用SCGE法检测燃煤污染型砷中毒患者血细胞DNA的损伤作用
作者：张爱华 黄晓欣 李军 蒋宪瑶 杨朝林
单位：张爱华(贵阳医学院 预防医学系，贵州，贵阳，550004)；黄晓欣(解放军第44医院，贵州，贵阳，550009)；李军(贵阳医学院 预防医学系，贵州，贵阳，550004)；蒋宪瑶(贵阳医学院 预防医学系，贵州，贵阳，550004)；杨朝林(贵阳医学院 预防医学系，贵州，贵阳，550004)
关键词：燃煤型砷中毒；单细胞凝胶电泳；DNA损伤
中国地方病学杂志000104 摘 要：目的 探讨砷中毒的致癌机理及寻找灵敏、实用的DNA损伤监测指标。方法 应用单细胞凝胶电泳法(SCGE)对贵州省兴仁县燃煤型砷中毒重病区175名砷接触者的血细胞DNA损伤进行了检测，并分析了相关因素的影响。结果 砷能引起人体血细胞DNA单链断裂，其损伤发生早于临床表现，并与尿砷、发砷呈正相关关系：与皮肤损害进展一致。吸烟和氟的影响可加重砷对DNA的损伤作用。结论 SCGE具有灵敏、快速、简便等优点，可作为一种早期、实用的方法应用于砷接触人群的DNA损伤监测。
, 百拇医药
中图分类号：R599.9 文献标识码：A
文章编号：1000-4955(2000)01-0007-03
Detection of DNA damage in blood cells of the patients of
coal-burnt arsenism by SCGE
ZHANG Ai-hua,HUANG Xiao-xin,LI Jun,et al
(Dept.of Preventive Medicine,Guiyang Medical College,Guiyang 550004,China)
Abstract：Objective In order to research arseniasis's mechanism on causing poisoning,especially resulting in skin carcinoma and search sensitive,practical monitoring index of DNA damage.Methods Using single cell gel electrophoresis assay (SCGE),the DNA damage in blood cells of 175 arsenic contacts was detected in Xingren County,Guizhou Province,where there was serious arsenism caused by burning coal,and the effects of related factors were analyzed too.Results Arsenic could induce DNA single strand breaks in human blood cells,which might happen before the occurrence of clinical manifestations.The DNA damage caused by arsenic had a positive correlation with the amount of arsenic in urine or hair,and coincided with the development of the pathological changes of skin.Cigarette smoking and fluorine might aggravate the arsenic-induced DNA damage. Conclusions It is suggested the SCGE can be used as a sensitive、rapid、handy、practical and early-stage monitoring method to detect DNA damage in the population exposed to arsenic.
, http://www.100md.com
Key words：SCGE;Arsenism caused by burning coal;DNA damage▲
燃煤型砷中毒是特定地区居民因长期燃用高砷煤致空气、食品污染而引起的以皮肤损害为主的慢性全身性疾病，已在贵州省构成严重危害。尽管经过20年的改灶、改水和治疗病人等综合防治，取得一定成效，但新发病人仍不断出现，病情继续发展以及肝硬化腹水和皮肤癌逐渐增多[1]。为了探讨砷中毒的致癌机理及寻找灵敏、实用的早期监测指标，我们在以往研究工作基础上，采用单细胞凝胶电泳(SCGE)方法对贵州省兴仁县交乐病区砷接触者的血细胞DNA损伤进行检测，并分析相关因素的影响。
