聚合磷酸钙骨水泥细胞毒性评价
作者：刘义荣 孟爱英 薛 淼
单位：上海生物材料研究测试中心，上海第二医科大学附属第九人民医院，上海 200023
关键词：聚合磷酸钙骨水泥；L929小鼠成纤维细胞；细胞毒性
牙体牙髓牙周病学杂志990207 摘要 目的：对自已合成的聚合磷酸钙骨水泥细胞毒性进行了研究。方法：将材料浸提液与小鼠成纤维细胞接触2、4、7d后，用分光光度仪在588nm波长处测定吸光度，以评价材料的细胞毒性。结果：该材料细胞毒性为Ⅰ级，存在轻微的细胞毒性。结论：符合植入人体生物材料的细胞毒性要求。
中图号：R783.1 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)02-0110-02
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999，9(2)：110]
, http://www.100md.com
Cytotoxic evaluation of polymeric calcium
phosphate bone cements
Liu Yirong, Meng Aiying, Xue Miao
Shanghai Biomaterials Research & Test Center,No.9 People's Hospital of Shanghai Second Medical University, Shanghai 200023
Abstract Aim：The cytotoxicity of polymeric calcium phosphate bone cement was studied. Method: After L929 mouse fibroblastic cells were expased to the material for 2,4 and 7 days, the optical absorbance was measured with ultraviolet spectrophotometer in 588 wavelength and the cytotoxicity of the material was evaluated. Results:There was slight cytotoxicity. Conclusions:The material is accordance with the biomaterial cytotoxicity for human implant.
, 百拇医药
Key words polymeric calcium phosphate bone cement；L929 mouse fibroblastic cell；cytotoxicity
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999,9(2):110]
羟磷灰石(HA)是人体硬组织(骨、牙)的主要无机成分，有良好的生物相容性和骨结合性[1]，近十几年来在盖髓、牙槽嵴增高、人工牙根和骨缺损修复等方面得到了广泛的应用。但单纯的羟磷灰石多以颗粒状或块状形式提供临床应用，难以满足临床上各种骨缺损修复的需要，并且材料植入后，发现有移位和渗漏现象产生，难以达到治疗目的。国内外从90年代开始磷酸钙骨水泥材料的研究，由于磷酸四钙和磷酸氢钙在酸性条件下能发生凝固反应，并最终转化为羟磷灰石[2～4]，因其凝固前具有可塑性，是一种比较理想的盖髓材料，也是一种在医学领域有广泛应用前景的骨替代材料[5]。本文对自已合成的聚合磷酸钙骨水泥细胞毒性进行评价。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料制备
将碳酸钙、磷酸氢钙按一定比例充分混匀，在高温烧结炉中经1?450～1?500℃高温煅烧6h，待炉温降至室温时，从炉中取出合成料，即为磷酸四钙，球磨粉碎，过200目筛，将磷酸四钙和磷酸氢钙按一定比例充分混匀，除去水分，保存在密闭容器中；将丙烯酸、衣康酸按一定比例混合，以双蒸水为反应溶剂，加入一定量的催化剂，通冷凝水，加热、搅拌进行合成反应，生成丙烯酸-衣康酸共聚酸。用双蒸水将该共聚酸配制成300ml/L浓度的固化液。
1.2 实验方法
按3：1的粉液比调拌骨水泥60s，制成直径5mm、厚1mm的圆片，用超声波清洗器清洗，高温、高压消毒，备用。
培养基为含100ml/L小牛血清的Eagle MEM培养液，阴性对照为新鲜培养液。取培养传代3～4d生长旺盛的L929小鼠成纤维细胞，制成浓度为5×107/L的细胞悬液，在每个已加入试样的试管中加入1ml细胞悬液，将试管置于37℃恒温箱培养。
, 百拇医药
