家蚕核型多角体病毒中国株和日本株vp39基因的比较研究
作者：齐义鹏 刘德立 孙晓洁
单位：武汉大学病毒研究所，武汉 430072
关键词：核衣壳蛋白基因；克隆；家蚕核型多角体病毒；点突变；二级结构
中国病毒学000109
摘 要：以苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)的核衣壳蛋白基因vp39设计引物，用PCR技术扩增了家蚕核型多角体病毒中国株(BmNPV-Ch)～1.3kb片段，并测定了其全序列长1230bp。推导的氨基酸351个，其与BmNPV日本株(BmNPV-Ja)vp39基因核苷酸序列同源性达97.5%，氨基酸同源性达97.1%。该片段在E.coli BL21中诱导表达能产生分子量约为38kD 的特征性蛋白带，证明所扩增片段为BmNPV-Ch的vp39基因。经与BmNPV-Ja比较，其625位 有3个核苷酸(CGA)，985～910位有6个核苷酸(GTCGGC)的插入，未造成码组移动。有17处点突变，但取代突变(replacement mutation)仅7处，对两株病毒VP39蛋白的亲疏水性和酸碱 性质未产生显著影响。由于点突变带来氨基酸改变，使BmNPV-Ch的vp39蛋白的α-螺旋由13.2%增加到15.4%，无规卷曲由7.2%减少到5.8%，β-折叠和β-转角维持不变，约为79.6%，仍保持以β-折叠为主要二级结构单元的片层状折叠结构。
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分类号：Q753 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)01-0052-07
Comparison Study about the vp39 Gene of Bombyx mori Nuclear
Polyhedrosis Virus Two Isolates from China and Japan
QI Yi-peng, LIU De-li, SUN Xiao-jie
(Institute of Virology, Wuhan University, Wuhan 430072, China)
Abstract：The nuclear capsid protein gene (vp39) of Bombyx morin uclear polyhedrosis virus (Chinese isolate, BmNPV-Ch) was amplified by PCR and inserted into pGEM 3zf(+). The amplified vp39 gene (1230 bp) was sequenced with silver-staining dideoxy chain termination. The coding region is 1053 bp,and code for 351 amino acids. Comparing with the vp39 gene of BmNPV-Ja (Japanese is olate), the homology of the nucleotide and the amino acid sequences is 97.5% and 97.1% respectively.The BmNPV vp39 gene was inserted into the expression vector pRS ET-A, and transformed into E.coli BL21. This gene from BmNPV-Ch is 9bp longer than that of BmNPV-Ja. The insertion of nine nucleotides is found in vp39 gene sequence of BmNPV-Ch (CGA at 625 site and GTCGGC at 985-910). Although there are 17 site-mutations, only 7 site-mutations are replacement mutations. There was no effect to the hydrophilicity and charge of two isolates of VP39. Thereplacement of anino acids caused by the site mutations made the changes of the secondary structure of Bmvp39-Ch.e.g.α-helix increased from 13.2% to 15.4%; rundom coil decreased from 7.2% to 5.8%. β-sheet and β-turn of two isolates were similiar (about 79.6%). It is indicated that the main secondary structure of the VP39 protein is fold sturcture containing high proportion of β-sheet and β-turn. This structure may be concordant with its function.
