血小板衍化内皮细胞生长因子在肝癌中的表达及干预治疗
作者：周俭 汤钊猷 樊嘉 吴志全 纪元 鲍卫华 王鲁 叶胜龙
单位：上海医科大学肝癌研究所 上海医科大学附属中山医院200032
关键词：癌；肝细胞；内皮生长因子；药物疗法
中华医学杂志001109
【摘要】 目的 了解血小板衍化内皮细胞生长因子(PD-ECGF)在肝癌中的表达，探讨与其相关的卡培他滨(capecitabine，CAP)治疗对肝癌生长和转移的作用。方法 用免疫组织化学法检测61例肝细胞癌(HCC)患者肝组织中PD-ECGF蛋白水平。应用Northern Blot 法对其中28例HCC组织中PD-ECGF mRNA 水平作相对定量分析。用24只裸鼠人肝癌高转移模型LCI-D20，于肿瘤种植后第3天分别采用不同剂量CAP治疗。停药后第3天处死裸鼠，测量肿瘤的长短径，并用HE染色检测肺转移。结果 61例HCC和癌周组织中PD-ECGF蛋白表达阳性率分别为70.5%和47.5%，37例高TNM分期组(Ⅲ期和Ⅳ期)HCC组织中PD-ECGF蛋白表达阳性率(81.1%)明显高于24例低TNM分期组(Ⅰ期和Ⅱ期)表达率(54.2%)，两者差异有显著意义(P<0.05)。Northern Blot分析，HCC组织的PD-ECGF蛋白水平表达与其相应mRNA水平变化一致。CAP 2.10 mmol.kg-1.day-1和3.15 mmol.kg-1.day-1治疗组裸鼠肝癌体积(240 mm3±119 mm3和209 mm3±150 mm3)明显小于对照组(447 mm3±159 mm3)(P<0.05)。裸鼠肺转移率随CAP剂量的增加而下降(P<0.05)。结论 PD-ECGF在HCC组织中高表达，与肝癌TNM分期相关。CAP能抑制HCC的生长和转移。
, 百拇医药
The expression of platelet-derived endothelial cell growth factor in liver cancer
ZHOU Jian TANG Zhaoyou FAN Jia
(Liver Cancer Institute, Zhongshan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China)
【Abstract】 Objective To investigate the expression of platelet-derived endothelial cell growth factor (PD-ECGF) in liver cancer and explore its related intervention with Capecitabine for the growth and metastasis of liver cancer. Methods The protein level of PD-ECGF was determined using immunohistochemical method in 61 HCC samples and the mRNA level was detected using Northern blot analysis. Capecitabine was administered orally in 24 nude mice bearing LCI-D20 tumor. All treatments lasted 3 weeks. The tumor size was calculated by the following formula: V=a×b2×0.5. Lung metastasis was evaluated by HE staining in lung samples. Results The PD-ECGF expression rate in 61 HCC and paratumoral liver tissues was 70.5% and 47.5%, respectively. The rate was higher in HCC tissues with advanced TNM stage than in those with early TNM stage (81.1% vs 54.2%, P<0.05). The mRNA level of PD-ECGF was related well to its protein expression. The tumor size on day 3 after last treatment measured in the control, and low dose (1.05 mmol.kg-1.day-1), moderate dose (2.10 mmol.kg-1.day-1) and high dose (3.15 mmol.kg-1.day-1) of Capecitabine treatment groups was 447 mm3±159 mm3, 414 mm3±97 mm3, 240 mm3±119 mm3 and 209 mm3±150 mm3, respectively. High doses of Capecitabine increased the inhibitory effect on the growth and lung metastasis of HCC implant. Conclusion PD-ECGF is highly expressed in HCC and correlates with the TNM staging. Capecitabine may inhibit the growth and metastasis of HCC.
