CD28与B7.1共刺激PBLs受肝癌细胞诱导后的TCR Vβ基因表达
作者：杨红 李菁华 黄树林:, http://www.100md.com
单位：杨红(广东药学院分子生物学研究室，广东 广州 510224)； 黄树林(广东药学院分子生物学研究室，广东 广州 510224)； 李菁华(白求恩医科大学微生物学教研室，吉林 长春130021):, http://www.100md.com
关键词：TCR Vβ基因；CD28+B7.1(CD80)；基因表达:, http://www.100md.com
免疫学杂志000113 摘 要：目的 研究T细胞受体(TCR)Vβ在外周血淋巴细胞(PBLs)中的表达。方法 用单克隆抗体CD28+B7.1(CD80)共刺激正常人外周血淋巴细胞后作用于肝癌细胞(BEL-7402)。结果 发现PBLs TCR Vβ7基因在体外选择性扩增，表达水平为15%～25%，对照组为4%～8%。结论 Vβ7基因对识别肿瘤抗原具有特异性，为肿瘤基因治疗和研究提供新的线索和实验依据。:, http://www.100md.com
中图分类号：R392.11 文献标识码：A:, http://www.100md.com
Selective expression of TCR Vβ gene in PBLs costimulated by:, http://www.100md.com
CD28+B7.1 and induced by hepatoma cell:, http://www.100md.com
YANG Hong HUANG Shu-lin:, http://www.100md.com
(Department of Molecular Biology， Guangdong Pharmacy College， Guangzhou 510224，China):, http://www.100md.com
LI JING-hua:, http://www.100md.com
(Department of microbiology，Bethune University of Medical Sciences，Changchun 130021，China):, http://www.100md.com
Abstract：Objective To investig ate selective expression of T cell receptor(TCR) Vβ gene in peripheral blood lymphocytes(PBLs).Methods The healthy human PBLs were costimulated by anti-CD28 and anti-CD80(B7.1) McAb and induced by hepatoma cells(BEL-7402).Results TCR Vβ7 gene were selectively amplified in PBLs induced by BEL-7402 cells and the expression level of Vβ7 was much higher in these cells than in controls (15%～25% vs 4%～8%).Conclusion Vβ7 gene may specialize in recognizing tumor antigen. Our study offers new clues and experimental basis for gene treatment of tumor.
Key words：TCR Vβ gene； CD28+B7.1(CD80)；gene expression▲9m11-v1, 百拇医药
TCR是参与特异性免疫的重要分子，在T淋巴细胞活化过程中识别和结合配体。研究发现正常个体在抗原刺激下，外周血淋巴细胞(PBLs)TCR Vβ基因随抗原类型不同或疾病的不同临床阶段呈选择性扩增[1]。大量实验证实，抗原(Ag)与TCR的结合仅仅是免疫应答的开始，只有当抗原递呈细胞(APC)表达B7分子，作用于T细胞表面的CD28受体作为第二刺激信号，T细胞才被激活，分裂增殖。在生理状态下，未经刺激的APC表面不表达B7.1分子或表达水平极低不能引起有效的抗肿瘤免疫应答，CD28与B7.1的相互作用提供了T细胞活化所必需的主要共刺激信号[2]。为更好地增强APC呈递能力和提供充足的共刺激信号，本研究用CD28+B7.1(CD80)共激活PBLs后作用肝癌细胞(BEL-7402)，研究探讨PBLs TCR Vβ亚家族基因的选择性表达特征。9m11-v1, 百拇医药
1 材料与方法9m11-v1, 百拇医药
1.1 试剂及仪器9m11-v1, 百拇医药
抗CD28、CD80单克隆抗体(McAb)冻干粉购自Immunotech公司；Taq DNA聚合酶、AMV逆转录酶、RNAsin、dNTPs、DTT购自Promaga公司，DEPC、RPMI1640购自Sigma公司；其他试剂为国产AR试剂。基因扩增仪GeneE(英国)，CO2培养箱BNA-311(日本)，凝胶成象扫描仪Gel Doc-1000(Bio-Rad)。9m11-v1, 百拇医药
