的积分光密度值(IA)。样本量的数值(ⅠA比值)以目的片段的ⅠA/GAPDH的ⅠA的比值来表示。
结果
采用细胞连接蛋白基因Cx31.1、Cx32、Cx33、Cx37、Cx40、Cx43和Cx46作为分子探针，通过Northern印迹法，结果发现(1)Cx31.1、Cx33、Cx37、Cx46在妊娠第4～9周的人胎盘绒毛中不表达(阴性结果未显示)，而Cx基因家族中只有Cx43、Cx32及Cx40表达(图1，2)，显示出Cx基因在胎盘绒毛中的表达有特异性。(2)在胚胎不同发育阶段的胎盘绒毛中Cx43、Cx32、Cx40呈不同的表达水平，且有一定的时间规律性(表3)；(3)Cx43在绒毛表达的3种连接蛋白基因中其表达程度最高，提示Cx43在胎盘绒毛发育中起主导作用(图1)。
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图1 Cx43和Cx32基因在不同妊娠阶段胎盘绒毛中的表达
A.Cx43 B.Cx32 1.妊娠第4周 2.妊娠第5周 3、4.妊娠第6周
5、6.妊娠第7周 7.妊娠第8周 8.妊娠第9周
Fig.1 Expression of Cx43 and Cx32 in placental chorion at different pregnant stages
1，4th week of pregnancy 2,5th week of pregnancy 3，4， 6th week of pregnancy
5，6，7th week of pregnancy 7，8th week of pregnancy 8，9th week of pregnancy
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图2 Cx40在不同妊娠阶段胎盘绒毛中的表达
1.胚胎第4周 2.胚胎第5周 3、4.胚胎第6周
5.胚胎第7周 6.胚胎第8周 7.胚胎第9周
Fig.2 Expression of Cx40 in placental
chorion at different pregnant stages
1，4thweek of pregnancy 2,5thweek of pregnancy
3、4. 6th week of pregnancy 5，7th week of pregnancy
6，8th week of pregnancy 7，9th week of pregnancy
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表2 不同妊娠时期绒毛Cx基因表达的
Northern结果ⅠA值
Table 2 ⅠA score of Cx Northern blot in placent at
different pregnant stages Cx基因
Cx genes
第4周
4th week
第5周
5th week
第6周
, 百拇医药 6th week
第7周
7th week
第8周
8th week
第9周
9th week
Cx43
0.77
1.12
2.15
2.97
2.32
, 百拇医药
0.42
Cx32
-
-
-
0.20
-
-
Cx40
0.48
1.06
1.57
0.97
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0.15
讨论
细胞连接蛋白基因家族在胎盘绒毛组织中只有Cx43,Cx40和Cx32表达，且表达水平不同，而被研究家族的其他成员不表达，显现出Cx基因表达的组织特异性和多样性，该研究结果与张志谦[2]的报道一致。Kumar等[5]认为每种连接蛋白基因的表达均依赖细胞的类型和发育的时间，Grummer[1]最近证实，在大鼠妊娠期间的滋养层细胞分化过程中，连接蛋白基因的表达启动以时空形式进行。Cx基因的多样性导致不同的通道特性。妊娠早期，绒毛的滋养层细胞分化出细胞滋养层和合体滋养层细胞，绒毛中轴逐渐分化出不同的细胞类型，如结缔组织细胞、血管内皮细胞。胎盘中各种细胞的分化和功能活动没有神经系统支配，Loewenstein[6]认为，细胞的分化过程能被缝隙连接介导的细胞与细胞之间的直接通讯协调。缝隙连接允许小分子物质如cAMP,IP3及分子量达1kD的离子如Ca2+转运至相邻细胞，因此被认为不仅在发育过程中而且在细胞分化、增殖和组织形成过程中起重要作用。
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表3 不同妊娠时期胎盘绒毛Cx基因
的表达水平(根据电泳带强度)
Table 3 Expression of Cx genes in placental
villi at different pregnant stages(according to
intensity of electrophoresis band) Cx基因
Cx genes
第4周
4th week
第5周
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5th week
第6周
6th week
第7周
7th week
第8周
8th week
第9周
9th week
Cx31.1
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-
-
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Cx32
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±or-
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Cx33
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Cx37
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-
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Cx40
±
+
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+ +
+
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±
Cx43
±
+
+ +
+ + +
+ +
±
Cx46
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-
+ + +.高度表达 + +.中度表达 +.低度表达 ±.微弱表达 -.不表达
+ + +，high expression + +,middle expression +,lower expression ±weak expression -no expression
Northern结果的ⅠA值(表3)显示Cx43和Cx40的表达均为逐渐上升达峰值后又逐渐下降的过程，但4～9周Cx43表达程度均高于Cx40，提示Cx43在胎盘绒毛的发育过程中起主导作用。Cx43的表达和妊娠周龄的这种曲线关系与细胞滋养层的分化相平行，因此认为该基因的表达与消长与细胞滋养层的分化有关。此研究结果与Grummer[1]的研究一致，他报道大鼠正常绒毛的滋养层细胞株表达Cx43，绒癌细胞株Cx43明显降低，而体外培养绒癌细胞，并用视黄酸处理7d后，绒癌细胞表现为Cx43转录产物的表达上调。此实验表明细胞连接蛋白基因在哺乳动物胎盘发育中起重要作用[7]。
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Cx40在妊娠第6周的胎盘绒毛中表达程度较高，我们认为该基因的表达与绒毛中轴的结缔组织和血管发生有关。Cx32只在第7周有微弱表达，图1中lane6结果为阴性，原因可能为该道RNA的上样量少，而该基因本身表达丰度弱，故而未检测到该基因的表达，此外，与样本的差异有关，因每道样本来源于不同的流产者。Cx32可能与绒毛中轴的间充质细胞分化为成纤维细胞有关。
因此，连接蛋白基因在胎盘早期的表达使细胞间通讯通道得以建立，使那些在细胞分化、生长控制和形态建立中起调节作用的物质得以通过细胞间转运成为可能。本研究表明，连接蛋白基因的表达水平与胎盘绒毛组织中细胞分化及其结构发生过程基本一致，说明某些Cx基因可能在调节早期绒毛发育过程中对细胞分化、增殖起重要作用。
【基金项目】 国家自然科学基金资助项目(39680031)
【作者简介】 张小慧(1970—)，女(汉族)，湖南临澧人，博士
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参考文献
[1]Grummer R,Hellmann P,Traub O, et al.Regulation of connexin31 gene expression upon retinoic acid treatment in rat choriocarcinoma cells[J].Exp Cell Res,1996,227(1):23-32.
[2]张志谦，林仲翔.连接蛋白家族、细胞间隙连接通讯与肿瘤抑制[J].生理科学进展，1994，25(2)：121～125.
[3]Cross J C,Werb Z, Fisher S J. Implantation and the placenta:key pieces of the development puzzle[J].Science,1994,266(12):1508-1518.
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[4]王绳琦.间隙连接与发育[J].细胞生物学杂志，1988，10(1)：20～24.
[5]Kumar N M, Gilula N B.Molecular biology and genetics of gap junction channels[J].Sem Cell Bio,1992,13(1):3-16.
[6]Loewenstein W R.The cell-to-cell channel of gap junctions[J].Cell,1987,48(5):725-726.
【收稿日期】 1999-08-27
【修回日期】 2000-01-07, http://www.100md.com