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【Key words】 Carcinoma, hepatocellular； Endothelial growth factor； Drug therapy
血小板衍化内皮细胞生长因子(platelet-derived endothelial cell growth factor, PD-ECGF)是肿瘤血管研究领域相对较新的一个血管生长因子，已证明PD-ECGF与胸苷磷酸化酶是同一物质。卡培他滨(capecitabine，CAP)是一种新的5-氟尿嘧啶(5-FU)前体药物，在体内需经PD-ECGF/胸苷磷酸化酶等代谢为5-FU才能发挥肿瘤选择性抗癌作用。LCI-D20是上海医科大学肝癌研究所建立的高转移潜能人肝癌裸鼠模型[1]。本实验旨在研究PD-ECGF在肝癌中的表达，以及Capecitabine对原位种植的LCI-D20肝癌生长和转移中的作用。
对象和方法
, 百拇医药 1.病例和组织标本：选取我所1998年3月至1999年6月手术切除并经病理证实的肝细胞癌(HCC)患者61例。按1997年国际抗癌联盟TNM分期标准[2]，61例患者中，Ⅰ、Ⅱ期(低分期组)共24例，Ⅲ、Ⅳ期(高分期组)共37例。两组在年龄、性别、乙肝表面抗原阳性率、甲胎蛋白(AFP)、肝硬化程度、肿瘤大小上差异无显著意义。其中，有28例患者肿瘤及癌周正常肝组织切除后立即投入液氮，-80℃保存备用。
2.动物模型和药物：5周龄雄性Balb/C nu/nu裸鼠购自中国科学院上海药物研究所。肿瘤源于第89代LCI-D20原位肝种植瘤。24只LCI-D20原位肝种植瘤裸鼠分为4组，每组6只。肝肿瘤接种后第3天开始经口灌胃治疗。每周一、二、三、四、五各一次，连续3周。CAP溶于50 g/L阿拉伯胶糖中制成混悬液，3个CAP治疗组剂量分别为1.05 mmol.kg-1.d-1、2.10 mmol.kg-1.d-1和3.15 mmol.kg-1.d-1。对照组用50 g/L阿拉伯胶糖灌胃。裸鼠停止用药后第3天，测量体重，摘眼球放血处死，血置入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，作血常规检查，再离心后取血清检测肝功能。打开裸鼠腹腔，测量肝肿瘤长短径，肿瘤体积为长径×短径2×0.5。切除肝肿瘤和肺组织制成蜡块备用。肺蜡块于不同平面切片20张作HE染色，检查肿瘤肺转移情况。
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3.PD-ECGF免疫组织化学染色：取患者手术切除附有癌周的肝癌蜡块以及裸鼠肝肿瘤蜡块。切片厚度为4 μm。采用免疫组织化学EnVisionTM法，抗PD-ECGF单克隆抗体购自美国Oncogene公司(工作浓度1∶150)。主要步骤如下：切片常规脱蜡，置0.01 mmol/L枸橼酸钠溶液(pH 6.0)中用微波炉处理5 min 2次；加入一抗，湿盒中过夜；加EnVisionTM工作液室温孵育30 min；重氮氨基苯(DAB)显色，苏木素复染，透明，封片。以三乙醇胺缓冲盐水溶液(TBS)替代一抗作为空白对照。PD-ECGF表达阳性和阴性根据细胞染色强度和染色细胞所占面积两者积分之和来判断。染色强度积分为：不染色=0，轻度染色=1，中度染色=2，强染色=3；染色面积积分为：无细胞染色=0，<25%细胞染色=1，25%到50%细胞染色=2， >50%细胞染色=3。若两种积分之和>2，则为PD-ECGF表达阳性，≤2则为表达阴性[3]。
4.Northern Blot 分析法： 含PD-ECGF cDNA的pL8质粒(瑞典Ludwig癌症研究所Heldin博士惠赠)，用EcoRⅠ酶切得1.8 kb的PD-ECGF cDNA。用PD-ECGF cDNA和内标磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)cDNA(1.3 kb，上海医科大学生化教研室刘飞博士惠赠)按随机引物标记试剂盒(美国Promega公司)使用说明书进行探针标记。细胞总RNA的提取按Trizol(美国GIBCO公司)试剂所附方法操作。将30 μg的RNA样品经10 g/L琼脂糖甲醛变性凝胶(含10 g/L琼脂糖，60 g/L甲醛，1×3-吗啉基丙磺酸MOPS缓冲液)电泳4 h左右，将电泳后的凝胶浸泡于20×标准枸橼酸盐水SSC(pH 7.4, 3 mol/L NaCl, 0.3 mol/L 柠檬酸三钠)15 min×2次，按毛细管转移方法将RNA转移至Hybond-N+膜(英国Amersham公司)上约20 h，转移结束后，将膜用6×SSC浸泡5 min,以除去膜上的凝胶碎片。取出膜，1 200 KJ交联1 min。