四种理化因子对脊髓灰质炎病毒感染性与标志物破坏结果的比较
作者：张文清 姜绍谆* 马文煜* 骆文静 张进
单位：张文清 骆文静 张进姜第四军医大学军队卫生学教研室，西安 710032；绍谆* 马文煜*第四军医大学微生物学教研室
关键词：病毒灭活检测法；脊髓灰质炎病毒；抗原；核酸；热力；紫外线；次氯酸钠碘
中国消毒学杂志9901006 提要 分别以热力、紫外线、次氯酸钠、碘对脊髓灰质炎病毒1型作用后，检测感染性、抗原性与核酸。经热力或碘作用后，病毒感染性消失与抗原性破坏较一致，而核酸破坏明显滞后；经氯或紫外线作用后，病毒感染性消失与核酸破坏较一致，而抗原性破坏不明显。
COMPARISON OF DESTRUCTIVE EFFECTS OF FOUR PHYSICALC AND CHEMICAL AGENTS ON INFECTIVITYC AND MARKER OF POLIOMYELITIS VIRUS
, http://www.100md.com
Zhang Wenqing Jiang Shaochun* Ma Wngyu* Luo Wenjing Zhang Jin
(Department of Army Hygiene, the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032)
Abstract After exposure of poliomyelitis virus type 1 (PV Ⅰ) to heat, ultraviolet rays, sodium hypochlorite and iodine, its infectivity was observed using plaque counting method, its antigenicity was examined with Western blot test and its nucleic acid was examined with PCR. The results indicated that the infectivity of the virus disappeared after exposure to 60～100℃ heat or 2～16mg/L available iodine for 5～60min. This conformed with destruction of antigenicity, while destruction of nucleic acid significantly delayed. After exposure to ultraviolet irradiation at intensity of 768～4620 μW/cm2 or 0.2～0.5mg/L availabel chlorine of sodium hypochlorite solution for 5～60min, the infectivity of the virus disappeared in conformity with destruction of nucleic acid, while destruction of the antigenicity was not significant.
, 百拇医药
Key words method of examining virus inactivation poliomyelitis virus antigennucleic acid heat ultraviolet rays sodium hypochlorite iodine
脊髓灰质炎病毒多出现于环境水体中。为了解在水消毒研究中各种检测方法对评定该病毒灭活效果的意义，于实验室内进行了对比试验。对比的检测方法有以下3种：① 以免疫印迹试验(DIBA)检测该病毒抗原的抗原性；②用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测核酸；③据噬斑计数法(PFUA)判断病毒的感染性。所用杀菌因子有：热力、紫外线、碱性次氯酸钠溶液、碘溶液。现将结果报告于下。
1 方法
1.1病毒水样的制备
将脊髓灰质炎病毒 1 型(PV1) 经PEG6000沉淀、差速离心纯化后，作抗菌处理，再用无菌三蒸去离子水稀释至含量为 105 TCID50/ml 的悬液，作为病毒水样。
, 百拇医药
1.2消毒处理
1.2.1 热力 取1.0ml病毒水样，置离心管中，滴加50μl液体石蜡以防水份蒸发。用PCR扩增仪恒温加热至预定温度后计时。作用至预定时间，立即移至冰浴中。放置5min, 进行噬斑计数〔1〕、ORT-PCR〔2〕与DIBA〔3〕等检测。同时，设不加热对照管(置-4℃下)。
1.2.2 紫外线 取约0.6ml病毒水样，滴加至6孔聚乙烯培养板(直径4cm)中，使之形成一薄层。于37℃干燥后，分别置超净工作台中紫外线灯下30、20、10cm处(紫外线辐照度值分别为786、2030、4620μW/cm2)照射至预定时间(对照置相同室温下不经紫外线照射)。然后，加约0.5ml水混匀，进行上述各项检测。
1.2.3 消毒剂 将碱性次氯酸钠溶液(安替佛民，Antiformin)用磷酸盐缓冲液(pH 7.4)稀释，将固体碘用10%碘化钾溶液溶解并稀释至预定浓度。取病毒水样分别与两者(对照为磷酸盐缓冲液)混匀。作用至预定时间，加中和剂(经预试验选用2%硫代硫酸钠溶液)，混匀。中和作用10min，采用病毒漂浮法〔4〕将消毒剂与中和剂反应后的产物去除，再进行有关检测。
, 百拇医药
2 结果
2.1病毒漂浮法对PV 1的回收效果
经检测，含PV 1 4.0、5.0、6.0 TCID50/ml悬液被病毒漂浮法处理后的感染性回收率分别为89.8%、94.5%、和92.5%。