1 材料与方法
1.1 调查点及对象的选择 选择贵州省燃煤型砷中毒重病区交乐乡为调查点，参考1991年省地病办确诊之病人，并重新复查确定调查对象175例[2]，根据临床皮肤病变分度标准[3]分为轻度、中度、重度砷中毒3组，该病区临床常规检查无异常者为病区非病人，选择病区12公里以外非燃用高砷煤村民41例为对照，排除有家族遗传史、吸烟史、半年内X线接触史及近期病毒感染者。
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1.2 SCGE方法[4，5]
1.2.1 主要试剂和仪器：低熔点琼脂糖(LMA)、溴化乙锭(EB)(Sigma)，正常熔点琼脂糖(NMA)(杭州微生物试剂厂，AR)；Triton X-100(Merck);DMSO(Farco);DYY-III-7B型转移电泳仪(北京六一仪器厂)；BH-REL-W型荧光显微镜(Nikon)。
1.2.2 SCGE试验流程：取砷中毒患者全血铺片→裂解细胞→解旋→电泳→EB染色→镜检。镜检以100瓦汞灯作为荧光光源，放大倍数为400倍，并以ISO400黑白135胶卷同步照像。在荧光显微镜下，未受损细胞表现为一圆形荧光核心，即慧星头部，无尾(图1)。而受损细胞则为断片离头向阳极方向迁移，形成慧星样的尾(图2，图3)。在电压、电流及其它条件一致时，其拖尾的长度与DNA损伤程度成正比。本实验选用DNA慧星尾长和DNA断裂分级两种观察指标。DNA断裂分级按慧星尾部占全部DNA量的比例判断：0级：<5%;Ⅰ级：5%～19%;Ⅱ级:20%～39%;Ⅲ级:40%～49%;Ⅳ级:>95%。每片随机观察100个细胞，计数各级所占比例。DNA慧星尾长用目镜测微尺在高倍镜下测出“慧头”中心到“慧尾”的长度，每处随机观察30个细胞，计算均值和标准差。
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1.3 数据统计与分析 用PEMS统计软件处理。慧星尾长的比较采用单因素分析，t、t′检验，并与发砷、尿砷进行积差相关分析。断裂分级进行Spearman等级相关分析和检验。
2 结果
2.1 不同组别砷接触者尿砷、发砷及DNA损伤的测定结果 见表1，表2。
表1 不同组别砷接触者尿砷、发砷及血细胞DNA慧星尾长 组别
尿砷(μg/L)
发砷(mg/kg)
DNA慧星尾长(μm)
n
(
±s)
, 百拇医药
n
(±s)
n
(±s)
对照组①病区非病人②
轻度砷中毒③
中度砷中毒④
重度砷中毒⑤
53
16
45
, http://www.100md.com
51
55
45.62 ±15.71
76.29 ±40.75**
121.14±110.28**△
140.15±135.52**△
145.18±128.53**△
45
16
46
48
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62
1.55±1.16
5.38±4.90**
6.72±6.11**
7.48±6.97**
7.92±7.79**
41
19
40
54
62
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8.55 ±4.13
13.84±8.78*
19.53±6.71**△
30.06±12.64**△△
38.16±14.42**△△
注：各组与对照组比较：*P<0.05,**P<0.01;中毒组与②组比较：△P<0.05,△△P<0.01
由表1可见，砷接触各组DNA慧星尾长高于对照组，砷中毒各组的DNA慧星尾长亦高于病区非病人，差异均有显著性(P<0.05,P<0.01)。各组尿砷及发砷与DNA慧星尾长呈明显的正相关关系(r尿=0.9261,r发=0.8578,P<0.01)。
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表2 砷接触者不同组别血细胞DNA断裂分级 组别
n
不同分组百分比(%)
0
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
对照组①
病区非病人②**
轻度砷中毒③**
中度砷中毒④**△
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重度砷中毒⑤**△△
41
19
40
54
62
61
25
9
3
3
37
63
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64
50
26
2
12
24
41
61
0
0
2
5
8
0
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0
1
1
2