加20～30 ml的预杂交液(pH 7.2，0.2 mol/L磷酸钠缓冲液，10 g/L牛血清白蛋白BSA，70 g/L十二烷基硫酸钠(SDS)，1 mmol/L EDTA,150 g/L甲酰胺)，65℃预杂交4～6 h。弃预杂交液，另加入标记探针和10 μl 0.1 mol/L EDTA，再加预杂交液5 ml，65℃杂交16～20 h。弃杂交液，加人100 ml左右的洗膜液(40 mmol/L 磷酸钠缓冲液，10 g/L SDS，1 mmol/L EDTA),65℃洗膜30 min重复3～5次。压片曝光、显影、定影。用扫描仪测定mRNA表达的光密度值。将PD-ECGF mRNA光密度值与内标GAPDH光密度值的比值分别作为二者表达水平的参数。若比值<最高比值的10%视为表达阴性[4]。
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5.统计学处理：ANOVA方差分析，Dunnett t检验，卡方检验和趋势卡方检验。
结果
1.免疫组织化学染色分析：大部分HCC细胞和部分正常肝细胞显示PD-ECGF染色，染色主要在细胞浆和细胞核内。61例HCC和癌周组织中PD-ECGF蛋白表达阳性率分别为70.5%和47.5%(图1)，37例TNM高分期组HCC组织中PD-ECGF蛋白表达阳性率(81.1%)明显高于24例低分期组表达率(54.2%)，两者差异有显著意义(χ2=5.07,P=0.024<0.05), 如图2所示， PD-ECGF在HCC组织和门静脉癌栓组织中(属TNM Ⅳ期)高表达。2.10 mmol.kg-1.d-1和3.15 mmol.kg-1.d-1 CAP治疗组治疗后裸鼠肝癌PD-ECGF染色强度明显低于1.05 mmol.kg-1.d-1组和对照组。
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2.Northern Blot分析：PD-ECGF mRNA表达在1.8kb位置。在HCC和癌周肝组织中的表达率分别为67.8%和35.7%。18例TNM高分期组HCC组织中PD-ECGF mRNA表达水平(0.83±0.55)明显高于10例低分期组者(0.38±0.32)，两者差异有显著意义(t值＝2.330, P=0.028)。HCC组织蛋白水平表达与其相应Northern Blot分析mRNA水平变化一致。
图1 PD-ECGF在HCC(右侧)和癌周肝组织(左侧)中的表达 免疫组织化学染色×100 图2 PD-ECGF在HCC(右下角)及其门静脉癌栓组织(左侧)中的表达 免疫组织化学染色×100
3.CAP对裸鼠肝肿瘤生长和转移的作用：如表1所示，方差分析CAP对肝肿瘤有明显抑制作用(F=4.865, P=0.011)。Dunnett t检验进一步分析，只有 2.10 mmol.kg-1.d-1和3.15 mmol.kg-1.d-1 CAP治疗组中肝肿瘤体积与对照组肝肿瘤体积有明显差别，P值分别为0.037和0.016，而1.05 mmol.kg-1.d-1组体积与对照组比较，差异无显著意义，P=0.953。用趋势卡方分析，CAP随着剂量的加大，肺转移率降低(χ2趋势=20.007，P<0.001)。裸鼠治疗后，各组检测血常规和肝功能及大便隐血试验均在正常范围。但3.15 mmol.kg-1.d-1CAP治疗组裸鼠体重明显下降(<80%治疗前裸鼠体重)，而其它各组无明显变化。
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表1 Capecitabine对原位种植肝癌生长及转移的抑制作用 组别
鼠数
肝种植瘤体积
mm3(
±s)
肺转移数
对照组
6
447±159
6
1.05mmol.kg-1.d-1组
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6
414± 97
4
2.10mmol.kg-1.d-1组
6
240±119
1
3.15mmol.kg-1.d-1组
6
209±150
0
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讨论 新生肿瘤血管是肿瘤获取代谢营养的基础，也是肿瘤细胞迁移游走形成转移的必经之路。肿瘤或宿主细胞产生许多可溶性血管生长因子，促进血管内皮细胞增殖和血管形成。PD-ECGF是一种致内皮细胞分裂原。1987年首次从血小板中分离出来，以后发现具有促进内皮细胞趋化活性并能促进新生血管生成。它与胸苷磷酸化酶同源，具有胸苷磷酸酶的活性[5]，现在许多学者把两者当作同一名词可互换使用。已发现PD-ECGF在人类肿瘤组织中水平升高，如乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌、子宫癌、宫颈癌、肾癌、甲状腺癌、和结直肠癌等[6]。与乳腺癌、宫颈癌、食管癌、结肠癌和胃癌组织中微血管密度密切相关，是肿瘤血管形成和维持的重要因子之一[7，8]。本研究结果显示，PD-ECGF在肝癌组织中表达率达67.8%～70.5%，高于癌周正常肝组织，且在TNM高分期组肝癌中表达高于TNM低分期组中表达，说明PD-ECGF可能与肝癌生长和侵袭转移中的血管形成有关。