2.2热力对PV 1的灭活作用
试验表明，80℃作用30min，或95℃作用5min，可使PV 1感染性全部消失；80℃作用60 min，或100℃作用10min，才将抗原性破坏；而使其核酸破坏则需100℃作用60min(表1)。表1 热力作用后PV 1不同指标的变化
Table 1 Changes in various indices of PV 1 after exposure to heat 作用温度
, http://www.100md.com
Temperature
(℃)
作用不同时间(min)的结果
Results after exposure for different
periods of time (min)
0
5
10
30
60
核酸
Nucleic acid
, http://www.100md.com
60
+
+
+
+
+
80
+
+
+
+
+
95
+
, 百拇医药
+
+
+
+
100
+
+
+
+
-
抗原性
Antigenicity
60
+
, http://www.100md.com
+
+
+
+
80
+
+
+
+
-
95
+
+
+
, http://www.100md.com
+
-
100
+
+
-
-
-
蚀斑数
Plaque count (pfu/ml)
60
760 000
610000
, 百拇医药
420000
970
17
80
760 000
760000
960000
0
0
95
760 000
0
0
, 百拇医药
0
0
100
760 000
0
0
0
0
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。
Note:“+”denotes positive, “-”denotes negative.
2.3 紫外线对PV 1的灭活作用
以辐照度值为2030μW/cm2的紫外线照射30min，可使PV 1感染性消失，核酸破坏，但以辐照度值为4620μW/cm2的紫外线照射60min仍不能将抗原性破坏(表2)。表2 紫外线照射后PV 1不同指标的变化
, 百拇医药
Table 1 Changes in various indices of PV 1after ultraviolet irradiation_ 辐照度值
Radiationin
tensity
(μW/cm2)
照射不同时间(min)的结果
Results after irradiation for different
periods of time (min)
0
5
, http://www.100md.com
10
30
60
核酸
Nucleic acid
768
+
+
+
+
+
2030
+
, 百拇医药 +
+
-
-
4620
+
+
+
-
-
抗原性
Antigenicity
768
+
, 百拇医药
+
+
+
+
2030
+
+
+
+
+
4620
+
+
+
, 百拇医药
+
+
蚀斑数
Plaque count (pfu/ml)
768
710 000
730 000
21 000
96
0
2030
710 000
900
, 百拇医药
73
0
0
4620
710 000
89
0
0
0
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。试验温度为22℃。
Note:“+”denotes positive, “-”denotes negative. The temperature was 22℃.
, http://www.100md.com
2.4 碱性次氯酸钠溶液对PV 1的灭活作用
在19℃条件下试验，以0.3mg/L有效氯作用60min，或以0.5mg/L有效氯作用30min，均可使PV 1感染性消失，核酸破坏，而以0.5mg/L有效氯作用60min仍不能将抗原性破坏(表3)。表3 含氯消毒剂对PV 1作用后各指标的变化
Table 1 Changes in various indices of PV 1 after exposure to chlorine-containing disinfetant 有效氯浓度Available chlorine
concentration
(mg/L)
作用不同时间(min)的结果
, http://www.100md.com
Results after exposure for different
periods of time (min)
0
5
10
30
60
核酸
Nucleic acid
0.2
+
+
, 百拇医药
+
+
+
0.3
+
+
+
+
-
0.4
+
+
+
+
, 百拇医药
-
0.5
+
+
+
-
-
抗原性
Antigenicity
0.2
+
+
+
+
, 百拇医药
+
0.3
+
+
+
+
+
0.4
+
+
+
+
+
0.5
, 百拇医药
+
+
+
+
+
蚀斑数
Plaque count (pfu/ml)
0.2
570000
450000
910
780
29
, http://www.100md.com
0.3
570000
82000
450
11
0
0.4
570000
27000
71
0
0
0.5
, 百拇医药
570000
300
12
0
0
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。试验温度为19℃。
Note:“+”denotes positive, “-”denotes negative.The temperature was 19℃.