注：rs=0.6012,P<0.005;H=83.29,P<0.001;各组与①比较：**P<0.01;中毒组与②比较：△P<0.05,△△P<0.01
表2可见，砷接触各组的DNA断裂分级与对照组比较，差异均有极显著性，中、重度中毒组与病区非病人比较，差异有显著性。
2.2 相关因素对砷中毒患者血细胞DNA损伤的影响 由表3可见，燃用高砷煤的患者其DNA慧星尾长均高于对照组，差异均有极显著性；吸烟与有氟斑牙的患者DNA慧星尾长分别显著高于不吸因及无氟斑牙患者；在年龄分层中随年龄的增加，DNA损伤加重，差异均有显著性。
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表3 相关因素对砷中毒患者血细胞DNA损伤的影响 相关因素
DNA慧星尾长(μm)
n±s
燃用高砷煤(年)
对照
1～①
11～②
41
52
104
8.55 ±4.13
, http://www.100md.com
27.90±13.20**
32.70±14.43**△
吸烟情况
不吸烟①
吸烟②
101
62
26.35±1.85
30.80±14.05△△
氟斑牙
无①
, http://www.100md.com 有②
57
118
25.92±13.98
31.38±14.63△△
年龄
17～①
31～②
41～③
33
55
68
20.28±10.74
, 百拇医药
30.76±11.74△
35.15±12.20△△
注：燃用砷煤组与对照组比较：**P<0.01；各相关因素中②或③组与①组比较：△P<0.05,△△P<0.01
3 讨论
砷是国际癌症研究中心(IARC)确定的人类皮肤和肺的致癌物[6]，但其致癌机理目前尚不清楚，且至今无动物实验的证据。鉴于突变与癌变密切相关，因此可通过测定砷的致突变性来探讨砷的致癌机理。有研究表明，砷可通过增加DNA复制中错误的可能性而引起染色体损伤。但在直接的致突变实验中，大多数实验未发现阳性结果，因此更多的实验把着眼点放在DNA损伤上。Fornace和胡国刚等采用碱洗脱法发现砷可引起小鼠成纤维细胞和人2BS细胞的DNA断裂[7，8]，Hartmann等采用SCGE方法以NaAsO2处理全血2小时，发现2×10-4～1.5×10-3mol/L即可引起DNA损伤，且呈剂量效应关系[9]。以上实验均为动物实验和体外实验，而砷在人体的作用是一个更为复杂的过程。因此研究燃煤型砷中毒患者的DNA损伤作用，对探讨地砷病的致癌机理有重要的理论意义。另外地方性砷中毒是一种以皮肤损害为主的全身性疾病，在临床表现为渐进性的发展过程，目前以皮肤角化、色素沉着或色斑、经久不愈溃疡等病征为主要诊断依据[2]，但我们在调查中发现，在以上病征出现之前，体内许多组织器官已受到了影响，如呼吸、循环、泌尿、神经系统等(另文报道)，因此寻找早期诊断指标对早发现、早防治，减少砷对人类的毒害作用有重要的现实意义。本研究结果表明，应用SCGE法可检测到砷致病区非病人的DNA损伤，从细胞分子水平看到了砷的早期危害。长期接触砷化合物能引起人体DNA断裂，且随人体尿砷、发砷含量的增高、中毒程度的加重而DAN损伤加重。砷致癌机理复杂，为了解相关因素的影响，进行了分层分析。结果发现燃用高砷煤时间越长，其DNA损伤越重。众所周知，吸烟可致肺癌发病率增高，亦是许多疾病的促发因素，我们的结果显示砷接触者的DNA断裂显著高于不吸烟组，提示吸烟可促进砷对DNA的损伤作用。性别年龄不同其机体生理、生化功能、代谢过程、酶系统等方面亦可能不同。在不同性别砷中毒患病率研究中，有男高于女和女高于男两种结果报道。我们的研究中未发现砷致DNA损伤存在性别差异。不同年龄分层可见，随着年龄的增加，DNA损伤亦越严重，其动态发展趋势与皮肤损害发展一致。
, 百拇医药
综上所述，砷可致人体血细胞DNA损伤，其发生早于临床表现，且与发砷、尿砷和皮肤损害的发展呈正相关关系。持续燃用高砷煤、吸烟和氟的综合影响可加重砷对DNA的损害。SCGE是一种检测DNA损伤的灵敏、简便和快速的方法，可作为一种早期、实用的方法应用于砷接触人群的DNA损伤监测。
(本研究得到孙 渝、杨光红、洪 峰等的帮助，得到贵州地病办秦少先、兴仁县政府、卫生局薛发佳及防疫站曾庆堂、邱锦林，黔西南州卫生防疫站周代兴等同志的支持，在此一并致谢)■
基金来源：国家自然科学基金(39660070)，贵州省自然科学基金资助项目
作者简介：张爱华，女，1955年生，教授，硕导
参考文献：
[1]周运书，周代兴，郑宝山，等.燃煤[型砷中毒20年不同环境下的流行病学调查[J].中国地方病学杂志，1998，17(1)：1-4.
, 百拇医药
[2]王连方.地方性砷中毒工作标准探讨[J].地方病通报，1994，9(1)：46-49.
[3]王连方，孙幸之，刘鸿德.掌跖角化等皮肤病变对诊断慢性地方性砷中毒的意义[J].新疆地方病防治研究通报，1983，2(1-2)：15-18.