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Key words：Nuclear capsid gene (vp39); Gene cloning, BmNPV; Site mutation; Secondary structure▲
杆状病毒的分子生物学是近来十分活跃的研究领域之一，其模型种苜蓿丫纹夜蛾核型多角体 病毒(Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus, AcNPV)的研究已取得了 重大进展。1994年，Ayers等人[1]公布了AcNPV DNA 134kb全序列。已鉴定的重 要基因有50多个，包括核衣壳蛋白vp39基因。Blissard等[2]研究了黄杉毒蛾核 型多角体病毒(Orgyia pseudotsugata NPV, OpNPV)vp39基因的结构及瞬时表达。最近 的研究发现：AcNPV的vp39基因与侵染密切相关。在侵染过程中，VP39蛋白与宿主的肌动蛋 白结合，使其重排形成缆索(cable)，导致细胞骨架发生变化有利于病毒编码的蛋白酶的水 解，最后，子代病毒颗粒大量形成，宿主昆虫体全部液化成为脓水[3，4]。可见 ，vp39基因是杆状病毒的一个十分重要的基因。由于家蚕(Bombyx mori)表达系统的独 特优点，因此，家蚕NPV(BmNPV)亦是研究得比较深入的一种杆状病毒。Maeda等[5] 测定BmNPV日本株(BmNPV-Ja)的基因组全序列。我国学者[6]也有不少关于BmNP V分子生物学的报道。他们使用的毒株多为从日本引进，也有从我国罹病的家蚕幼虫中分 离。这两种地理分离物是同一毒株，还是有所差别，未引起任何重视。本研究克隆表达了Bm NPV中国分离物(BmNPV-Ch)的vp39基因，并测定了其全序列。经与BmNPV-Ja比较，发现它 们的序列和结构有某些差异，但其基本性质不变。本研究结果不仅对vp39基因的研究有重要 理论意义，也为我国病毒资源的开发利用提出了新的命题。
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1 材料与方法
1.1 试剂，质粒及菌株
限制性内切酶，T4 DNA连接酶，Taq DNA聚合酶，SIVER-SEQUENCETM等购自Promega 公司和华美生物技术公司。BmNPV中国分离物由南京军区军事医学研究所邓小昭博士赠送。 质粒pGEM3zf，表达质粒pRSET-A，大肠杆菌TG1和BL21等由本室保存。
1.2 病毒DNA的提取
用BmNPV-Ch感染家蚕细胞。当50%左右的细胞中形成多角体后，2000r/min离心除去细胞 ，40000g离心40min收集病毒粒子。加入蛋白酶K(终浓度100μg/mL)和1%SDS裂解病 毒粒子，释放DNA。按常规方法以酚、氯仿抽提，乙醇沉淀DNA。
1.3 重组质粒的构建和筛选
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参照AcNPV vp39基因序列设计PCR引物，正向引物P1：GCCGGATCCAACAATATGGCGCTAGT；反向 引物P2：CCGGAGCTCGTTTTCTAATCTTGCGT。以BmNPV-Ch DNA为模板扩增回收PCR产物，并克隆 到pGEM3zf中，转化大肠杆菌TG1，加入X-gal/IPTG诱导，经兰白斑筛选，得到阳性重组质粒pGEM-39，经BamHI/EcoRI酶切重组质粒pGEM-39 DNA，回收小片段，将其插入到原核表达载体pRSET-A中，构建重组表达质粒pRSET-39。质粒DNA的制备、酶切、连接和转化按文献[7]进行。
1.4 BmNPV 1.3kb PCR片段的序列测定
大量制备重组质粒pGEM-39，并经PEG8000纯化后，用ddNPV/PCR/银染测序法。参照文献[8 ] 和试剂盒说明书测定3′、5′两侧末端序列，全序列测定由加拿大GendaTech Co.完成。
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1.5 vp39基因的同源性比较及推导的囊膜蛋白的二级结构分析
采用DNASIS软件和PROSIS软件分析BmNPV-Ch与日本株BmNPV-Ja vp39基因的序列和氨基酸 同源性。分析两株病毒VP39蛋白的亲疏水性、酸碱性和二级结构并进行详细比较研究。
2 结果
2.1 BmNPV-Ch 1.3kb片段的克隆及序列测定
根据我们[9]以前的报道，将BmNPV-Ch～1.3kb的PCR扩增片段定向克隆到pGEM3 Zf的BamHI/SacI位点，阳性重组质粒命名为pGEM-39，用于序列测定。同时用BamHI/EcoRI 回 收PCR片段，亚克隆到表达质粒pRSET-A的同一位点，构建表达载体pRSET-39(图1)。用双 脱 氧末端终止法测定了pGEM-39中PCR片段的序列，发现一长1053bp的ORF(该序列已储存 美国GenBank，编号：AF063104)。
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图1 重组表达载体 pRSET-39的构建
Fig.1 Construction of recombinant expression plasmid pRSET-39
2.2 BmNPV-Ch～1.3kb片段的序列及其同BmNPV-Ja vp39基因 的比较
图2是BmNPV-Ch vp39与BmNPV-Ja vp39基因序列[6]的比较，它们的核苷酸同源 性达97.5%。证明此ORF应为BmNPV-Ch的vp39基因，它比BmNPV-Ja vp39基因序列长9bp， 其中第625～627位增加了CGA，985～990位增加了GTCGGC。表明BmNPV-Ch vp39基因有两处 插入突变，插入碱基分别是1×3和2×3。因此，并未造成码组移动(图2)。此外，BmNPV-Ch vp39基因中还有17处点突变(图2，表1)。从表1看出，BmNPV-Ch的vp39基因17处点突变的 主要类型是转换(10处)，有意突变7个，大部分是沉默突变。
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表1 BmNPV-Ch vp39基因的点突变及其对蛋白质性质和 结构的影响
Table 1 The site mutations of BmNPV-Ch vp39 and their effect on the structure of VP39 protein 序号
No.