2.5碘对PV 1的灭活作用
23℃条件下试验表明，以2mg/L有效碘作用60min，或4mg/L、8mg/L有效碘分别作用30min与5min，均可使PV 1感染性消失，抗原性破坏，但16mg/L有效碘作用60min仍不能将核酸破坏(表4)。
, 百拇医药
表4 碘对PV 1作用后各指标的变化
Table 1 Changes in various indices of PV 1 after exposure to iodine 有效碘浓度Available iodine
concentration(mg/L)
作用不同时间(min)的结果
Results after exposure for different
periods of time (min)
0
5
10
, 百拇医药
30
60
核酸
Nucleic acid
2
+
+
+
+
+
4
+
+
+
, 百拇医药
+
+
8
+
+
+
+
+
16
+
+
+
+
+
, 百拇医药
抗原性
Antigenicity
2
+
+
+
+
-
4
+
+
-
-
-
, 百拇医药
8
+
-
-
-
-
16
+
-
-
-
-
蚀斑数
Plaque count (pfu/ml)
, http://www.100md.com
2
670000
68000
55000
210
0
4
670000
58000
66
0
0
8
, 百拇医药
670000
0
0
0
0
16
670000
0
0
0
0
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。试验温度为23℃。
Note:“+”denotes positive, “-”denotes negative. The temperature was 23℃.
, 百拇医药
3 讨论
3.1 _作病毒感染性测定时，细胞培养所需时间较长，试验条件要求高，操作亦较复杂，且缺乏特异性。因此，有人用检测病毒的抗原性、核酸片段，粒子结构变化，作为替代指标。据报道，所使用替代标志物的破坏与病毒感染性消失常不一致，原因是：① 标志物检测与感染性检测的方法灵敏度有差异，如大部分肠道病毒的蚀斑计数法(PFUA)灵敏度比抗原性测定方法(ELISA)高10倍以上〔5〕；② 不同消毒剂对病毒的作用靶位不同，病毒感染性与标志物对消毒因子抗力不同，如紫外线照射至甲型肝炎病毒感染性消失与核酸破坏时，抗原性仍未破坏〔6〕。然而，作为病毒灭活的理想替代指标应具备安全性(阴性结果能代表感染性消失)与代表性(阳性结果能代表感染性存在)。本实验结果，4种消毒因子作用后，均未出现核酸破坏而仍产生噬斑的结果。我们将PT-PCR 检测阴性的病毒盲传培养3～4代，再经检测，核酸与噬斑均仍为阴性。
3.2 试验结果显示，经热力、碘作用后，病毒感染性消失与抗原性破坏较一致；经紫外线、氯作用后，则感染性消失与核酸破坏较一致。这可能与不同消毒因子的作用靶位不同，及病毒RNA 与抗原性对不同杀菌因子的抗力不同有关。因此，对不同杀菌因子选取检测病毒灭活效果的替代标志物时，应区别对待。
, 百拇医药
3.3 _以RT-PCR法检测核酸作替代指标时，RT-PCR检测阳性并不能表明病毒核酸未遭破坏。原因是：①病毒RNA的一级结构(即基因序列)虽未改变，仅二、三级结构发生不可逆转的变化时，病毒可能已失去感染性；②病毒RNA虽断裂成不同长度的片断，只要仍有PCR特定引物引导扩增的数百个核苷酸序列存在，检测结果仍可为阳性。这种结果与裸露的完整或不完整RNA在水中的水解速度有关。
参考文献
〔1〕 戴华生. 新实验病毒学. 北京: 中国学术出版社, 1983: 114～123.
〔2〕 方肇寅，温乐英，章菁，等. PCR 方法检测我国脊髓灰质炎病毒1型野毒株的研究. 病毒学报, 1994; 10(1): 51.
〔3〕 徐志凯. 实用单克隆抗体技术. 西安: 陕西科学技术出版社，1992: 50～51.
, 百拇医药
〔4〕 史江，王元伦，郑纪山，等. 用病毒漂浮技术研究消毒剂对甲肝病毒的灭活作用. 中国公共卫生学报, 1992; (增刑): 36.