[4]Singh NP MCCOY MT,Tice RR,et al.A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells[J].EXP Cell Res,1988,195-184.
[5]孟建峰，庄志雄，倪祖尧.单细胞凝胶电泳法测定溴化物对人血细胞的DNA损伤[J].中华劳动卫生职业病杂志，1997，15(6)：334-337.
[6]IARC.Monographs on the evaluation of carcinogenic rish of chemicals to men[J].Lyon:IARC,1990,23:48.
, http://www.100md.com
[7]Fornace AJJ,Little JB.DNA-protein cross-linking by chemical carcinoges in mammalian cells[J].Cancer Res,1979,39:704.
[8]胡国刚，董经堂，李申德，等.砷致癌机理研究[J].中国肿瘤，1994，3(9)：32-33.
[9]Hartmann JR.Mcwilliams RS,Kaplan JG,et al.Rapid detection of DNA stand breaks in human peripheral bloo cells and animal organs following treatment with physical and chemical agents[J].Prog Mutat Res,1982,3:137.
收稿日期：1999-02-25
修订日期：1999-08-10, http://www.100md.com
单位：张爱华(贵阳医学院 预防医学系，贵州，贵阳，550004)；黄晓欣(解放军第44医院，贵州，贵阳，550009)；李军(贵阳医学院 预防医学系，贵州，贵阳，550004)；蒋宪瑶(贵阳医学院 预防医学系，贵州，贵阳，550004)；杨朝林(贵阳医学院 预防医学系，贵州，贵阳，550004)
关键词：燃煤型砷中毒；单细胞凝胶电泳；DNA损伤
中国地方病学杂志000104 摘 要：目的 探讨砷中毒的致癌机理及寻找灵敏、实用的DNA损伤监测指标。方法 应用单细胞凝胶电泳法(SCGE)对贵州省兴仁县燃煤型砷中毒重病区175名砷接触者的血细胞DNA损伤进行了检测，并分析了相关因素的影响。结果 砷能引起人体血细胞DNA单链断裂，其损伤发生早于临床表现，并与尿砷、发砷呈正相关关系：与皮肤损害进展一致。吸烟和氟的影响可加重砷对DNA的损伤作用。结论 SCGE具有灵敏、快速、简便等优点，可作为一种早期、实用的方法应用于砷接触人群的DNA损伤监测。
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中图分类号：R599.9 文献标识码：A
文章编号：1000-4955(2000)01-0007-03
Detection of DNA damage in blood cells of the patients of
coal-burnt arsenism by SCGE
ZHANG Ai-hua,HUANG Xiao-xin,LI Jun,et al
(Dept.of Preventive Medicine,Guiyang Medical College,Guiyang 550004,China)
Abstract：Objective In order to research arseniasis's mechanism on causing poisoning,especially resulting in skin carcinoma and search sensitive,practical monitoring index of DNA damage.Methods Using single cell gel electrophoresis assay (SCGE),the DNA damage in blood cells of 175 arsenic contacts was detected in Xingren County,Guizhou Province,where there was serious arsenism caused by burning coal,and the effects of related factors were analyzed too.Results Arsenic could induce DNA single strand breaks in human blood cells,which might happen before the occurrence of clinical manifestations.The DNA damage caused by arsenic had a positive correlation with the amount of arsenic in urine or hair,and coincided with the development of the pathological changes of skin.Cigarette smoking and fluorine might aggravate the arsenic-induced DNA damage. Conclusions It is suggested the SCGE can be used as a sensitive、rapid、handy、practical and early-stage monitoring method to detect DNA damage in the population exposed to arsenic.
