CTLA4Ig基因转染对大鼠胰岛移植的影响
作者：金世龙 顾红光 王亚旭 刘宝华 文亚渊 王仁云 王东 何培生
单位：金世龙(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通外科，重庆 400042)；顾红光(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通外科，重庆 400042)；王亚旭(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通外科，重庆 400042)；刘宝华(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通外科，重庆 400042)；文亚渊(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通外科，重庆 400042)
关键词：胰岛移植；基因治疗；糖尿病
第三军医大学学报000509
提 要： 目的 研究CTLA4Ig基因在糖尿病大鼠体内表达及其产物延长胰岛移植物存活的作用。方法 利用Lipofectin载体包裹CTLA4Ig cDNA质粒后转染鼠胰岛和肌肉细胞，检测移植后CTLA4Ig基因表达水平，观察CTLA4Ig基因表达在延长糖尿病鼠胰岛移植物和大鼠存活时间的作用。结果 A组胰岛移植第7天2只大鼠血清CTLA4Ig呈阳性(阳性率20%)，分别为14 ng/ml和31 ng/ml。B组胰岛移植后维持血糖正常时间平均(3.6±5.1)d，A组胰岛移植后维持血糖正常平均(14.8±12.3)d，两组比较差异显著(P<0.05)。A组大鼠平均存活(24.0±10.8)d，最长45 d，B组大鼠平均存活(10.8±4.8)d，最长21 d，两组大鼠生存时间差异非常显著(P<0.01)。结论 CTLA4Ig基因可以在受体大鼠胰岛细胞或肌肉组织表达，其表达产物可使胰岛移植物和受体鼠存活时间明显延长。
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中图法分类号: R394.2;R617 文献标识码： A
文章编号：1000-5404(2000)05-0433-03
Role of CTLA4Ig gene in transplantation of pancreatic islets in rats
JING Shi-long，GU Hong-guang, WANG Ya-xu， LIU Bao-hua, WEN Ya-yuan, WANG Ren-jun, WANG Dong, HE Pei-sheng
(Department of General Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042,China)
, 百拇医药
Abstract： Objective To study the expression of CTLA4Ig gene and the effect of its product on the prolongation of the survival of pancreatic islet allograft in diabetic rats. Methods The cells of the islets and muscles of the pancreas were transfected with CTLA4Ig cDNA which was packaged with libofeclin vector. The expression of CTLA4Ig gene was observed after the transplantation of pancreatic islets to see the effect on the prolongation of the survival of the allografts and of the diabetic rats. Results The expression of CTLA4Ig in serum was positive in 2 out of 10 rats in group A with concentrations of 14 ng/ml and 31ng/ml respectively 7 days after the transplantation. The average duration of normal blood glycose level after the transplantation was 14.8±12.3 days in group A and 3.6±5.1 days in group B(P<0.05). The average survival time of the transplanted rats was 24.0±10.8 days (maximum of 45 days) in group A and 10.8±4.8 days(maximum of 21 days) in group B (P<0.01). Conclusion CTLA4Ig gene was expressed in the cells of islets and muscles of the pancreas in the recipient rats and prolonged the survival of the pancreatic islet allograft as well as the recipient rats significantly.