核苷酸
Nucleotide
突变
类型
Mutation
序号
No.
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氨 基酸
Amino acid
亲水
区
HYPL
疏水
区
HYPB
二级结构
2nd struct ure
日本株
BmV -J
中国株
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B mV-C
日本株
BmV-J
中国株
BmV-C
日本株
BmV-J
中国株
BmV-C
10
ATG
GTG
转换 TS
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4
Met
Val
T
S
34
AAA
CAA
颠换 TV
12
Lys
Gln
C
T
, 百拇医药
61
GCG
TCG
颠换 TV
21
Lys
Ser
102
TCG
TCA
转换 TS
沉默突变
SM
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132
GAC
GAT
转换 TS
沉默突变
SM
162
ATC
ATA
颠换 TV
沉默突变
SM
264
, 百拇医药
AGA
AGG
转换 TS
沉默突变
SM
295
ACC
GCC
转换 TS
99
Thr
Ala
S
, 百拇医药
H
345
CAA
CAG
转换 TS
沉默突变
SM
434
AAG
ACG
颠换 TV
145
Lys
, 百拇医药
Thr
-1
-1
477
ATT
ATC
转换 TS
沉默突变
SM
513
CGT
CGG
颠换 TV
, 百拇医药
沉默突变
SM
540
TTC
TTT
转换 TS
沉默突变
SM
562
CGT
GGT
颠换 TV
188
, 百拇医药
Arg
Gly
628
CGC
插入IS
Arg
-1
+2
S
H
711
ATG
ACG
, 百拇医药 转换 TS
858
AGG
AGC
颠换 TV
286
Arg
Ser
S
H
984
GGT
GGC
, 百拇医药 转换 TS
沉默突变
SM
985
GTC
插入 IS
Val
990
GGC
插入 IS
Gly
C
H
, 百拇医药 注：H: α-螺旋(α-helix) S：β-折叠(β-sheet) T：β-转角(β-turn) C： 无规卷曲(random coil) TS:转换(transition) TV：颠换(transversion) SM：沉默突变 (silent mutation) HYPL:亲水区(hydrophilic area) HYPB:疏水区(hydrophobic area) BmV-J: BmNPV Japanese isolate BmV-C: BmNPV Chinese isolate
图2 BmNPV-Ch与BmNPV-Ja vp39基因的核苷酸序列比较
Fig.2 Comparison of nucleotide sequences of vp39 from BmNPV-Ch and BmNPV-Ja
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2.3 推导的BmNPV-Ch vp39基因编码的氨基酸序列
BmNPV-Ch vp39基因编码一个由350个氨基酸组成的分子量39107 Da的囊膜蛋白，它比BmN PV -Ja的VP39蛋白多3个氨基酸，同源性97.1%(图3)。全部氨基酸有20种，含量 最高的氨基酸 依次为：Leu(28)，Asn(27), ILe(25),Ser(25), Arg(25),Gly(24),Ala(24),Val(23);含量 最少的氨基酸有Trp(1),His(5), Cys(7)。其中Asp+Glu为37个；Arg+Lys有35个。因此，VP3 9蛋白的酸性和碱性氨基酸基本平衡。
图3 BmNPV-Ch与BmNPV-Ja VP39蛋 白的氨基酸序列比较
Fig.3 Comparison of amino acid sequences about VP39 from BmNPV-Ch and BmNPV-J a
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以上分析指出，尽管BmNPV-Ch的vp39基因存在17个点突变，但有意突变只有7个，而 其中只有一个点突变对该蛋白的疏水性和酸碱性带来小的改变。两种VP39蛋白的亲疏水性和 酸碱性图谱基本一致，估计其蛋白质的电荷载量，亲疏水性质和抗原特性不会有改变。
2.4 两株BmNPV VP39蛋白的二级结构及其比较
BmNPV-Ja和BmNPV-Ch VP39蛋白的二级结构列于图4和表2。从图4看出，两株BmNPV的VP39 蛋白的二级结构基本相似，它们都存在大量的β-转角，其次是β-折迭，α-螺旋含量较少。
表2 两株BmNPV VP39蛋白二级结构单元的含量
Table 2 Comparison of the secondary structure units of VP39 from BmNPV-Ch and BmNPV-Ja 二级结构单元
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Secondary structure
element
BmNPV-Ja
BmNPV-Ch
%
氨基酸数
Amino acid
%
氨基酸数
Amino acid
α-螺旋
13.2
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46
15.4
54
α-helix
β-折叠
34.6
120
34.2
120
β-sheet
β-转角
45.0
156
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44.7
156
β-turn
无规卷曲
7.2
25
5.8
20
random coil
图4 BmNPV中国株和日本株VP39蛋白 的二级结构分析
Fig.4 Analysis of the secondary structures about VP39 from BmNPV-Ch and BmNPV -Ja