CAP是一种新的肿瘤选择性化疗药物，1998年4月获得美国FDA认证进入临床。它需在体内经三个步骤，最终变为5-FU发挥抑制肿瘤的作用，即CAP首先经肝内羧基酯酶转变为5′-脱氧-氟胞苷，再经肝和肿瘤组织内活性高的胞苷脱氨基酶转变为5′-脱氧-氟尿苷(商品名：氟铁龙)，最后经PD-ECGF/胸苷磷酸化酶转变为5-FU，由于肝脏组织内羧基酯酶和胞苷脱氨基酶含量高，PD-ECGF/胸苷磷酸化酶在肿瘤组织中的表达水平高于正常组织，故CAP和氟铁龙选择性的在肿瘤组织中转化为5-FU发挥化疗作用[9]。有研究显示，口服CAP治疗在肿瘤内产生的5-FU浓度是血浆和肌肉中的127倍和22倍，而5-氟尿嘧啶治疗在肿瘤、血浆和肌肉中的5-FU浓度却无差异，也即无肿瘤选择性[10]。
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本研究结果显示，HCC 组织内无论PD-ECGF/胸苷磷酸化酶蛋白水平，还是mRNA水平均高于癌周正常肝组织，特别是TNM高分期HCC组织中表达更高，提示CAP在HCC组织内特别是高TNM分期者产生的5-FU浓度可高于癌周正常肝组织。LCID 20裸鼠口服2.10 mmol.kg-1.day-1和3.15 mmol.kg-1.day-1 CAP治疗后肝肿瘤体积明显低于对照组肝肿瘤体积，治疗后肝功能、血常规无影响，大便隐血检查亦无异常，且CAP能抑制裸鼠的肺转移，说明CAP治疗肝癌安全有效，另外也说明CAP确实能选择性在肝癌组织内转化为5-FU发挥抑癌作用。3.15 mmol.kg-1.day-1 CAP治疗组中裸鼠体重明显下降，而其它各组无变化，说明适当剂量是CAP治疗的关键之一。治疗后裸鼠肝癌PD-ECGF染色强度降低，可能与肝癌细胞受到抑制后肿瘤组织产生PD-ECGF亦相应降低有关。国外也有报道，氟铁龙和Tegafur治疗后肿瘤组织中的PD-ECGF水平下降[11]。
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根据本实验可得出以下结论，PD-ECGF在肝癌中高表达并与肝癌TNM分期相关。CAP治疗能抑制肝癌的生长和转移，为CAP进一步用于肝癌特别是高TNM分期(如伴有门静脉癌栓)肝癌患者打下实验基础。
基金项目：上海市百人计划基金(97BR029)，上海市科技发展基金(984419067)和美国中华医学基金(93-583)资助项目
参考文献
1，Sun FX, Tang ZY, Liu KD, et al. Establishment of a metastatic model of human hepatocellular carcinoma in nude mice via orthotopic implantation of histologically intact tissues. Int J Cancer, 1996,66:239-243.
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, 百拇医药 7，Matsushita S, Nitanda T, Furukawa T, et al. The effect of a thymidine phosphorylase inhibitor on angiogenesis and apoptosis in tumors. Cancer Res, 1999,59:1911-1916.
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10，Ishikawa T, Utoh M, Sawada N,et al. Tumor selective delivery of 5-fluorouracil by capecitabine, a new oral fluoropyrimidine carbamate, in human cancer xenografts. Biochem Pharmacol, 1998,55:1091-1097.
11，Maeda K, Chung YS, Ogawa Y, et al. Thymidine phosphorylase/platelet-derived endothellial cell growth factor expression associated with hepatic metastasis in gastric carcinoma. Br J Cancer, 1996,73:884-888.