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Key words： pancreatic islets transplantation; gene therapy; diabetes mellitus
胰岛移植是治疗糖尿病的理想方法，有效的胰岛移植可代替长期胰岛素的使用。胰岛移植存在的最主要问题是免疫排斥反应，因此降低移植物的免疫原性和诱导受体对移植物耐受是解决排斥反应的方法。CTLA4Ig是阻断B7-CD28共刺激信号传导最有效的制剂，是免疫学和移植学研究最活跃的领域，国外在这方面研究较多，取得了良好效果，国内尚未见报告[1]。本研究利用Lipofectin载体包裹CTLA4Ig cDNA质粒后转染鼠胰岛和肌肉细胞，观察CTLA4Ig基因表达及其在延长糖尿病大鼠移植胰岛存活的作用。
1 材料与方法
1.1 动物和主要试剂
大白鼠体重150～200 g，雌雄不拘，我院实验动物中心提供。细胞培养基PRMI 1640、DMEM和Lipofectin载体为Gibco产品，ELISA试剂盒为Ancell Corporation产品。胶原酶Ⅰ型、链脲酶素为Sigma产品。CTLA4Ig cDNA由Linsley提供。
, 百拇医药
1.2 大鼠糖尿病模型制备和质粒肌肉注射
大鼠20只称重，随机分为实验组(A组)和对照组(B组)各10只。用Lipofectin载体将CTLA4Ig cDNA包裹(超声法混匀)后按Lipofectin(200 μl)与CTLA4Ig cDNA(200 ug)的混匀液入A组大鼠右侧大腿肌肉组织。CTLA4Ig cDNA注射5d后再给两组大鼠肌注(左腿)1%链脲素(75mg/kg)，24 h后大鼠血糖达到20 mmol/L，血糖浓度5d测定1次。维持10 d为稳定地糖尿病模型。
1.3 胰岛消化分离、纯化和转染
1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔内注射麻醉后，立即切开腹腔显露胰腺和胆总管，胆总管中段向远侧插入41/2针头，结扎十二指肠远近端形成闭绊。将0.5%胶原酶和7.5 mmol/L Ca2+的Hanks液6～8 ml，自胆总管注入十二指肠绊，胰腺膨胀后，迅速摘取胰腺，置入50 ml三角烧瓶加上述Hanks液8 ml，38°C水浴轻轻摇动8～12 min取出用眼科小剪刀将胰腺剪成0.5～1 mm3碎块，再置50 ml三角烧瓶中，加上述Hanks液6 ml，38°C水浴振摇消化5～8 min，加入4°C Hanks液6 ml终止消化。静置3～5 min待组织块沉淀后，吸取上清消化物经1 000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀物用20%小牛血清的1640培养液保存。沉淀物重复上述消化过程4～5次，直到胰腺全部消化[3]。
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消化后的胰岛用20%小牛血清的完全RPMI1640培养液10 ml(pH7.2)，置细胞培养箱，95%空气、5%CO2、37°C恒温培养48 h。吸出悬浮细胞团用Hanks液清洗后，加入密度梯度为25%、20%、15%和10%的Ficoll液经4°C 3 000 r/min离心15 min，胰岛细胞在第2层(20%～25%)、第3层(15%～20%)及第4层(10%～15%)收集，用Hanks液清洗2次待用。将CTLA4Ig cDNA 50 μg和Lipofectin 100 μl经超声混悬液与A组供体纯化的胰岛混匀后，加DMEM培养液4 ml，95%空气、5%CO2、37°C培养6 h，再加入10%小牛血清继续培养18 h[2]。取胰岛悬液检测：①胰岛纯度；②胰岛活度；③上清液胰岛素；④葡萄糖刺激胰岛素释放试验。
1.4 胰岛移植和血清CTLA4Ig检测
糖尿病大鼠麻醉后，左中腹切口，将胰岛细胞悬液1ml注入左肾包囊。按单纯胰岛移植组(B组)和胰岛+CTLA4Ig cDNA组(A组)移植。移植后每隔3～5d取鼠尾血检测血糖(微量血糖仪)变化，血糖连续2次高于11.0 mmol/L，以第一时间为排斥开始，观察糖尿病鼠存活时间。A组移植后7d取静脉血，ELISA法检测血清CTLA4Ig水平[4]。
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1.5 统计学处理
实验数据用
±s表示，两组均数差异用t检验和方差分析。
2 结果
2.1 基因转染对胰岛功能影响
大鼠胰腺组织碎块经胶原酶消化和纯化后镜下观察胰岛纯度达到81%～95%，细胞活度79%～89%。B组和A组转染后100个胰岛经24 h普通、低糖和高糖+茶碱刺激培养释放胰岛素量差异显著(P>0.05)。两组高糖+茶碱刺激后胰岛素释放量为低糖的2倍多(P<0.01)，纯化胰岛β细胞功能良好，揭示基因转染过程不影响胰岛细胞分泌胰岛素功能，见表1。
表1 两组24 h胰岛素释放量(m/ng)
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Tab 1 Insulin secreation of two groups in 24 hours(m/ng) Group