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从表2看出，两株BmNPV的VP39蛋白有相同数量的β-折叠和β-转角，其差别主要在α-螺 旋和无规卷曲的数量上。BmNPV-Ch的α-螺旋比BmNPV-Ja增加了7个氨基酸，无规卷曲减 少了5个氨基酸。它们的β-折叠主要分布在N端的12～32和54～66位处，一个大的α-螺旋主要分布在β-折叠之后102～121位处。大量的β-转角(31个)均匀分布在整个蛋白分子 中，其中一半以上位于β-折叠之间，而使整个蛋白的分子形成片层状折叠结构。
尽管如此，由于BmNPV-Ch vp39基因的4个点突变带来了蛋白质二级结构的变化(图4)，致使 BmNPV-Ch VP39蛋白的N端增加了一个β-折叠，C端增加了一个α-螺旋，但二级结构的总 和仍保持相对平衡状态。由于β-折叠和β-转角是BmNPV囊膜蛋白的主要结构单元，因此 两株BmNPV VP39蛋白的二级结构基本一致。
3 讨论
vp39基因又称核衣壳蛋白基因，它不仅是杆状病毒的与装配核衣壳有关的必需结构蛋白 基因，而且是与宿主细胞的裂解和宿主机体液化密切相关的基因[10，11] 。本研究在对BmNPV-Ch vp39基因PCR扩增基础上进行了序列测定和在大肠杆菌中的克隆表 达，证明所扩增的片段为BmNPV-Ch株的vp39基因。杆状病毒的命名均以其天然宿主昆虫的 学名为依据，但是同一种昆虫往往被几种不同的杆状病毒感染，而从不同地区和不同生态环 境(但从同一宿主)分离的病毒也有血清型、生态型和株型的差别。几乎所有的医学病毒都证 明了这一点。不同血清型、株型的同一病毒不仅在基因型上有差异，也是临床诊断，预防治 疗的分子基础。因此，研究同一病毒不同地理分离物之间基因型和表型的差异是一个很重要 的命题，但这一领域恰恰在昆虫病毒学中被忽视。从日本引进的BmNPV和我国分离的BmNPV应 该是不同的。本研究以这两株BmNPV的vp39基因为对象，从核苷酸序列、氨基酸序列、亲疏 水性质、酸碱性质、蛋白质二级结构等多个方面进行了比较，发现它们在各自的生态环境中 经过长期突变的累积，产生了基因序列的17处点突变带来了7个氨基酸的改变，相应于氨基 酸的改变带来了亲疏水性的微小变化、α-螺旋微弱增加、无规卷曲稍有减少，但是vp39蛋 白的亲疏水性和酸碱性图谱并未改变，总体二级结构特点仍维持不变，保持VP39蛋白均是以 β-折叠和β-转角为主要结构单元的片层状折叠结构。这些微小变异对VP39蛋白的功能有 什么影响现在还不清楚。■
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基金项目：国家自然科学基金和国家教委博士点基金资助
简介作者：齐义鹏(1937-)，男，教授，博士导师，主要从事分子病毒学研究
孙晓洁 华中师范大学生命科学院96级研究生
参考文献：
[1]Ayers MD, Howard SC, Kuail J. The complete DNA sequence of Auto grapha californica nuclear polyhedrosis virus [J]. Virol, 1994,202:586～605
[2]Blissard GW, Quant-russell RL, Rohrmann GF et al. Nucleotide sequence, transcriptonal mapping and temporal expression of the gene encodingp39, ama jor structural protein of the multicapsid nuclear polyhedrosis virus of Orgyia pseucotsugata [J]. Virol, 1989,169:354～362
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[3]Chariton CA, Volkman LZ. Pentration of Autographa californica nuclear polyhedrosis virus nucleocapsids into IPLB Sf21 cells induces actin cable fo rmation [J]. Virol, 1993,197:245～254
[4] Slack JM, Kuzio J, Faulkner P. Characterization of V-cath, a cathepsin L-like proteinase expressed by the baculovirus Autographa califrnica nuclear polyhedrsis virus[J]. J Gen Virol, 1995,76:1091～1098
[5]Maeda S. Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus DNA complete genome[R]. 1996:GenBank Accession Number L33180
, http://www.100md.com
[6]邓小昭，刁振宇，朱应等.家蚕BmN细胞的微载体培养及HBeAg的高效表达[J].中国病毒学，1998，13：236～242
[7]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual [M]. 2ed. Cold Spring Harboor Press, New York.1989
[8]Sanger F, Nicklen S, Coulsin AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors [J]. Proc Nat1 Acad Sci U S A, 1977,74:5463
[9]Liu DL, Sun XJ, Qi YP et al. Cloning and expression of the vp39 gene of Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus in E.coli[J]. Wuhan Univ J of Natural Sciences, 1998,3(1):108～112