1.2 方法9m11-v1, 百拇医药
1.2.1 淋巴细胞培养：健康成年人全血购自市中心血站。100ml血用Ficoll密度梯度离心分离单核细胞，用RPMI 1640培养(含10%灭活小牛血清)，每管10ml，分别加入维持量IL-2(20u/ml)、CD28+CD80(各为0.4μg/ml)，在37°C、5%CO2孵箱中培养3d。9m11-v1, 百拇医药
1.2.2 肝癌细胞(BEL-7402)培养：肝癌细胞系(BEL-7402)由中山医科大学肿瘤所赠。用0.25%胰蛋白酶消化，加2ml 1640液吹散细胞，再加入含10%小牛血清的1640液，共10ml。在37°C、5%CO2孵箱中培养，直至形成单层细胞，倾出培养液，加入抗体诱导的淋巴细胞培养1d，对照组不作用肝癌细胞，收获细胞，-70°C保存备用。
1.2.3 RNA提取： RNA提取参见CHOMCZY-NSKI方法[3]。@}^-g2], 百拇医药
1.2.4 引物设计： 参见文献[4，5]，序列见文献[12]。@}^-g2], 百拇医药
1.2.5 cDNA合成、RT-PCR检测TCR Vβ基因：参见文献[6]。@}^-g2], 百拇医药
1.2.6 探针标记、Southern杂交、化学发光与X光片显影等(Lumi-phos530)：见文献[7]。@}^-g2], 百拇医药
1.2.7 图象分析[5]：Southern杂交后的X-胶片用凝胶成象扫描仪进行处理，TCR Vβ所形成的一条密度带被转化为数字，用NIH-图象分析软件(1.57版本)在计算机上进行处理，用公式：(Vβ的密度)×100/(Vβ1-22)的累积密度，计算TCR Vβ的相关频率[8]。@}^-g2], 百拇医药
2 结果@}^-g2], 百拇医药
2.1 TCR Vβ基因Southern杂交 图1是CD28+CD80协同刺激健康人PBLs(对照组)及受肝癌细胞BEL-7402诱导(实验组)后TCR Vβ基因PCR产物Southern杂交印迹图。由图可见，在肝癌抗原刺激下，PBLs中TCR Vβ7亚家族基因片段呈选择性优势扩增(见箭头所示)。
@}^-g2], 百拇医药
图1 PBLs TCR Vβ基因PCR产物Southern杂交图谱@}^-g2], 百拇医药
Fig1 Southern hybridization map of PBLs TCR Vβ gene PCR product@}^-g2], 百拇医药
A(control)：Southern hybridization map of TCR Vβ gene PCR product costimulated by CD28+CD80@}^-g2], 百拇医药
B(treatment)：Southern hybridization map TCR Vβ gene PCR product costimulated by CD28+CD80， and induced by hepatoma cells
2.2 TCR Vβ基因表达水平检测 图2是CD28+CD80协同刺激健康人PBLs(对照组)及受肝癌细胞BEL-7402诱导(实验组)后，PBLs TCR Vβ基因表达水平检测。光密度扫描结果显示，在肝癌抗原刺激下，Vβ7亚家族基因表达显著升高，表达水平为24.41%。
!1, 百拇医药
图2 PBLs TCR Vβ基因亚家族表达水平(%)!1, 百拇医药
Fig2 The expression level of TCR Vβ gene subfamilies of PBLs (%)!1, 百拇医药
Control： The expression level of TCR Vβ gene subfamilies of PBLs costimulated by CD28+CD80!1, 百拇医药
Treatment：The expression level of TCR Vβ gene subfamilies of PBLs costimulated by CD28+CD80 and induced by hepatoma cells!1, 百拇医药
3 讨论!1, 百拇医药
TCR是T淋巴细胞接受抗原刺激产生特异性免疫应答的受体，多数T细胞的TCR由α、β链构成，人体TCR β链V基因有25个片段供挑选组成TCR受体库。在没有抗原刺激时，TCR Vβ基因的表达完全是随机的[9]。目前的研究热点在TCR V区基因对抗原的识别机制和特异性表达上，特别是TCR Vβ基因亚家族的使用频率和选择性扩增。有报道，IL-2作用下人TIL的TCR Vβ5、6、8基因呈优势扩增[1]，SIV感染恒河猴淋巴细胞，Vβ7、14基因呈高表达[10]。本室用HSV-2感染健康人PBLs时TCR Vβ2、6、7、8基因表达频率增高，而生殖器单纯疱疹性皮肤病人发作期、中间静止期和再发作期的PBLs用HSV感染时，TCR Vβ基因的表达却不同。这提示在疾病不同发病阶段外周血T细胞识别抗原时，Vβ基因亚家族呈不同的优势扩增[11]。