〔5〕 Kopecka H, Dubrou S, Prevot J, et al. Detection of naturally occurring enteroviruses in water by reverse franseription, polymerase chain reaction, and hybridization. Appl Environ Microbiol, 1993; 59(4): 1213.
〔6〕 Wang CH,Tschen SY,Elehmig B. Antigenicity of hepatitis A virus after ultra-violet inactivation.Vaccine, 1995; 13(9): 835.
(1997-11-28收稿 1998-09-07修回), 百拇医药(张文清 姜绍谆* 马文煜* 骆文静 张进)
单位：张文清 骆文静 张进姜第四军医大学军队卫生学教研室，西安 710032；绍谆* 马文煜*第四军医大学微生物学教研室
关键词：病毒灭活检测法；脊髓灰质炎病毒；抗原；核酸；热力；紫外线；次氯酸钠碘
中国消毒学杂志9901006 提要 分别以热力、紫外线、次氯酸钠、碘对脊髓灰质炎病毒1型作用后，检测感染性、抗原性与核酸。经热力或碘作用后，病毒感染性消失与抗原性破坏较一致，而核酸破坏明显滞后；经氯或紫外线作用后，病毒感染性消失与核酸破坏较一致，而抗原性破坏不明显。
COMPARISON OF DESTRUCTIVE EFFECTS OF FOUR PHYSICALC AND CHEMICAL AGENTS ON INFECTIVITYC AND MARKER OF POLIOMYELITIS VIRUS
, http://www.100md.com
Zhang Wenqing Jiang Shaochun* Ma Wngyu* Luo Wenjing Zhang Jin
(Department of Army Hygiene, the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032)
Abstract After exposure of poliomyelitis virus type 1 (PV Ⅰ) to heat, ultraviolet rays, sodium hypochlorite and iodine, its infectivity was observed using plaque counting method, its antigenicity was examined with Western blot test and its nucleic acid was examined with PCR. The results indicated that the infectivity of the virus disappeared after exposure to 60～100℃ heat or 2～16mg/L available iodine for 5～60min. This conformed with destruction of antigenicity, while destruction of nucleic acid significantly delayed. After exposure to ultraviolet irradiation at intensity of 768～4620 μW/cm2 or 0.2～0.5mg/L availabel chlorine of sodium hypochlorite solution for 5～60min, the infectivity of the virus disappeared in conformity with destruction of nucleic acid, while destruction of the antigenicity was not significant.
, 百拇医药
Key words method of examining virus inactivation poliomyelitis virus antigennucleic acid heat ultraviolet rays sodium hypochlorite iodine
脊髓灰质炎病毒多出现于环境水体中。为了解在水消毒研究中各种检测方法对评定该病毒灭活效果的意义，于实验室内进行了对比试验。对比的检测方法有以下3种：① 以免疫印迹试验(DIBA)检测该病毒抗原的抗原性；②用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测核酸；③据噬斑计数法(PFUA)判断病毒的感染性。所用杀菌因子有：热力、紫外线、碱性次氯酸钠溶液、碘溶液。现将结果报告于下。
1 方法
1.1病毒水样的制备
将脊髓灰质炎病毒 1 型(PV1) 经PEG6000沉淀、差速离心纯化后，作抗菌处理，再用无菌三蒸去离子水稀释至含量为 105 TCID50/ml 的悬液，作为病毒水样。
, 百拇医药
1.2消毒处理
1.2.1 热力 取1.0ml病毒水样，置离心管中，滴加50μl液体石蜡以防水份蒸发。用PCR扩增仪恒温加热至预定温度后计时。作用至预定时间，立即移至冰浴中。放置5min, 进行噬斑计数〔1〕、ORT-PCR〔2〕与DIBA〔3〕等检测。同时，设不加热对照管(置-4℃下)。
1.2.2 紫外线 取约0.6ml病毒水样，滴加至6孔聚乙烯培养板(直径4cm)中，使之形成一薄层。于37℃干燥后，分别置超净工作台中紫外线灯下30、20、10cm处(紫外线辐照度值分别为786、2030、4620μW/cm2)照射至预定时间(对照置相同室温下不经紫外线照射)。然后，加约0.5ml水混匀，进行上述各项检测。
1.2.3 消毒剂 将碱性次氯酸钠溶液(安替佛民，Antiformin)用磷酸盐缓冲液(pH 7.4)稀释，将固体碘用10%碘化钾溶液溶解并稀释至预定浓度。取病毒水样分别与两者(对照为磷酸盐缓冲液)混匀。作用至预定时间，加中和剂(经预试验选用2%硫代硫酸钠溶液)，混匀。中和作用10min，采用病毒漂浮法〔4〕将消毒剂与中和剂反应后的产物去除，再进行有关检测。