, 百拇医药
[10]Rohrmann G F. Baculovirus structural proteins[J]. J Gen Virol, 1992, 73:749～761
[11]Todd J W, Passarelli A L. Lu A et al. Factors regulating baculovirus late and very late gene expression in transient-expression assays [J]. J Virol, 1996,70:2307～2317
收稿日期：1998-12-30
修稿日期：1999-04-05, 百拇医药
单位：武汉大学病毒研究所，武汉 430072
关键词：核衣壳蛋白基因；克隆；家蚕核型多角体病毒；点突变；二级结构
中国病毒学000109
摘 要：以苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)的核衣壳蛋白基因vp39设计引物，用PCR技术扩增了家蚕核型多角体病毒中国株(BmNPV-Ch)～1.3kb片段，并测定了其全序列长1230bp。推导的氨基酸351个，其与BmNPV日本株(BmNPV-Ja)vp39基因核苷酸序列同源性达97.5%，氨基酸同源性达97.1%。该片段在E.coli BL21中诱导表达能产生分子量约为38kD 的特征性蛋白带，证明所扩增片段为BmNPV-Ch的vp39基因。经与BmNPV-Ja比较，其625位 有3个核苷酸(CGA)，985～910位有6个核苷酸(GTCGGC)的插入，未造成码组移动。有17处点突变，但取代突变(replacement mutation)仅7处，对两株病毒VP39蛋白的亲疏水性和酸碱 性质未产生显著影响。由于点突变带来氨基酸改变，使BmNPV-Ch的vp39蛋白的α-螺旋由13.2%增加到15.4%，无规卷曲由7.2%减少到5.8%，β-折叠和β-转角维持不变，约为79.6%，仍保持以β-折叠为主要二级结构单元的片层状折叠结构。
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分类号：Q753 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)01-0052-07
Comparison Study about the vp39 Gene of Bombyx mori Nuclear
Polyhedrosis Virus Two Isolates from China and Japan
QI Yi-peng, LIU De-li, SUN Xiao-jie
(Institute of Virology, Wuhan University, Wuhan 430072, China)
Abstract：The nuclear capsid protein gene (vp39) of Bombyx morin uclear polyhedrosis virus (Chinese isolate, BmNPV-Ch) was amplified by PCR and inserted into pGEM 3zf(+). The amplified vp39 gene (1230 bp) was sequenced with silver-staining dideoxy chain termination. The coding region is 1053 bp,and code for 351 amino acids. Comparing with the vp39 gene of BmNPV-Ja (Japanese is olate), the homology of the nucleotide and the amino acid sequences is 97.5% and 97.1% respectively.The BmNPV vp39 gene was inserted into the expression vector pRS ET-A, and transformed into E.coli BL21. This gene from BmNPV-Ch is 9bp longer than that of BmNPV-Ja. The insertion of nine nucleotides is found in vp39 gene sequence of BmNPV-Ch (CGA at 625 site and GTCGGC at 985-910). Although there are 17 site-mutations, only 7 site-mutations are replacement mutations. There was no effect to the hydrophilicity and charge of two isolates of VP39. Thereplacement of anino acids caused by the site mutations made the changes of the secondary structure of Bmvp39-Ch.e.g.α-helix increased from 13.2% to 15.4%; rundom coil decreased from 7.2% to 5.8%. β-sheet and β-turn of two isolates were similiar (about 79.6%). It is indicated that the main secondary structure of the VP39 protein is fold sturcture containing high proportion of β-sheet and β-turn. This structure may be concordant with its function.