General
Low glucose
(5.6 mmol/L)
High glucose+the
ophylline
(24.5 mmol/L)
A(100 cells)
125±21
381±123*
, 百拇医药
841±197*
B(100 cells)
134±19#
412±135* #
914±159*#
*：P<0.01 vs general；#：P>0.05 vs A
2.2 糖尿病大鼠胰岛移植后血糖变化，见表2
B组大鼠胰岛移植后3 d检测血糖，5只大鼠血糖正常，维持血糖正常时间平均(3.6±5.1)d，A组大鼠胰岛移植3 d后检测血糖，8只大鼠血糖正常，维持血糖正常平均(14.8±12.3)d，两组比较差异显著(P<0.05)。
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表2 两组糖尿病大鼠胰岛移植后维持血糖正常时间
Tab 2 Time of maintaining blood glycose level of two
groups after pancreatic islets graft Group
Time of maintaining blood glycose level (t/d)
A
34，29，26，19，17，13，7，3，0，0
B
16，10，4，3，3，0，0，0，0，0
2.3 移植后两组大鼠生存时间与CTLA4Ig表达
, 百拇医药
A组大鼠平均存活(24.0±10.8)d，最长45 d，B组大鼠平均存活(10.8±4.8)d，最长21 d，两组大鼠生存时间差异有统计学意义(P<0.01)。A组胰岛移植第7天2只大鼠血清CTLA4Ig呈阳性，分别为14 ng/ml和31 ng/ml，其维持血糖正常时间19、29 d和存活25、31 d，长于其平均值，见表3。
表3 两组糖尿病大鼠胰岛移植后存活时间
Tab 3 Survival time of two groups after pancreatic islets graft Group
Time of survival (t/d)
A
45，36，31，29，25，19，17，15，12，9
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B
21，17，12，12，11，9，8，8，6，4
3 讨论
胰岛移植不仅能逆转糖尿病高血糖状态，而且能防止糖尿病慢性并发症的发生和发展，是治疗Ⅰ型糖尿病的有效方法。全世界已开展临床胰岛移植数千例，但长期完全停用胰岛素维持血糖正常水平的例数极少，临床效果不够理想的主要障碍是免疫排斥反应。CTLA4Ig与CD28配体B7有高度亲和力，可以阻断CD28和CTLA4与其配体B7之间结合，从而阻断CD28共刺激信号传递，使T细胞增殖和分化成细胞毒T细胞和淋巴因子的作用受抑制，诱导对特异抗原无反应状态，体内体外均有免疫抑制作用，不需要其它免疫抑制剂就可以延长移植物存活时间[1]。CTLA4Ig在治疗心肾移植免疫排斥反应中发挥重要作用，能够使移植物和受体长期存活[5]。Deborah给异种胰岛移植鼠注射CTLA4Ig使受体鼠长期存活，也获得良好效果[6]。Gainer用金颗粒将CTLA4Ig cDNA带入分离纯化的胰岛细胞，使胰岛转染表达CTLA4Ig，实验组12只鼠有6只移植物存活超过50 d，移植的胰岛最长存活164 d[7]。Chahine利用CTLA4Ig基因转染鼠肌肉细胞，转染的肌细胞与鼠胰岛联合移植到鼠肾包囊，移植12只糖尿病鼠有8只存活时间超过90 d，其治疗效果良好[8]。国外在这方面研究较多，取得了良好效果，我们刚刚起步，尚未见报告。我们用Lipofcetin包裹CTLA4Ig cDNA后直接肌肉注射以转染肌细胞和DMEM液培养纯化的胰岛以转染胰岛细胞，此法转染不同组织细胞提高细胞CTLA4Ig基因表达。从转染对胰岛细胞功能看，在普通、低糖和高糖+茶碱培养3种条件下A组释放胰岛素较B略低，但两组差异无统计学意义(P>0.05)，提示胰岛细胞的转染过程不会影响胰岛功能。A组大鼠胰岛移植后维持正常血糖的时间(P<0.05)和大鼠存活时间(P<0.01)均较B组明显延长，可能是CTLA4Ig cDNA转染受体鼠后CTLA4Ig基因得到不同程度表达，受体细胞免疫抑制有关系。本组胰岛转染移植10只大鼠在第7天只有2只鼠血清检测CTLA4Ig阳性，显示CTLA4Ig cDNA能够在糖尿病大鼠肌细胞或供体胰岛细胞内低水平表达。结果提示：CTLA4Ig基因可以在受体大鼠胰岛细胞或肌肉组织表达，其表达产物可使胰岛移植物和受体鼠存活时间明显延长。
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基金项目：全军“九五”医药卫生科研基金(青年基金)资助项目(96Q075)
作者简介：金世龙(1963-)，男，湖北省丹江口市人，硕士，主治医师，讲师，发表论文14篇。电话：(023)68757247