, 百拇医药
2 结果
2.1病毒漂浮法对PV 1的回收效果
经检测，含PV 1 4.0、5.0、6.0 TCID50/ml悬液被病毒漂浮法处理后的感染性回收率分别为89.8%、94.5%、和92.5%。
2.2热力对PV 1的灭活作用
试验表明，80℃作用30min，或95℃作用5min，可使PV 1感染性全部消失；80℃作用60 min，或100℃作用10min，才将抗原性破坏；而使其核酸破坏则需100℃作用60min(表1)。表1 热力作用后PV 1不同指标的变化
Table 1 Changes in various indices of PV 1 after exposure to heat 作用温度
, http://www.100md.com
Temperature
(℃)
作用不同时间(min)的结果
Results after exposure for different
periods of time (min)
0
5
10
30
60
核酸
Nucleic acid
, http://www.100md.com
60
+
+
+
+
+
80
+
+
+
+
+
95
+
, 百拇医药
+
+
+
+
100
+
+
+
+
-
抗原性
Antigenicity
60
+
, http://www.100md.com
+
+
+
+
80
+
+
+
+
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95
+
+
+
, http://www.100md.com
+
-
100
+
+
-
-
-
蚀斑数
Plaque count (pfu/ml)
60
760 000
610000
, 百拇医药
420000
970
17
80
760 000
760000
960000
0
0
95
760 000
0
0
, 百拇医药
0
0
100
760 000
0
0
0
0
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。
Note:“+”denotes positive, “-”denotes negative.
2.3 紫外线对PV 1的灭活作用
以辐照度值为2030μW/cm2的紫外线照射30min，可使PV 1感染性消失，核酸破坏，但以辐照度值为4620μW/cm2的紫外线照射60min仍不能将抗原性破坏(表2)。表2 紫外线照射后PV 1不同指标的变化
, 百拇医药
Table 1 Changes in various indices of PV 1after ultraviolet irradiation_ 辐照度值
Radiationin
tensity
(μW/cm2)
照射不同时间(min)的结果
Results after irradiation for different
periods of time (min)
0
5
, http://www.100md.com
10
30
60
核酸
Nucleic acid
768
+
+
+
+
+
2030
+
, 百拇医药 +
+
-
-
4620
+
+
+
-
-
抗原性
Antigenicity
768
+
, 百拇医药
+
+
+
+
2030
+
+
+
+
+
4620
+
+
+
, 百拇医药
+
+
蚀斑数
Plaque count (pfu/ml)
768
710 000
730 000
21 000
96
0
2030
710 000
900
, 百拇医药
73
0
0
4620
710 000
89
0
0
0
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。试验温度为22℃。
Note:“+”denotes positive, “-”denotes negative. The temperature was 22℃.
, http://www.100md.com
2.4 碱性次氯酸钠溶液对PV 1的灭活作用
在19℃条件下试验，以0.3mg/L有效氯作用60min，或以0.5mg/L有效氯作用30min，均可使PV 1感染性消失，核酸破坏，而以0.5mg/L有效氯作用60min仍不能将抗原性破坏(表3)。表3 含氯消毒剂对PV 1作用后各指标的变化
Table 1 Changes in various indices of PV 1 after exposure to chlorine-containing disinfetant 有效氯浓度Available chlorine
concentration
(mg/L)
作用不同时间(min)的结果
, http://www.100md.com
Results after exposure for different
periods of time (min)
0
5
10
30
60
核酸
Nucleic acid
0.2
+
+
, 百拇医药
+
+
+
0.3
+
+
+
+
-
0.4
+
+
+
+
, 百拇医药
-
0.5
+
+
+
-
-
抗原性
Antigenicity
0.2
+
+
+
+
, 百拇医药
+
0.3
+
+
+
+
+
0.4
+
+
+
+
+
0.5
, 百拇医药
+
+
+
+
+
蚀斑数
Plaque count (pfu/ml)
0.2
570000
450000
910
780
29
, http://www.100md.com
0.3
570000
82000
450
11
0
0.4
570000
27000
71
0
0
0.5
, 百拇医药
570000
300
12
0
0
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。试验温度为19℃。
Note:“+”denotes positive, “-”denotes negative.The temperature was 19℃.