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Key words：SCGE;Arsenism caused by burning coal;DNA damage▲
燃煤型砷中毒是特定地区居民因长期燃用高砷煤致空气、食品污染而引起的以皮肤损害为主的慢性全身性疾病，已在贵州省构成严重危害。尽管经过20年的改灶、改水和治疗病人等综合防治，取得一定成效，但新发病人仍不断出现，病情继续发展以及肝硬化腹水和皮肤癌逐渐增多[1]。为了探讨砷中毒的致癌机理及寻找灵敏、实用的早期监测指标，我们在以往研究工作基础上，采用单细胞凝胶电泳(SCGE)方法对贵州省兴仁县交乐病区砷接触者的血细胞DNA损伤进行检测，并分析相关因素的影响。
1 材料与方法
1.1 调查点及对象的选择 选择贵州省燃煤型砷中毒重病区交乐乡为调查点，参考1991年省地病办确诊之病人，并重新复查确定调查对象175例[2]，根据临床皮肤病变分度标准[3]分为轻度、中度、重度砷中毒3组，该病区临床常规检查无异常者为病区非病人，选择病区12公里以外非燃用高砷煤村民41例为对照，排除有家族遗传史、吸烟史、半年内X线接触史及近期病毒感染者。
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1.2 SCGE方法[4，5]
1.2.1 主要试剂和仪器：低熔点琼脂糖(LMA)、溴化乙锭(EB)(Sigma)，正常熔点琼脂糖(NMA)(杭州微生物试剂厂，AR)；Triton X-100(Merck);DMSO(Farco);DYY-III-7B型转移电泳仪(北京六一仪器厂)；BH-REL-W型荧光显微镜(Nikon)。
1.2.2 SCGE试验流程：取砷中毒患者全血铺片→裂解细胞→解旋→电泳→EB染色→镜检。镜检以100瓦汞灯作为荧光光源，放大倍数为400倍，并以ISO400黑白135胶卷同步照像。在荧光显微镜下，未受损细胞表现为一圆形荧光核心，即慧星头部，无尾(图1)。而受损细胞则为断片离头向阳极方向迁移，形成慧星样的尾(图2，图3)。在电压、电流及其它条件一致时，其拖尾的长度与DNA损伤程度成正比。本实验选用DNA慧星尾长和DNA断裂分级两种观察指标。DNA断裂分级按慧星尾部占全部DNA量的比例判断：0级：<5%;Ⅰ级：5%～19%;Ⅱ级:20%～39%;Ⅲ级:40%～49%;Ⅳ级:>95%。每片随机观察100个细胞，计数各级所占比例。DNA慧星尾长用目镜测微尺在高倍镜下测出“慧头”中心到“慧尾”的长度，每处随机观察30个细胞，计算均值和标准差。
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1.3 数据统计与分析 用PEMS统计软件处理。慧星尾长的比较采用单因素分析，t、t′检验，并与发砷、尿砷进行积差相关分析。断裂分级进行Spearman等级相关分析和检验。
2 结果
2.1 不同组别砷接触者尿砷、发砷及DNA损伤的测定结果 见表1，表2。
表1 不同组别砷接触者尿砷、发砷及血细胞DNA慧星尾长 组别
尿砷(μg/L)
发砷(mg/kg)
DNA慧星尾长(μm)
n
(
±s), 百拇医药
n
(
±s)n
(
±s)对照组①病区非病人②
轻度砷中毒③
中度砷中毒④
重度砷中毒⑤
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45.62 ±15.71
76.29 ±40.75**
121.14±110.28**△
140.15±135.52**△
145.18±128.53**△
45
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1.55±1.16
5.38±4.90**
6.72±6.11**
7.48±6.97**
7.92±7.79**
41
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8.55 ±4.13
13.84±8.78*
19.53±6.71**△
30.06±12.64**△△
38.16±14.42**△△
注：各组与对照组比较：*P<0.05,**P<0.01;中毒组与②组比较：△P<0.05,△△P<0.01
由表1可见，砷接触各组DNA慧星尾长高于对照组，砷中毒各组的DNA慧星尾长亦高于病区非病人，差异均有显著性(P<0.05,P<0.01)。各组尿砷及发砷与DNA慧星尾长呈明显的正相关关系(r尿=0.9261,r发=0.8578,P<0.01)。
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表2 砷接触者不同组别血细胞DNA断裂分级 组别
n
不同分组百分比(%)
0
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
对照组①
病区非病人②**
轻度砷中毒③**
中度砷中毒④**△
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重度砷中毒⑤**△△