T细胞被激活时除其表面抗原特异性受体感受抗原多肽的刺激之外，另一些受体也必须感受并传递一个附加刺激的受体即CD28，CD28传递的信息可防止T细胞特异性抗原诱发的耐受，同时可以使激活的T细胞内各种细胞因子mRNA(如IL-2mRNA)的稳定性增加。B7.1可使APC表面B7.1分子表达增多，CD28与B7.1的相互作用产生的共刺激信号加强抗原呈递能力，是T细胞应答产生CTL的诱导相中所必需的，是典型的共刺激途径。本文用CD28+B7.1(CD80)协同刺激健康人PBLs后作用于肝癌细胞，结果显示PBLs TCR Vβ7表达水平明显增高，而其它Vβ亚家族基因的表达水平无明显改变，但有个体差异,说明PBLs TCR在接受抗原刺激过程中，Vβ7特异性识别肿瘤抗原而呈优势扩增，且表达水平稳定，为我们下一步研究工作——肿瘤的基因治疗提供特异性片段。■
基金项目：国家自然科学基金(396400005)和广东省科教兴医“五个一”工程重点课题(粤卫科[1996]20号)资助项目)/6v, 百拇医药
作者简介：杨 红(1965-)，女，广东人，讲师，本科，主要从事分子免疫学方面的研究。)/6v, 百拇医药
参考文献：)/6v, 百拇医药
[1]傅体辉.T细胞识别肿瘤的分子机制[J].国外医学免疫学分册，1995，1：23～26.)/6v, 百拇医药
[2]黄树林，罗利琼，肖兰凤，等.McAb共刺激PBLs介导肝癌细胞凋亡[J].中国免疫学杂志，1998，14(2)：154～156.)/6v, 百拇医药
[3]CHOMCZYNSKIS P， NICOLETTA S. Single-step method of RNA isolation by acid guannidinium thiocganate-phenol-chloroform extraction[J]. Analytical Biochem， 1987，162：156～159.)/6v, 百拇医药
[4]ILONA KARIV， ALEMSEGED TRUNEH， RAYMOND W SWEET. Analysis of the site of interaction of CD28 with its counter-receptors CD80 and CD86 and correlation with founction[J]. J Immunol， 1996，157：29～32.)/6v, 百拇医药
[5]DUNN DA， ANNE SG， SWARNALATHA S， et al. T-cell receptor Vβ expression in normal human skin[J]. Proc Natl Acad Sci(USA)， 1993，90：1267～1270.)/6v, 百拇医药
[6]HIDEYUKI I， NORIYUKI S， AKIHIRO M， et al. Analysis of T-cell receptor Vβ region gene usage of cytotoxic T-lymphocytes and tumor-infiltrating lymphocytes derivid from human autologous gastric sigmer ring cell carcinomas[J]. Cancer Res，1993，53：3078～3081.)/6v, 百拇医药
[7]黄树林，陈耕夫，杨 红，等.不同条件和状态HSV感染人外周血淋巴细胞的Vβ受体表达特点[J].中国免疫学杂志，1996，12(增刊)：137～140.)/6v, 百拇医药
[8]MAMHEIM B. Principle of nucleic acid labeling and detection with the genius system[J]. Genius System User S Guide， 1994，22，44～46，66～68.)/6v, 百拇医药
[9]JEFFERY MC， MICHAEL JL. Antigen induced programmed T cell death as a new approach to immune therapy：Clinic immunology and immunopathalogy， 1995，75：13～16.)/6v, 百拇医药
[10]ZHANG WC， KOU ZC， LING S. An acutely lethal simian immunodeficiency virus stimulates expansion of Vβ7-14 expressing T lymphocytes[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1994，9：7501～7505.)/6v, 百拇医药
[11]黄树林，明文玉，罗利琼，等.HSV-2感染人外周血淋巴细胞后TCR Vβ基因片段的选择性扩增[J].上海免疫学杂志，1997，2：98～101.)/6v, 百拇医药
收稿日期：1998-06-09)/6v, 百拇医药