2.5碘对PV 1的灭活作用
23℃条件下试验表明，以2mg/L有效碘作用60min，或4mg/L、8mg/L有效碘分别作用30min与5min，均可使PV 1感染性消失，抗原性破坏，但16mg/L有效碘作用60min仍不能将核酸破坏(表4)。
, 百拇医药
表4 碘对PV 1作用后各指标的变化
Table 1 Changes in various indices of PV 1 after exposure to iodine 有效碘浓度Available iodine
concentration(mg/L)
作用不同时间(min)的结果
Results after exposure for different
periods of time (min)
0
5
10
, 百拇医药
30
60
核酸
Nucleic acid
2
+
+
+
+
+
4
+
+
+
, 百拇医药
+
+
8
+
+
+
+
+
16
+
+
+
+
+
, 百拇医药
抗原性
Antigenicity
2
+
+
+
+
-
4
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+
-
-
-
, 百拇医药
8
+
-
-
-
-
16
+
-
-
-
-
蚀斑数
Plaque count (pfu/ml)
, http://www.100md.com
2
670000
68000
55000
210
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注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。试验温度为23℃。
Note:“+”denotes positive, “-”denotes negative. The temperature was 23℃.
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3 讨论
3.1 _作病毒感染性测定时，细胞培养所需时间较长，试验条件要求高，操作亦较复杂，且缺乏特异性。因此，有人用检测病毒的抗原性、核酸片段，粒子结构变化，作为替代指标。据报道，所使用替代标志物的破坏与病毒感染性消失常不一致，原因是：① 标志物检测与感染性检测的方法灵敏度有差异，如大部分肠道病毒的蚀斑计数法(PFUA)灵敏度比抗原性测定方法(ELISA)高10倍以上〔5〕；② 不同消毒剂对病毒的作用靶位不同，病毒感染性与标志物对消毒因子抗力不同，如紫外线照射至甲型肝炎病毒感染性消失与核酸破坏时，抗原性仍未破坏〔6〕。然而，作为病毒灭活的理想替代指标应具备安全性(阴性结果能代表感染性消失)与代表性(阳性结果能代表感染性存在)。本实验结果，4种消毒因子作用后，均未出现核酸破坏而仍产生噬斑的结果。我们将PT-PCR 检测阴性的病毒盲传培养3～4代，再经检测，核酸与噬斑均仍为阴性。
3.2 试验结果显示，经热力、碘作用后，病毒感染性消失与抗原性破坏较一致；经紫外线、氯作用后，则感染性消失与核酸破坏较一致。这可能与不同消毒因子的作用靶位不同，及病毒RNA 与抗原性对不同杀菌因子的抗力不同有关。因此，对不同杀菌因子选取检测病毒灭活效果的替代标志物时，应区别对待。
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3.3 _以RT-PCR法检测核酸作替代指标时，RT-PCR检测阳性并不能表明病毒核酸未遭破坏。原因是：①病毒RNA的一级结构(即基因序列)虽未改变，仅二、三级结构发生不可逆转的变化时，病毒可能已失去感染性；②病毒RNA虽断裂成不同长度的片断，只要仍有PCR特定引物引导扩增的数百个核苷酸序列存在，检测结果仍可为阳性。这种结果与裸露的完整或不完整RNA在水中的水解速度有关。
参考文献
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〔6〕 Wang CH,Tschen SY,Elehmig B. Antigenicity of hepatitis A virus after ultra-violet inactivation.Vaccine, 1995; 13(9): 835.
(1997-11-28收稿 1998-09-07修回), 百拇医药(张文清 姜绍谆* 马文煜* 骆文静 张进)