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Key words：Nuclear capsid gene (vp39); Gene cloning, BmNPV; Site mutation; Secondary structure▲
杆状病毒的分子生物学是近来十分活跃的研究领域之一，其模型种苜蓿丫纹夜蛾核型多角体 病毒(Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus, AcNPV)的研究已取得了 重大进展。1994年，Ayers等人[1]公布了AcNPV DNA 134kb全序列。已鉴定的重 要基因有50多个，包括核衣壳蛋白vp39基因。Blissard等[2]研究了黄杉毒蛾核 型多角体病毒(Orgyia pseudotsugata NPV, OpNPV)vp39基因的结构及瞬时表达。最近 的研究发现：AcNPV的vp39基因与侵染密切相关。在侵染过程中，VP39蛋白与宿主的肌动蛋 白结合，使其重排形成缆索(cable)，导致细胞骨架发生变化有利于病毒编码的蛋白酶的水 解，最后，子代病毒颗粒大量形成，宿主昆虫体全部液化成为脓水[3，4]。可见 ，vp39基因是杆状病毒的一个十分重要的基因。由于家蚕(Bombyx mori)表达系统的独 特优点，因此，家蚕NPV(BmNPV)亦是研究得比较深入的一种杆状病毒。Maeda等[5] 测定BmNPV日本株(BmNPV-Ja)的基因组全序列。我国学者[6]也有不少关于BmNP V分子生物学的报道。他们使用的毒株多为从日本引进，也有从我国罹病的家蚕幼虫中分 离。这两种地理分离物是同一毒株，还是有所差别，未引起任何重视。本研究克隆表达了Bm NPV中国分离物(BmNPV-Ch)的vp39基因，并测定了其全序列。经与BmNPV-Ja比较，发现它 们的序列和结构有某些差异，但其基本性质不变。本研究结果不仅对vp39基因的研究有重要 理论意义，也为我国病毒资源的开发利用提出了新的命题。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 试剂，质粒及菌株
限制性内切酶，T4 DNA连接酶，Taq DNA聚合酶，SIVER-SEQUENCETM等购自Promega 公司和华美生物技术公司。BmNPV中国分离物由南京军区军事医学研究所邓小昭博士赠送。 质粒pGEM3zf，表达质粒pRSET-A，大肠杆菌TG1和BL21等由本室保存。
1.2 病毒DNA的提取
用BmNPV-Ch感染家蚕细胞。当50%左右的细胞中形成多角体后，2000r/min离心除去细胞 ，40000g离心40min收集病毒粒子。加入蛋白酶K(终浓度100μg/mL)和1%SDS裂解病 毒粒子，释放DNA。按常规方法以酚、氯仿抽提，乙醇沉淀DNA。
1.3 重组质粒的构建和筛选
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参照AcNPV vp39基因序列设计PCR引物，正向引物P1：GCCGGATCCAACAATATGGCGCTAGT；反向 引物P2：CCGGAGCTCGTTTTCTAATCTTGCGT。以BmNPV-Ch DNA为模板扩增回收PCR产物，并克隆 到pGEM3zf中，转化大肠杆菌TG1，加入X-gal/IPTG诱导，经兰白斑筛选，得到阳性重组质粒pGEM-39，经BamHI/EcoRI酶切重组质粒pGEM-39 DNA，回收小片段，将其插入到原核表达载体pRSET-A中，构建重组表达质粒pRSET-39。质粒DNA的制备、酶切、连接和转化按文献[7]进行。
1.4 BmNPV 1.3kb PCR片段的序列测定
大量制备重组质粒pGEM-39，并经PEG8000纯化后，用ddNPV/PCR/银染测序法。参照文献[8 ] 和试剂盒说明书测定3′、5′两侧末端序列，全序列测定由加拿大GendaTech Co.完成。
, 百拇医药
1.5 vp39基因的同源性比较及推导的囊膜蛋白的二级结构分析
采用DNASIS软件和PROSIS软件分析BmNPV-Ch与日本株BmNPV-Ja vp39基因的序列和氨基酸 同源性。分析两株病毒VP39蛋白的亲疏水性、酸碱性和二级结构并进行详细比较研究。
2 结果
2.1 BmNPV-Ch 1.3kb片段的克隆及序列测定
根据我们[9]以前的报道，将BmNPV-Ch～1.3kb的PCR扩增片段定向克隆到pGEM3 Zf的BamHI/SacI位点，阳性重组质粒命名为pGEM-39，用于序列测定。同时用BamHI/EcoRI 回 收PCR片段，亚克隆到表达质粒pRSET-A的同一位点，构建表达载体pRSET-39(图1)。用双 脱 氧末端终止法测定了pGEM-39中PCR片段的序列，发现一长1053bp的ORF(该序列已储存 美国GenBank，编号：AF063104)。
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图1 重组表达载体 pRSET-39的构建
Fig.1 Construction of recombinant expression plasmid pRSET-39
2.2 BmNPV-Ch～1.3kb片段的序列及其同BmNPV-Ja vp39基因 的比较
图2是BmNPV-Ch vp39与BmNPV-Ja vp39基因序列[6]的比较，它们的核苷酸同源 性达97.5%。证明此ORF应为BmNPV-Ch的vp39基因，它比BmNPV-Ja vp39基因序列长9bp， 其中第625～627位增加了CGA，985～990位增加了GTCGGC。表明BmNPV-Ch vp39基因有两处 插入突变，插入碱基分别是1×3和2×3。因此，并未造成码组移动(图2)。此外，BmNPV-Ch vp39基因中还有17处点突变(图2，表1)。从表1看出，BmNPV-Ch的vp39基因17处点突变的 主要类型是转换(10处)，有意突变7个，大部分是沉默突变。
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表1 BmNPV-Ch vp39基因的点突变及其对蛋白质性质和 结构的影响
Table 1 The site mutations of BmNPV-Ch vp39 and their effect on the structure of VP39 protein 序号
No.