作者单位：王仁云(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通外科，重庆 400042)；王东(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通外科，重庆 400042)；何培生(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通外科，重庆 400042)
参考文献：
[1] Lin H, Hua Lim, Steven F B, et al. Long-term acceplance of major histocompalibility complex mismatched cardiac allografts induced by CTLA4Ig plus donor speacific tranfusion[J]. J Exp Med,1993,178(5):1 801-1 805.
, 百拇医药
[2] Gainer A L, Korbutt G S, Rajotte R V, et al. Successful biolistic transformation of mouse pancreatic islets while preserving cellular function[J]. Transplantation,1996,61(11):1 567-1 571.
[3] 沈守祥，董见虎，毕艳军，等.SD大鼠胰岛细胞培养技术的研究[J].中华器官移植杂志，1995，16(4)：158-160.
[4] Levisetti M G, Padrid P A, Szot G L, et al. Immunosuppressive effects of human CTAL4Ig in a non-human primate model of allogeneic pancreatic islet transplantation[J]. J Immunol,1997,159(10):5 187-5 191.
, 百拇医药
[5] Judge T A, Tang A, Spain L M, et al. The in vivo mechanism of action of CTLA4Ig[J]. J Immunol,1996,156(6):2 294-2 299.
[6] Deborah J, Lenschow, Zeng Yijun, et al. Long-term survial of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4Ig[J]. Science,1992,257(7):709-791.
[7] Gainer A L, Korbutt G S, Rajotte R V, et al. Expression of CTLA4Ig by Biolistically transfected mouse islets promotes islet allograft survival[J]. Transplantation,1997,63(7):1 017-1 021.
[8] Chahine A A, Yu M, McKernan M M, et al. Immunomodulation of pancreatic islet allografts in mice with CTLA4Ig secreting muscle cells[J]. Transplantation,1995,59(9):1 313-1 318.
收稿日期：1999-07-02；修回日期：1999-12-09, 百拇医药
单位：金世龙(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通外科，重庆 400042)；顾红光(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通外科，重庆 400042)；王亚旭(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通外科，重庆 400042)；刘宝华(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通外科，重庆 400042)；文亚渊(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通外科，重庆 400042)
关键词：胰岛移植；基因治疗；糖尿病
第三军医大学学报000509
提 要： 目的 研究CTLA4Ig基因在糖尿病大鼠体内表达及其产物延长胰岛移植物存活的作用。方法 利用Lipofectin载体包裹CTLA4Ig cDNA质粒后转染鼠胰岛和肌肉细胞，检测移植后CTLA4Ig基因表达水平，观察CTLA4Ig基因表达在延长糖尿病鼠胰岛移植物和大鼠存活时间的作用。结果 A组胰岛移植第7天2只大鼠血清CTLA4Ig呈阳性(阳性率20%)，分别为14 ng/ml和31 ng/ml。B组胰岛移植后维持血糖正常时间平均(3.6±5.1)d，A组胰岛移植后维持血糖正常平均(14.8±12.3)d，两组比较差异显著(P<0.05)。A组大鼠平均存活(24.0±10.8)d，最长45 d，B组大鼠平均存活(10.8±4.8)d，最长21 d，两组大鼠生存时间差异非常显著(P<0.01)。结论 CTLA4Ig基因可以在受体大鼠胰岛细胞或肌肉组织表达，其表达产物可使胰岛移植物和受体鼠存活时间明显延长。