修回日期：1999-10-03(杨红 李菁华 黄树林)
单位：杨红(广东药学院分子生物学研究室，广东 广州 510224)； 黄树林(广东药学院分子生物学研究室，广东 广州 510224)； 李菁华(白求恩医科大学微生物学教研室，吉林 长春130021):, http://www.100md.com
关键词：TCR Vβ基因；CD28+B7.1(CD80)；基因表达:, http://www.100md.com
免疫学杂志000113 摘 要：目的 研究T细胞受体(TCR)Vβ在外周血淋巴细胞(PBLs)中的表达。方法 用单克隆抗体CD28+B7.1(CD80)共刺激正常人外周血淋巴细胞后作用于肝癌细胞(BEL-7402)。结果 发现PBLs TCR Vβ7基因在体外选择性扩增，表达水平为15%～25%，对照组为4%～8%。结论 Vβ7基因对识别肿瘤抗原具有特异性，为肿瘤基因治疗和研究提供新的线索和实验依据。:, http://www.100md.com
中图分类号：R392.11 文献标识码：A:, http://www.100md.com
Selective expression of TCR Vβ gene in PBLs costimulated by:, http://www.100md.com
CD28+B7.1 and induced by hepatoma cell:, http://www.100md.com
YANG Hong HUANG Shu-lin:, http://www.100md.com
(Department of Molecular Biology， Guangdong Pharmacy College， Guangzhou 510224，China):, http://www.100md.com
LI JING-hua:, http://www.100md.com
(Department of microbiology，Bethune University of Medical Sciences，Changchun 130021，China):, http://www.100md.com
Abstract：Objective To investig ate selective expression of T cell receptor(TCR) Vβ gene in peripheral blood lymphocytes(PBLs).Methods The healthy human PBLs were costimulated by anti-CD28 and anti-CD80(B7.1) McAb and induced by hepatoma cells(BEL-7402).Results TCR Vβ7 gene were selectively amplified in PBLs induced by BEL-7402 cells and the expression level of Vβ7 was much higher in these cells than in controls (15%～25% vs 4%～8%).Conclusion Vβ7 gene may specialize in recognizing tumor antigen. Our study offers new clues and experimental basis for gene treatment of tumor.
Key words：TCR Vβ gene； CD28+B7.1(CD80)；gene expression▲9m11-v1, 百拇医药
TCR是参与特异性免疫的重要分子，在T淋巴细胞活化过程中识别和结合配体。研究发现正常个体在抗原刺激下，外周血淋巴细胞(PBLs)TCR Vβ基因随抗原类型不同或疾病的不同临床阶段呈选择性扩增[1]。大量实验证实，抗原(Ag)与TCR的结合仅仅是免疫应答的开始，只有当抗原递呈细胞(APC)表达B7分子，作用于T细胞表面的CD28受体作为第二刺激信号，T细胞才被激活，分裂增殖。在生理状态下，未经刺激的APC表面不表达B7.1分子或表达水平极低不能引起有效的抗肿瘤免疫应答，CD28与B7.1的相互作用提供了T细胞活化所必需的主要共刺激信号[2]。为更好地增强APC呈递能力和提供充足的共刺激信号，本研究用CD28+B7.1(CD80)共激活PBLs后作用肝癌细胞(BEL-7402)，研究探讨PBLs TCR Vβ亚家族基因的选择性表达特征。9m11-v1, 百拇医药
1 材料与方法9m11-v1, 百拇医药
1.1 试剂及仪器9m11-v1, 百拇医药
抗CD28、CD80单克隆抗体(McAb)冻干粉购自Immunotech公司；Taq DNA聚合酶、AMV逆转录酶、RNAsin、dNTPs、DTT购自Promaga公司，DEPC、RPMI1640购自Sigma公司；其他试剂为国产AR试剂。基因扩增仪GeneE(英国)，CO2培养箱BNA-311(日本)，凝胶成象扫描仪Gel Doc-1000(Bio-Rad)。9m11-v1, 百拇医药