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注：rs=0.6012,P<0.005;H=83.29,P<0.001;各组与①比较：**P<0.01;中毒组与②比较：△P<0.05,△△P<0.01
表2可见，砷接触各组的DNA断裂分级与对照组比较，差异均有极显著性，中、重度中毒组与病区非病人比较，差异有显著性。
2.2 相关因素对砷中毒患者血细胞DNA损伤的影响 由表3可见，燃用高砷煤的患者其DNA慧星尾长均高于对照组，差异均有极显著性；吸烟与有氟斑牙的患者DNA慧星尾长分别显著高于不吸因及无氟斑牙患者；在年龄分层中随年龄的增加，DNA损伤加重，差异均有显著性。
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表3 相关因素对砷中毒患者血细胞DNA损伤的影响 相关因素
DNA慧星尾长(μm)
n
±s燃用高砷煤(年)
对照
1～①
11～②
41
52
104
8.55 ±4.13
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27.90±13.20**
32.70±14.43**△
吸烟情况
不吸烟①
吸烟②
101
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30.80±14.05△△
氟斑牙
无①
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25.92±13.98
31.38±14.63△△
年龄
17～①
31～②
41～③
33
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20.28±10.74
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30.76±11.74△
35.15±12.20△△
注：燃用砷煤组与对照组比较：**P<0.01；各相关因素中②或③组与①组比较：△P<0.05,△△P<0.01
3 讨论
砷是国际癌症研究中心(IARC)确定的人类皮肤和肺的致癌物[6]，但其致癌机理目前尚不清楚，且至今无动物实验的证据。鉴于突变与癌变密切相关，因此可通过测定砷的致突变性来探讨砷的致癌机理。有研究表明，砷可通过增加DNA复制中错误的可能性而引起染色体损伤。但在直接的致突变实验中，大多数实验未发现阳性结果，因此更多的实验把着眼点放在DNA损伤上。Fornace和胡国刚等采用碱洗脱法发现砷可引起小鼠成纤维细胞和人2BS细胞的DNA断裂[7，8]，Hartmann等采用SCGE方法以NaAsO2处理全血2小时，发现2×10-4～1.5×10-3mol/L即可引起DNA损伤，且呈剂量效应关系[9]。以上实验均为动物实验和体外实验，而砷在人体的作用是一个更为复杂的过程。因此研究燃煤型砷中毒患者的DNA损伤作用，对探讨地砷病的致癌机理有重要的理论意义。另外地方性砷中毒是一种以皮肤损害为主的全身性疾病，在临床表现为渐进性的发展过程，目前以皮肤角化、色素沉着或色斑、经久不愈溃疡等病征为主要诊断依据[2]，但我们在调查中发现，在以上病征出现之前，体内许多组织器官已受到了影响，如呼吸、循环、泌尿、神经系统等(另文报道)，因此寻找早期诊断指标对早发现、早防治，减少砷对人类的毒害作用有重要的现实意义。本研究结果表明，应用SCGE法可检测到砷致病区非病人的DNA损伤，从细胞分子水平看到了砷的早期危害。长期接触砷化合物能引起人体DNA断裂，且随人体尿砷、发砷含量的增高、中毒程度的加重而DAN损伤加重。砷致癌机理复杂，为了解相关因素的影响，进行了分层分析。结果发现燃用高砷煤时间越长，其DNA损伤越重。众所周知，吸烟可致肺癌发病率增高，亦是许多疾病的促发因素，我们的结果显示砷接触者的DNA断裂显著高于不吸烟组，提示吸烟可促进砷对DNA的损伤作用。性别年龄不同其机体生理、生化功能、代谢过程、酶系统等方面亦可能不同。在不同性别砷中毒患病率研究中，有男高于女和女高于男两种结果报道。我们的研究中未发现砷致DNA损伤存在性别差异。不同年龄分层可见，随着年龄的增加，DNA损伤亦越严重，其动态发展趋势与皮肤损害发展一致。
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综上所述，砷可致人体血细胞DNA损伤，其发生早于临床表现，且与发砷、尿砷和皮肤损害的发展呈正相关关系。持续燃用高砷煤、吸烟和氟的综合影响可加重砷对DNA的损害。SCGE是一种检测DNA损伤的灵敏、简便和快速的方法，可作为一种早期、实用的方法应用于砷接触人群的DNA损伤监测。
(本研究得到孙 渝、杨光红、洪 峰等的帮助，得到贵州地病办秦少先、兴仁县政府、卫生局薛发佳及防疫站曾庆堂、邱锦林，黔西南州卫生防疫站周代兴等同志的支持，在此一并致谢)■
基金来源：国家自然科学基金(39660070)，贵州省自然科学基金资助项目
作者简介：张爱华，女，1955年生，教授，硕导
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收稿日期：1999-02-25
修订日期：1999-08-10, http://www.100md.com