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中图法分类号: R394.2;R617 文献标识码： A
文章编号：1000-5404(2000)05-0433-03
Role of CTLA4Ig gene in transplantation of pancreatic islets in rats
JING Shi-long，GU Hong-guang, WANG Ya-xu， LIU Bao-hua, WEN Ya-yuan, WANG Ren-jun, WANG Dong, HE Pei-sheng
(Department of General Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042,China)
, 百拇医药
Abstract： Objective To study the expression of CTLA4Ig gene and the effect of its product on the prolongation of the survival of pancreatic islet allograft in diabetic rats. Methods The cells of the islets and muscles of the pancreas were transfected with CTLA4Ig cDNA which was packaged with libofeclin vector. The expression of CTLA4Ig gene was observed after the transplantation of pancreatic islets to see the effect on the prolongation of the survival of the allografts and of the diabetic rats. Results The expression of CTLA4Ig in serum was positive in 2 out of 10 rats in group A with concentrations of 14 ng/ml and 31ng/ml respectively 7 days after the transplantation. The average duration of normal blood glycose level after the transplantation was 14.8±12.3 days in group A and 3.6±5.1 days in group B(P<0.05). The average survival time of the transplanted rats was 24.0±10.8 days (maximum of 45 days) in group A and 10.8±4.8 days(maximum of 21 days) in group B (P<0.01). Conclusion CTLA4Ig gene was expressed in the cells of islets and muscles of the pancreas in the recipient rats and prolonged the survival of the pancreatic islet allograft as well as the recipient rats significantly.
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Key words： pancreatic islets transplantation; gene therapy; diabetes mellitus
胰岛移植是治疗糖尿病的理想方法，有效的胰岛移植可代替长期胰岛素的使用。胰岛移植存在的最主要问题是免疫排斥反应，因此降低移植物的免疫原性和诱导受体对移植物耐受是解决排斥反应的方法。CTLA4Ig是阻断B7-CD28共刺激信号传导最有效的制剂，是免疫学和移植学研究最活跃的领域，国外在这方面研究较多，取得了良好效果，国内尚未见报告[1]。本研究利用Lipofectin载体包裹CTLA4Ig cDNA质粒后转染鼠胰岛和肌肉细胞，观察CTLA4Ig基因表达及其在延长糖尿病大鼠移植胰岛存活的作用。
1 材料与方法
1.1 动物和主要试剂
大白鼠体重150～200 g，雌雄不拘，我院实验动物中心提供。细胞培养基PRMI 1640、DMEM和Lipofectin载体为Gibco产品，ELISA试剂盒为Ancell Corporation产品。胶原酶Ⅰ型、链脲酶素为Sigma产品。CTLA4Ig cDNA由Linsley提供。