1.2 方法9m11-v1, 百拇医药
1.2.1 淋巴细胞培养：健康成年人全血购自市中心血站。100ml血用Ficoll密度梯度离心分离单核细胞，用RPMI 1640培养(含10%灭活小牛血清)，每管10ml，分别加入维持量IL-2(20u/ml)、CD28+CD80(各为0.4μg/ml)，在37°C、5%CO2孵箱中培养3d。9m11-v1, 百拇医药
1.2.2 肝癌细胞(BEL-7402)培养：肝癌细胞系(BEL-7402)由中山医科大学肿瘤所赠。用0.25%胰蛋白酶消化，加2ml 1640液吹散细胞，再加入含10%小牛血清的1640液，共10ml。在37°C、5%CO2孵箱中培养，直至形成单层细胞，倾出培养液，加入抗体诱导的淋巴细胞培养1d，对照组不作用肝癌细胞，收获细胞，-70°C保存备用。
1.2.3 RNA提取： RNA提取参见CHOMCZY-NSKI方法[3]。@}^-g2], 百拇医药
1.2.4 引物设计： 参见文献[4，5]，序列见文献[12]。@}^-g2], 百拇医药
1.2.5 cDNA合成、RT-PCR检测TCR Vβ基因：参见文献[6]。@}^-g2], 百拇医药
1.2.6 探针标记、Southern杂交、化学发光与X光片显影等(Lumi-phos530)：见文献[7]。@}^-g2], 百拇医药
1.2.7 图象分析[5]：Southern杂交后的X-胶片用凝胶成象扫描仪进行处理，TCR Vβ所形成的一条密度带被转化为数字，用NIH-图象分析软件(1.57版本)在计算机上进行处理，用公式：(Vβ的密度)×100/(Vβ1-22)的累积密度，计算TCR Vβ的相关频率[8]。@}^-g2], 百拇医药
2 结果@}^-g2], 百拇医药
2.1 TCR Vβ基因Southern杂交 图1是CD28+CD80协同刺激健康人PBLs(对照组)及受肝癌细胞BEL-7402诱导(实验组)后TCR Vβ基因PCR产物Southern杂交印迹图。由图可见，在肝癌抗原刺激下，PBLs中TCR Vβ7亚家族基因片段呈选择性优势扩增(见箭头所示)。
@}^-g2], 百拇医药图1 PBLs TCR Vβ基因PCR产物Southern杂交图谱@}^-g2], 百拇医药
Fig1 Southern hybridization map of PBLs TCR Vβ gene PCR product@}^-g2], 百拇医药
A(control)：Southern hybridization map of TCR Vβ gene PCR product costimulated by CD28+CD80@}^-g2], 百拇医药
B(treatment)：Southern hybridization map TCR Vβ gene PCR product costimulated by CD28+CD80， and induced by hepatoma cells
2.2 TCR Vβ基因表达水平检测 图2是CD28+CD80协同刺激健康人PBLs(对照组)及受肝癌细胞BEL-7402诱导(实验组)后，PBLs TCR Vβ基因表达水平检测。光密度扫描结果显示，在肝癌抗原刺激下，Vβ7亚家族基因表达显著升高，表达水平为24.41%。
!1, 百拇医药图2 PBLs TCR Vβ基因亚家族表达水平(%)!1, 百拇医药
Fig2 The expression level of TCR Vβ gene subfamilies of PBLs (%)!1, 百拇医药
Control： The expression level of TCR Vβ gene subfamilies of PBLs costimulated by CD28+CD80!1, 百拇医药
Treatment：The expression level of TCR Vβ gene subfamilies of PBLs costimulated by CD28+CD80 and induced by hepatoma cells!1, 百拇医药
3 讨论!1, 百拇医药
TCR是T淋巴细胞接受抗原刺激产生特异性免疫应答的受体，多数T细胞的TCR由α、β链构成，人体TCR β链V基因有25个片段供挑选组成TCR受体库。在没有抗原刺激时，TCR Vβ基因的表达完全是随机的[9]。目前的研究热点在TCR V区基因对抗原的识别机制和特异性表达上，特别是TCR Vβ基因亚家族的使用频率和选择性扩增。有报道，IL-2作用下人TIL的TCR Vβ5、6、8基因呈优势扩增[1]，SIV感染恒河猴淋巴细胞，Vβ7、14基因呈高表达[10]。本室用HSV-2感染健康人PBLs时TCR Vβ2、6、7、8基因表达频率增高，而生殖器单纯疱疹性皮肤病人发作期、中间静止期和再发作期的PBLs用HSV感染时，TCR Vβ基因的表达却不同。这提示在疾病不同发病阶段外周血T细胞识别抗原时，Vβ基因亚家族呈不同的优势扩增[11]。