(收稿日期：1999-12-17), http://www.100md.com
单位：上海医科大学肝癌研究所 上海医科大学附属中山医院200032
关键词：癌；肝细胞；内皮生长因子；药物疗法
中华医学杂志001109
【摘要】 目的 了解血小板衍化内皮细胞生长因子(PD-ECGF)在肝癌中的表达，探讨与其相关的卡培他滨(capecitabine，CAP)治疗对肝癌生长和转移的作用。方法 用免疫组织化学法检测61例肝细胞癌(HCC)患者肝组织中PD-ECGF蛋白水平。应用Northern Blot 法对其中28例HCC组织中PD-ECGF mRNA 水平作相对定量分析。用24只裸鼠人肝癌高转移模型LCI-D20，于肿瘤种植后第3天分别采用不同剂量CAP治疗。停药后第3天处死裸鼠，测量肿瘤的长短径，并用HE染色检测肺转移。结果 61例HCC和癌周组织中PD-ECGF蛋白表达阳性率分别为70.5%和47.5%，37例高TNM分期组(Ⅲ期和Ⅳ期)HCC组织中PD-ECGF蛋白表达阳性率(81.1%)明显高于24例低TNM分期组(Ⅰ期和Ⅱ期)表达率(54.2%)，两者差异有显著意义(P<0.05)。Northern Blot分析，HCC组织的PD-ECGF蛋白水平表达与其相应mRNA水平变化一致。CAP 2.10 mmol.kg-1.day-1和3.15 mmol.kg-1.day-1治疗组裸鼠肝癌体积(240 mm3±119 mm3和209 mm3±150 mm3)明显小于对照组(447 mm3±159 mm3)(P<0.05)。裸鼠肺转移率随CAP剂量的增加而下降(P<0.05)。结论 PD-ECGF在HCC组织中高表达，与肝癌TNM分期相关。CAP能抑制HCC的生长和转移。
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The expression of platelet-derived endothelial cell growth factor in liver cancer
ZHOU Jian TANG Zhaoyou FAN Jia
(Liver Cancer Institute, Zhongshan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China)
【Abstract】 Objective To investigate the expression of platelet-derived endothelial cell growth factor (PD-ECGF) in liver cancer and explore its related intervention with Capecitabine for the growth and metastasis of liver cancer. Methods The protein level of PD-ECGF was determined using immunohistochemical method in 61 HCC samples and the mRNA level was detected using Northern blot analysis. Capecitabine was administered orally in 24 nude mice bearing LCI-D20 tumor. All treatments lasted 3 weeks. The tumor size was calculated by the following formula: V=a×b2×0.5. Lung metastasis was evaluated by HE staining in lung samples. Results The PD-ECGF expression rate in 61 HCC and paratumoral liver tissues was 70.5% and 47.5%, respectively. The rate was higher in HCC tissues with advanced TNM stage than in those with early TNM stage (81.1% vs 54.2%, P<0.05). The mRNA level of PD-ECGF was related well to its protein expression. The tumor size on day 3 after last treatment measured in the control, and low dose (1.05 mmol.kg-1.day-1), moderate dose (2.10 mmol.kg-1.day-1) and high dose (3.15 mmol.kg-1.day-1) of Capecitabine treatment groups was 447 mm3±159 mm3, 414 mm3±97 mm3, 240 mm3±119 mm3 and 209 mm3±150 mm3, respectively. High doses of Capecitabine increased the inhibitory effect on the growth and lung metastasis of HCC implant. Conclusion PD-ECGF is highly expressed in HCC and correlates with the TNM staging. Capecitabine may inhibit the growth and metastasis of HCC.