核苷酸
Nucleotide
突变
类型
Mutation
序号
No.
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氨 基酸
Amino acid
亲水
区
HYPL
疏水
区
HYPB
二级结构
2nd struct ure
日本株
BmV -J
中国株
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B mV-C
日本株
BmV-J
中国株
BmV-C
日本株
BmV-J
中国株
BmV-C
10
ATG
GTG
转换 TS
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4
Met
Val
T
S
34
AAA
CAA
颠换 TV
12
Lys
Gln
C
T
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61
GCG
TCG
颠换 TV
21
Lys
Ser
102
TCG
TCA
转换 TS
沉默突变
SM
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132
GAC
GAT
转换 TS
沉默突变
SM
162
ATC
ATA
颠换 TV
沉默突变
SM
264
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AGA
AGG
转换 TS
沉默突变
SM
295
ACC
GCC
转换 TS
99
Thr
Ala
S
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H
345
CAA
CAG
转换 TS
沉默突变
SM
434
AAG
ACG
颠换 TV
145
Lys
, 百拇医药
Thr
-1
-1
477
ATT
ATC
转换 TS
沉默突变
SM
513
CGT
CGG
颠换 TV
, 百拇医药
沉默突变
SM
540
TTC
TTT
转换 TS
沉默突变
SM
562
CGT
GGT
颠换 TV
188
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Arg
Gly
628
CGC
插入IS
Arg
-1
+2
S
H
711
ATG
ACG
, 百拇医药 转换 TS
858
AGG
AGC
颠换 TV
286
Arg
Ser
S
H
984
GGT
GGC
, 百拇医药 转换 TS
沉默突变
SM
985
GTC
插入 IS
Val
990
GGC
插入 IS
Gly
C
H
, 百拇医药 注：H: α-螺旋(α-helix) S：β-折叠(β-sheet) T：β-转角(β-turn) C： 无规卷曲(random coil) TS:转换(transition) TV：颠换(transversion) SM：沉默突变 (silent mutation) HYPL:亲水区(hydrophilic area) HYPB:疏水区(hydrophobic area) BmV-J: BmNPV Japanese isolate BmV-C: BmNPV Chinese isolate
图2 BmNPV-Ch与BmNPV-Ja vp39基因的核苷酸序列比较
Fig.2 Comparison of nucleotide sequences of vp39 from BmNPV-Ch and BmNPV-Ja
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2.3 推导的BmNPV-Ch vp39基因编码的氨基酸序列
BmNPV-Ch vp39基因编码一个由350个氨基酸组成的分子量39107 Da的囊膜蛋白，它比BmN PV -Ja的VP39蛋白多3个氨基酸，同源性97.1%(图3)。全部氨基酸有20种，含量 最高的氨基酸 依次为：Leu(28)，Asn(27), ILe(25),Ser(25), Arg(25),Gly(24),Ala(24),Val(23);含量 最少的氨基酸有Trp(1),His(5), Cys(7)。其中Asp+Glu为37个；Arg+Lys有35个。因此，VP3 9蛋白的酸性和碱性氨基酸基本平衡。
图3 BmNPV-Ch与BmNPV-Ja VP39蛋 白的氨基酸序列比较
Fig.3 Comparison of amino acid sequences about VP39 from BmNPV-Ch and BmNPV-J a
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以上分析指出，尽管BmNPV-Ch的vp39基因存在17个点突变，但有意突变只有7个，而 其中只有一个点突变对该蛋白的疏水性和酸碱性带来小的改变。两种VP39蛋白的亲疏水性和 酸碱性图谱基本一致，估计其蛋白质的电荷载量，亲疏水性质和抗原特性不会有改变。
2.4 两株BmNPV VP39蛋白的二级结构及其比较