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1.2 大鼠糖尿病模型制备和质粒肌肉注射
大鼠20只称重，随机分为实验组(A组)和对照组(B组)各10只。用Lipofectin载体将CTLA4Ig cDNA包裹(超声法混匀)后按Lipofectin(200 μl)与CTLA4Ig cDNA(200 ug)的混匀液入A组大鼠右侧大腿肌肉组织。CTLA4Ig cDNA注射5d后再给两组大鼠肌注(左腿)1%链脲素(75mg/kg)，24 h后大鼠血糖达到20 mmol/L，血糖浓度5d测定1次。维持10 d为稳定地糖尿病模型。
1.3 胰岛消化分离、纯化和转染
1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔内注射麻醉后，立即切开腹腔显露胰腺和胆总管，胆总管中段向远侧插入41/2针头，结扎十二指肠远近端形成闭绊。将0.5%胶原酶和7.5 mmol/L Ca2+的Hanks液6～8 ml，自胆总管注入十二指肠绊，胰腺膨胀后，迅速摘取胰腺，置入50 ml三角烧瓶加上述Hanks液8 ml，38°C水浴轻轻摇动8～12 min取出用眼科小剪刀将胰腺剪成0.5～1 mm3碎块，再置50 ml三角烧瓶中，加上述Hanks液6 ml，38°C水浴振摇消化5～8 min，加入4°C Hanks液6 ml终止消化。静置3～5 min待组织块沉淀后，吸取上清消化物经1 000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀物用20%小牛血清的1640培养液保存。沉淀物重复上述消化过程4～5次，直到胰腺全部消化[3]。
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消化后的胰岛用20%小牛血清的完全RPMI1640培养液10 ml(pH7.2)，置细胞培养箱，95%空气、5%CO2、37°C恒温培养48 h。吸出悬浮细胞团用Hanks液清洗后，加入密度梯度为25%、20%、15%和10%的Ficoll液经4°C 3 000 r/min离心15 min，胰岛细胞在第2层(20%～25%)、第3层(15%～20%)及第4层(10%～15%)收集，用Hanks液清洗2次待用。将CTLA4Ig cDNA 50 μg和Lipofectin 100 μl经超声混悬液与A组供体纯化的胰岛混匀后，加DMEM培养液4 ml，95%空气、5%CO2、37°C培养6 h，再加入10%小牛血清继续培养18 h[2]。取胰岛悬液检测：①胰岛纯度；②胰岛活度；③上清液胰岛素；④葡萄糖刺激胰岛素释放试验。
1.4 胰岛移植和血清CTLA4Ig检测
糖尿病大鼠麻醉后，左中腹切口，将胰岛细胞悬液1ml注入左肾包囊。按单纯胰岛移植组(B组)和胰岛+CTLA4Ig cDNA组(A组)移植。移植后每隔3～5d取鼠尾血检测血糖(微量血糖仪)变化，血糖连续2次高于11.0 mmol/L，以第一时间为排斥开始，观察糖尿病鼠存活时间。A组移植后7d取静脉血，ELISA法检测血清CTLA4Ig水平[4]。
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1.5 统计学处理
实验数据用
±s表示，两组均数差异用t检验和方差分析。2 结果
2.1 基因转染对胰岛功能影响
大鼠胰腺组织碎块经胶原酶消化和纯化后镜下观察胰岛纯度达到81%～95%，细胞活度79%～89%。B组和A组转染后100个胰岛经24 h普通、低糖和高糖+茶碱刺激培养释放胰岛素量差异显著(P>0.05)。两组高糖+茶碱刺激后胰岛素释放量为低糖的2倍多(P<0.01)，纯化胰岛β细胞功能良好，揭示基因转染过程不影响胰岛细胞分泌胰岛素功能，见表1。
表1 两组24 h胰岛素释放量(m/ng)
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Tab 1 Insulin secreation of two groups in 24 hours(m/ng) Group
General
Low glucose
(5.6 mmol/L)
High glucose+the
ophylline
(24.5 mmol/L)
A(100 cells)
125±21
381±123*
, 百拇医药
841±197*
B(100 cells)
134±19#
412±135* #
914±159*#
*：P<0.01 vs general；#：P>0.05 vs A
2.2 糖尿病大鼠胰岛移植后血糖变化，见表2
B组大鼠胰岛移植后3 d检测血糖，5只大鼠血糖正常，维持血糖正常时间平均(3.6±5.1)d，A组大鼠胰岛移植3 d后检测血糖，8只大鼠血糖正常，维持血糖正常平均(14.8±12.3)d，两组比较差异显著(P<0.05)。
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表2 两组糖尿病大鼠胰岛移植后维持血糖正常时间
Tab 2 Time of maintaining blood glycose level of two