T细胞被激活时除其表面抗原特异性受体感受抗原多肽的刺激之外，另一些受体也必须感受并传递一个附加刺激的受体即CD28，CD28传递的信息可防止T细胞特异性抗原诱发的耐受，同时可以使激活的T细胞内各种细胞因子mRNA(如IL-2mRNA)的稳定性增加。B7.1可使APC表面B7.1分子表达增多，CD28与B7.1的相互作用产生的共刺激信号加强抗原呈递能力，是T细胞应答产生CTL的诱导相中所必需的，是典型的共刺激途径。本文用CD28+B7.1(CD80)协同刺激健康人PBLs后作用于肝癌细胞，结果显示PBLs TCR Vβ7表达水平明显增高，而其它Vβ亚家族基因的表达水平无明显改变，但有个体差异,说明PBLs TCR在接受抗原刺激过程中，Vβ7特异性识别肿瘤抗原而呈优势扩增，且表达水平稳定，为我们下一步研究工作——肿瘤的基因治疗提供特异性片段。■
基金项目：国家自然科学基金(396400005)和广东省科教兴医“五个一”工程重点课题(粤卫科[1996]20号)资助项目)/6v, 百拇医药
作者简介：杨 红(1965-)，女，广东人，讲师，本科，主要从事分子免疫学方面的研究。)/6v, 百拇医药
参考文献：)/6v, 百拇医药
[1]傅体辉.T细胞识别肿瘤的分子机制[J].国外医学免疫学分册，1995，1：23～26.)/6v, 百拇医药
[2]黄树林，罗利琼，肖兰凤，等.McAb共刺激PBLs介导肝癌细胞凋亡[J].中国免疫学杂志，1998，14(2)：154～156.)/6v, 百拇医药
[3]CHOMCZYNSKIS P， NICOLETTA S. Single-step method of RNA isolation by acid guannidinium thiocganate-phenol-chloroform extraction[J]. Analytical Biochem， 1987，162：156～159.)/6v, 百拇医药
[4]ILONA KARIV， ALEMSEGED TRUNEH， RAYMOND W SWEET. Analysis of the site of interaction of CD28 with its counter-receptors CD80 and CD86 and correlation with founction[J]. J Immunol， 1996，157：29～32.)/6v, 百拇医药
[5]DUNN DA， ANNE SG， SWARNALATHA S， et al. T-cell receptor Vβ expression in normal human skin[J]. Proc Natl Acad Sci(USA)， 1993，90：1267～1270.)/6v, 百拇医药
[6]HIDEYUKI I， NORIYUKI S， AKIHIRO M， et al. Analysis of T-cell receptor Vβ region gene usage of cytotoxic T-lymphocytes and tumor-infiltrating lymphocytes derivid from human autologous gastric sigmer ring cell carcinomas[J]. Cancer Res，1993，53：3078～3081.)/6v, 百拇医药
[7]黄树林，陈耕夫，杨 红，等.不同条件和状态HSV感染人外周血淋巴细胞的Vβ受体表达特点[J].中国免疫学杂志，1996，12(增刊)：137～140.)/6v, 百拇医药
[8]MAMHEIM B. Principle of nucleic acid labeling and detection with the genius system[J]. Genius System User S Guide， 1994，22，44～46，66～68.)/6v, 百拇医药
[9]JEFFERY MC， MICHAEL JL. Antigen induced programmed T cell death as a new approach to immune therapy：Clinic immunology and immunopathalogy， 1995，75：13～16.)/6v, 百拇医药
[10]ZHANG WC， KOU ZC， LING S. An acutely lethal simian immunodeficiency virus stimulates expansion of Vβ7-14 expressing T lymphocytes[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1994，9：7501～7505.)/6v, 百拇医药
[11]黄树林，明文玉，罗利琼，等.HSV-2感染人外周血淋巴细胞后TCR Vβ基因片段的选择性扩增[J].上海免疫学杂志，1997，2：98～101.)/6v, 百拇医药
收稿日期：1998-06-09)/6v, 百拇医药
修回日期：1999-10-03(杨红 李菁华 黄树林)