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【Key words】 Carcinoma, hepatocellular； Endothelial growth factor； Drug therapy
血小板衍化内皮细胞生长因子(platelet-derived endothelial cell growth factor, PD-ECGF)是肿瘤血管研究领域相对较新的一个血管生长因子，已证明PD-ECGF与胸苷磷酸化酶是同一物质。卡培他滨(capecitabine，CAP)是一种新的5-氟尿嘧啶(5-FU)前体药物，在体内需经PD-ECGF/胸苷磷酸化酶等代谢为5-FU才能发挥肿瘤选择性抗癌作用。LCI-D20是上海医科大学肝癌研究所建立的高转移潜能人肝癌裸鼠模型[1]。本实验旨在研究PD-ECGF在肝癌中的表达，以及Capecitabine对原位种植的LCI-D20肝癌生长和转移中的作用。
对象和方法
, 百拇医药 1.病例和组织标本：选取我所1998年3月至1999年6月手术切除并经病理证实的肝细胞癌(HCC)患者61例。按1997年国际抗癌联盟TNM分期标准[2]，61例患者中，Ⅰ、Ⅱ期(低分期组)共24例，Ⅲ、Ⅳ期(高分期组)共37例。两组在年龄、性别、乙肝表面抗原阳性率、甲胎蛋白(AFP)、肝硬化程度、肿瘤大小上差异无显著意义。其中，有28例患者肿瘤及癌周正常肝组织切除后立即投入液氮，-80℃保存备用。
2.动物模型和药物：5周龄雄性Balb/C nu/nu裸鼠购自中国科学院上海药物研究所。肿瘤源于第89代LCI-D20原位肝种植瘤。24只LCI-D20原位肝种植瘤裸鼠分为4组，每组6只。肝肿瘤接种后第3天开始经口灌胃治疗。每周一、二、三、四、五各一次，连续3周。CAP溶于50 g/L阿拉伯胶糖中制成混悬液，3个CAP治疗组剂量分别为1.05 mmol.kg-1.d-1、2.10 mmol.kg-1.d-1和3.15 mmol.kg-1.d-1。对照组用50 g/L阿拉伯胶糖灌胃。裸鼠停止用药后第3天，测量体重，摘眼球放血处死，血置入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，作血常规检查，再离心后取血清检测肝功能。打开裸鼠腹腔，测量肝肿瘤长短径，肿瘤体积为长径×短径2×0.5。切除肝肿瘤和肺组织制成蜡块备用。肺蜡块于不同平面切片20张作HE染色，检查肿瘤肺转移情况。
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3.PD-ECGF免疫组织化学染色：取患者手术切除附有癌周的肝癌蜡块以及裸鼠肝肿瘤蜡块。切片厚度为4 μm。采用免疫组织化学EnVisionTM法，抗PD-ECGF单克隆抗体购自美国Oncogene公司(工作浓度1∶150)。主要步骤如下：切片常规脱蜡，置0.01 mmol/L枸橼酸钠溶液(pH 6.0)中用微波炉处理5 min 2次；加入一抗，湿盒中过夜；加EnVisionTM工作液室温孵育30 min；重氮氨基苯(DAB)显色，苏木素复染，透明，封片。以三乙醇胺缓冲盐水溶液(TBS)替代一抗作为空白对照。PD-ECGF表达阳性和阴性根据细胞染色强度和染色细胞所占面积两者积分之和来判断。染色强度积分为：不染色=0，轻度染色=1，中度染色=2，强染色=3；染色面积积分为：无细胞染色=0，<25%细胞染色=1，25%到50%细胞染色=2， >50%细胞染色=3。若两种积分之和>2，则为PD-ECGF表达阳性，≤2则为表达阴性[3]。
4.Northern Blot 分析法： 含PD-ECGF cDNA的pL8质粒(瑞典Ludwig癌症研究所Heldin博士惠赠)，用EcoRⅠ酶切得1.8 kb的PD-ECGF cDNA。用PD-ECGF cDNA和内标磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)cDNA(1.3 kb，上海医科大学生化教研室刘飞博士惠赠)按随机引物标记试剂盒(美国Promega公司)使用说明书进行探针标记。细胞总RNA的提取按Trizol(美国GIBCO公司)试剂所附方法操作。将30 μg的RNA样品经10 g/L琼脂糖甲醛变性凝胶(含10 g/L琼脂糖，60 g/L甲醛，1×3-吗啉基丙磺酸MOPS缓冲液)电泳4 h左右，将电泳后的凝胶浸泡于20×标准枸橼酸盐水SSC(pH 7.4, 3 mol/L NaCl, 0.3 mol/L 柠檬酸三钠)15 min×2次，按毛细管转移方法将RNA转移至Hybond-N+膜(英国Amersham公司)上约20 h，转移结束后，将膜用6×SSC浸泡5 min,以除去膜上的凝胶碎片。取出膜，1 200 KJ交联1 min。加20～30 ml的预杂交液(pH 7.2，0.2 mol/L磷酸钠缓冲液，10 g/L牛血清白蛋白BSA，70 g/L十二烷基硫酸钠(SDS)，1 mmol/L EDTA,150 g/L甲酰胺)，65℃预杂交4～6 h。弃预杂交液，另加入标记探针和10 μl 0.1 mol/L EDTA，再加预杂交液5 ml，65℃杂交16～20 h。弃杂交液，加人100 ml左右的洗膜液(40 mmol/L 磷酸钠缓冲液，10 g/L SDS，1 mmol/L EDTA),65℃洗膜30 min重复3～5次。压片曝光、显影、定影。用扫描仪测定mRNA表达的光密度值。将PD-ECGF mRNA光密度值与内标GAPDH光密度值的比值分别作为二者表达水平的参数。若比值<最高比值的10%视为表达阴性[4]。