BmNPV-Ja和BmNPV-Ch VP39蛋白的二级结构列于图4和表2。从图4看出，两株BmNPV的VP39 蛋白的二级结构基本相似，它们都存在大量的β-转角，其次是β-折迭，α-螺旋含量较少。
表2 两株BmNPV VP39蛋白二级结构单元的含量
Table 2 Comparison of the secondary structure units of VP39 from BmNPV-Ch and BmNPV-Ja 二级结构单元
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Secondary structure
element
BmNPV-Ja
BmNPV-Ch
%
氨基酸数
Amino acid
%
氨基酸数
Amino acid
α-螺旋
13.2
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46
15.4
54
α-helix
β-折叠
34.6
120
34.2
120
β-sheet
β-转角
45.0
156
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44.7
156
β-turn
无规卷曲
7.2
25
5.8
20
random coil
图4 BmNPV中国株和日本株VP39蛋白 的二级结构分析
Fig.4 Analysis of the secondary structures about VP39 from BmNPV-Ch and BmNPV -Ja
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从表2看出，两株BmNPV的VP39蛋白有相同数量的β-折叠和β-转角，其差别主要在α-螺 旋和无规卷曲的数量上。BmNPV-Ch的α-螺旋比BmNPV-Ja增加了7个氨基酸，无规卷曲减 少了5个氨基酸。它们的β-折叠主要分布在N端的12～32和54～66位处，一个大的α-螺旋主要分布在β-折叠之后102～121位处。大量的β-转角(31个)均匀分布在整个蛋白分子 中，其中一半以上位于β-折叠之间，而使整个蛋白的分子形成片层状折叠结构。
尽管如此，由于BmNPV-Ch vp39基因的4个点突变带来了蛋白质二级结构的变化(图4)，致使 BmNPV-Ch VP39蛋白的N端增加了一个β-折叠，C端增加了一个α-螺旋，但二级结构的总 和仍保持相对平衡状态。由于β-折叠和β-转角是BmNPV囊膜蛋白的主要结构单元，因此 两株BmNPV VP39蛋白的二级结构基本一致。
3 讨论
vp39基因又称核衣壳蛋白基因，它不仅是杆状病毒的与装配核衣壳有关的必需结构蛋白 基因，而且是与宿主细胞的裂解和宿主机体液化密切相关的基因[10，11] 。本研究在对BmNPV-Ch vp39基因PCR扩增基础上进行了序列测定和在大肠杆菌中的克隆表 达，证明所扩增的片段为BmNPV-Ch株的vp39基因。杆状病毒的命名均以其天然宿主昆虫的 学名为依据，但是同一种昆虫往往被几种不同的杆状病毒感染，而从不同地区和不同生态环 境(但从同一宿主)分离的病毒也有血清型、生态型和株型的差别。几乎所有的医学病毒都证 明了这一点。不同血清型、株型的同一病毒不仅在基因型上有差异，也是临床诊断，预防治 疗的分子基础。因此，研究同一病毒不同地理分离物之间基因型和表型的差异是一个很重要 的命题，但这一领域恰恰在昆虫病毒学中被忽视。从日本引进的BmNPV和我国分离的BmNPV应 该是不同的。本研究以这两株BmNPV的vp39基因为对象，从核苷酸序列、氨基酸序列、亲疏 水性质、酸碱性质、蛋白质二级结构等多个方面进行了比较，发现它们在各自的生态环境中 经过长期突变的累积，产生了基因序列的17处点突变带来了7个氨基酸的改变，相应于氨基 酸的改变带来了亲疏水性的微小变化、α-螺旋微弱增加、无规卷曲稍有减少，但是vp39蛋 白的亲疏水性和酸碱性图谱并未改变，总体二级结构特点仍维持不变，保持VP39蛋白均是以 β-折叠和β-转角为主要结构单元的片层状折叠结构。这些微小变异对VP39蛋白的功能有 什么影响现在还不清楚。■
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基金项目：国家自然科学基金和国家教委博士点基金资助
简介作者：齐义鹏(1937-)，男，教授，博士导师，主要从事分子病毒学研究
孙晓洁 华中师范大学生命科学院96级研究生
参考文献：
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[5]Maeda S. Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus DNA complete genome[R]. 1996:GenBank Accession Number L33180
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收稿日期：1998-12-30
修稿日期：1999-04-05, 百拇医药