groups after pancreatic islets graft Group
Time of maintaining blood glycose level (t/d)
A
34，29，26，19，17，13，7，3，0，0
B
16，10，4，3，3，0，0，0，0，0
2.3 移植后两组大鼠生存时间与CTLA4Ig表达
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A组大鼠平均存活(24.0±10.8)d，最长45 d，B组大鼠平均存活(10.8±4.8)d，最长21 d，两组大鼠生存时间差异有统计学意义(P<0.01)。A组胰岛移植第7天2只大鼠血清CTLA4Ig呈阳性，分别为14 ng/ml和31 ng/ml，其维持血糖正常时间19、29 d和存活25、31 d，长于其平均值，见表3。
表3 两组糖尿病大鼠胰岛移植后存活时间
Tab 3 Survival time of two groups after pancreatic islets graft Group
Time of survival (t/d)
A
45，36，31，29，25，19，17，15，12，9
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B
21，17，12，12，11，9，8，8，6，4
3 讨论
胰岛移植不仅能逆转糖尿病高血糖状态，而且能防止糖尿病慢性并发症的发生和发展，是治疗Ⅰ型糖尿病的有效方法。全世界已开展临床胰岛移植数千例，但长期完全停用胰岛素维持血糖正常水平的例数极少，临床效果不够理想的主要障碍是免疫排斥反应。CTLA4Ig与CD28配体B7有高度亲和力，可以阻断CD28和CTLA4与其配体B7之间结合，从而阻断CD28共刺激信号传递，使T细胞增殖和分化成细胞毒T细胞和淋巴因子的作用受抑制，诱导对特异抗原无反应状态，体内体外均有免疫抑制作用，不需要其它免疫抑制剂就可以延长移植物存活时间[1]。CTLA4Ig在治疗心肾移植免疫排斥反应中发挥重要作用，能够使移植物和受体长期存活[5]。Deborah给异种胰岛移植鼠注射CTLA4Ig使受体鼠长期存活，也获得良好效果[6]。Gainer用金颗粒将CTLA4Ig cDNA带入分离纯化的胰岛细胞，使胰岛转染表达CTLA4Ig，实验组12只鼠有6只移植物存活超过50 d，移植的胰岛最长存活164 d[7]。Chahine利用CTLA4Ig基因转染鼠肌肉细胞，转染的肌细胞与鼠胰岛联合移植到鼠肾包囊，移植12只糖尿病鼠有8只存活时间超过90 d，其治疗效果良好[8]。国外在这方面研究较多，取得了良好效果，我们刚刚起步，尚未见报告。我们用Lipofcetin包裹CTLA4Ig cDNA后直接肌肉注射以转染肌细胞和DMEM液培养纯化的胰岛以转染胰岛细胞，此法转染不同组织细胞提高细胞CTLA4Ig基因表达。从转染对胰岛细胞功能看，在普通、低糖和高糖+茶碱培养3种条件下A组释放胰岛素较B略低，但两组差异无统计学意义(P>0.05)，提示胰岛细胞的转染过程不会影响胰岛功能。A组大鼠胰岛移植后维持正常血糖的时间(P<0.05)和大鼠存活时间(P<0.01)均较B组明显延长，可能是CTLA4Ig cDNA转染受体鼠后CTLA4Ig基因得到不同程度表达，受体细胞免疫抑制有关系。本组胰岛转染移植10只大鼠在第7天只有2只鼠血清检测CTLA4Ig阳性，显示CTLA4Ig cDNA能够在糖尿病大鼠肌细胞或供体胰岛细胞内低水平表达。结果提示：CTLA4Ig基因可以在受体大鼠胰岛细胞或肌肉组织表达，其表达产物可使胰岛移植物和受体鼠存活时间明显延长。
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基金项目：全军“九五”医药卫生科研基金(青年基金)资助项目(96Q075)
作者简介：金世龙(1963-)，男，湖北省丹江口市人，硕士，主治医师，讲师，发表论文14篇。电话：(023)68757247
作者单位：王仁云(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通外科，重庆 400042)；王东(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通外科，重庆 400042)；何培生(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通外科，重庆 400042)
参考文献：
[1] Lin H, Hua Lim, Steven F B, et al. Long-term acceplance of major histocompalibility complex mismatched cardiac allografts induced by CTLA4Ig plus donor speacific tranfusion[J]. J Exp Med,1993,178(5):1 801-1 805.
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收稿日期：1999-07-02；修回日期：1999-12-09, 百拇医药