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5.统计学处理：ANOVA方差分析，Dunnett t检验，卡方检验和趋势卡方检验。
结果
1.免疫组织化学染色分析：大部分HCC细胞和部分正常肝细胞显示PD-ECGF染色，染色主要在细胞浆和细胞核内。61例HCC和癌周组织中PD-ECGF蛋白表达阳性率分别为70.5%和47.5%(图1)，37例TNM高分期组HCC组织中PD-ECGF蛋白表达阳性率(81.1%)明显高于24例低分期组表达率(54.2%)，两者差异有显著意义(χ2=5.07,P=0.024<0.05), 如图2所示， PD-ECGF在HCC组织和门静脉癌栓组织中(属TNM Ⅳ期)高表达。2.10 mmol.kg-1.d-1和3.15 mmol.kg-1.d-1 CAP治疗组治疗后裸鼠肝癌PD-ECGF染色强度明显低于1.05 mmol.kg-1.d-1组和对照组。
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2.Northern Blot分析：PD-ECGF mRNA表达在1.8kb位置。在HCC和癌周肝组织中的表达率分别为67.8%和35.7%。18例TNM高分期组HCC组织中PD-ECGF mRNA表达水平(0.83±0.55)明显高于10例低分期组者(0.38±0.32)，两者差异有显著意义(t值＝2.330, P=0.028)。HCC组织蛋白水平表达与其相应Northern Blot分析mRNA水平变化一致。
图1 PD-ECGF在HCC(右侧)和癌周肝组织(左侧)中的表达 免疫组织化学染色×100 图2 PD-ECGF在HCC(右下角)及其门静脉癌栓组织(左侧)中的表达 免疫组织化学染色×100
3.CAP对裸鼠肝肿瘤生长和转移的作用：如表1所示，方差分析CAP对肝肿瘤有明显抑制作用(F=4.865, P=0.011)。Dunnett t检验进一步分析，只有 2.10 mmol.kg-1.d-1和3.15 mmol.kg-1.d-1 CAP治疗组中肝肿瘤体积与对照组肝肿瘤体积有明显差别，P值分别为0.037和0.016，而1.05 mmol.kg-1.d-1组体积与对照组比较，差异无显著意义，P=0.953。用趋势卡方分析，CAP随着剂量的加大，肺转移率降低(χ2趋势=20.007，P<0.001)。裸鼠治疗后，各组检测血常规和肝功能及大便隐血试验均在正常范围。但3.15 mmol.kg-1.d-1CAP治疗组裸鼠体重明显下降(<80%治疗前裸鼠体重)，而其它各组无明显变化。
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表1 Capecitabine对原位种植肝癌生长及转移的抑制作用 组别
鼠数
肝种植瘤体积
mm3(
±s)肺转移数
对照组
6
447±159
6
1.05mmol.kg-1.d-1组
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6
414± 97
4
2.10mmol.kg-1.d-1组
6
240±119
1
3.15mmol.kg-1.d-1组
6
209±150
0
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讨论 新生肿瘤血管是肿瘤获取代谢营养的基础，也是肿瘤细胞迁移游走形成转移的必经之路。肿瘤或宿主细胞产生许多可溶性血管生长因子，促进血管内皮细胞增殖和血管形成。PD-ECGF是一种致内皮细胞分裂原。1987年首次从血小板中分离出来，以后发现具有促进内皮细胞趋化活性并能促进新生血管生成。它与胸苷磷酸化酶同源，具有胸苷磷酸酶的活性[5]，现在许多学者把两者当作同一名词可互换使用。已发现PD-ECGF在人类肿瘤组织中水平升高，如乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌、子宫癌、宫颈癌、肾癌、甲状腺癌、和结直肠癌等[6]。与乳腺癌、宫颈癌、食管癌、结肠癌和胃癌组织中微血管密度密切相关，是肿瘤血管形成和维持的重要因子之一[7，8]。本研究结果显示，PD-ECGF在肝癌组织中表达率达67.8%～70.5%，高于癌周正常肝组织，且在TNM高分期组肝癌中表达高于TNM低分期组中表达，说明PD-ECGF可能与肝癌生长和侵袭转移中的血管形成有关。
CAP是一种新的肿瘤选择性化疗药物，1998年4月获得美国FDA认证进入临床。它需在体内经三个步骤，最终变为5-FU发挥抑制肿瘤的作用，即CAP首先经肝内羧基酯酶转变为5′-脱氧-氟胞苷，再经肝和肿瘤组织内活性高的胞苷脱氨基酶转变为5′-脱氧-氟尿苷(商品名：氟铁龙)，最后经PD-ECGF/胸苷磷酸化酶转变为5-FU，由于肝脏组织内羧基酯酶和胞苷脱氨基酶含量高，PD-ECGF/胸苷磷酸化酶在肿瘤组织中的表达水平高于正常组织，故CAP和氟铁龙选择性的在肿瘤组织中转化为5-FU发挥化疗作用[9]。有研究显示，口服CAP治疗在肿瘤内产生的5-FU浓度是血浆和肌肉中的127倍和22倍，而5-氟尿嘧啶治疗在肿瘤、血浆和肌肉中的5-FU浓度却无差异，也即无肿瘤选择性[10]。
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本研究结果显示，HCC 组织内无论PD-ECGF/胸苷磷酸化酶蛋白水平，还是mRNA水平均高于癌周正常肝组织，特别是TNM高分期HCC组织中表达更高，提示CAP在HCC组织内特别是高TNM分期者产生的5-FU浓度可高于癌周正常肝组织。LCID 20裸鼠口服2.10 mmol.kg-1.day-1和3.15 mmol.kg-1.day-1 CAP治疗后肝肿瘤体积明显低于对照组肝肿瘤体积，治疗后肝功能、血常规无影响，大便隐血检查亦无异常，且CAP能抑制裸鼠的肺转移，说明CAP治疗肝癌安全有效，另外也说明CAP确实能选择性在肝癌组织内转化为5-FU发挥抑癌作用。3.15 mmol.kg-1.day-1 CAP治疗组中裸鼠体重明显下降，而其它各组无变化，说明适当剂量是CAP治疗的关键之一。治疗后裸鼠肝癌PD-ECGF染色强度降低，可能与肝癌细胞受到抑制后肿瘤组织产生PD-ECGF亦相应降低有关。国外也有报道，氟铁龙和Tegafur治疗后肿瘤组织中的PD-ECGF水平下降[11]。
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根据本实验可得出以下结论，PD-ECGF在肝癌中高表达并与肝癌TNM分期相关。CAP治疗能抑制肝癌的生长和转移，为CAP进一步用于肝癌特别是高TNM分期(如伴有门静脉癌栓)肝癌患者打下实验基础。
基金项目：上海市百人计划基金(97BR029)，上海市科技发展基金(984419067)和美国中华医学基金(93-583)资助项目
参考文献
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8，Kitazono M, Takebayashi Y, Ishitsuka K, et al. Prevention of hypoxia-induced apoptosis by the angiogenic factor thymidine phosphorylase. Biochem Biophys Res Commun, 1998,253:797-803.
9，Ishikawa T,Sekiguchi F,Fukase Y,et al. Positive correlation between the efficacy of capecitabine and doxifluridine and the ratio of thymidine phosphorylase to dihydropyrimidine dehydrogenase activities in tumors in human cancer xenografts. Cancer Res, 1998,58:685-690.
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10，Ishikawa T, Utoh M, Sawada N,et al. Tumor selective delivery of 5-fluorouracil by capecitabine, a new oral fluoropyrimidine carbamate, in human cancer xenografts. Biochem Pharmacol, 1998,55:1091-1097.
11，Maeda K, Chung YS, Ogawa Y, et al. Thymidine phosphorylase/platelet-derived endothellial cell growth factor expression associated with hepatic metastasis in gastric carcinoma. Br J Cancer, 1996,73:884-888.
(收稿日期：1999-12-17), http://www.100md.com