各实验试管于37℃恒温箱培养24h后，细胞已贴壁生长，然后进行浸提液交换。弃去各试管内上清液。阴性对照组各试管加入新鲜培养液1ml，材料组各试管中加入含50ml/L材料浸提液的新鲜培养液各1ml进行交换，然后继续置37℃恒温箱培养，2、4、7d后，分别经PBS洗涤、福尔马林液固定、水洗、结晶紫罗兰染色、再水洗、十二烷基硫酸钠处理后，在MPS-2000型岛津紫外分光光度计588nm波长处测定其吸光度，按下列公式计算材料的细胞相对增殖率(RGR)。
根据细胞相对增殖率，进行细胞毒性评级(0～Ⅴ)[6]。
2 结果 (表1)
表1 聚合磷酸钙骨水泥细胞毒性结果 天数
吸光度
, 百拇医药
RGR(%)
毒性级
2
A 0.3021
86.3
Ⅰ
B 0.3500
4
A 0.3488
88.3
Ⅰ
B 0.3948
7
, 百拇医药
A 0.5050
87.8
Ⅰ
B 0.5182
A为样品，B为阴性对照
3 讨论
聚合磷酸钙骨水泥具有可调性，且凝固反应的最终产物为羟磷灰石，可作为牙槽嵴增高、盖髓垫底、根管充填材料，也可用于非负重区域骨缺损修复，近年来已得到越来越多学者和医生的关注。
细胞增殖度试验是一种对材料浸提液进行检测的体外实验。通过在体外模拟体内生长环境，让材料与细胞接触2、4、7d，用紫外分光光度计对各期细胞提取液所含染色量进行588nm波长的吸光度测定，计算出细胞相对增殖率。如细胞生长旺盛，则细胞提取液浓度大，颜色深，吸光度也大，故吸光度的大小可显示细胞的毒性程度。最后将细胞相对增值率转换成细胞毒性级数(0～Ⅴ)。
, 百拇医药
本研究参照了“上海市医用生物材料生物学性能测试标准(1986)”，从研究结果来看，聚合磷酸钙的细胞毒性轻微，符合植入人体生物材料的细胞毒性要求，但在实际应用于人体时，还需要通过综合其它一系列生物学试验指标来对该材料的生物安全性作一个确切的评价。
聚合磷酸钙的动物体内植入试验将另文报道。
参考文献
1 陈德敏，刘义荣，薛淼等. 羟磷灰石生物陶瓷合成及其生物学性能评价. 中华口腔医学杂志，1991，26(5)：294
2 Mandai Y, Shimada S, Sugihara F et al. Hardening material containing tetracalcium phosphate-citric acid-malonic acid. J Jpn Dent Mater, 1987,6:403
, 百拇医药
3 Sabine H, Dickens-Venz, Shozo Takagi et al. Physical and chemical properties of resin-reinforced calcium phosphate cements. Dent Mater,1994,10:100
4 Miyazaki K, Horibe T, Antonucci JM et al. Polymeric calcium phosphate cements:analysis of reaction products and properties. Dent Mater, 1993,9:41
5 Lu JH, Siew C, Robineon JP. New attachene following the use of anovel calcium phosphate system. J Dent Res, 1988,67:352
6 张彩霞，孙皎，孟爱英. 紫外分光光度仪测定不同含量铜银汞合金细胞毒性的新方法. 中华口腔医学杂志，1990，25(3)：216
收稿日期：1998-10-28, 百拇医药
单位：上海生物材料研究测试中心，上海第二医科大学附属第九人民医院，上海 200023
关键词：聚合磷酸钙骨水泥；L929小鼠成纤维细胞；细胞毒性
牙体牙髓牙周病学杂志990207 摘要 目的：对自已合成的聚合磷酸钙骨水泥细胞毒性进行了研究。方法：将材料浸提液与小鼠成纤维细胞接触2、4、7d后，用分光光度仪在588nm波长处测定吸光度，以评价材料的细胞毒性。结果：该材料细胞毒性为Ⅰ级，存在轻微的细胞毒性。结论：符合植入人体生物材料的细胞毒性要求。
中图号：R783.1 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)02-0110-02
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999，9(2)：110]
, http://www.100md.com
Cytotoxic evaluation of polymeric calcium
phosphate bone cements
Liu Yirong, Meng Aiying, Xue Miao
Shanghai Biomaterials Research & Test Center,No.9 People's Hospital of Shanghai Second Medical University, Shanghai 200023
Abstract Aim：The cytotoxicity of polymeric calcium phosphate bone cement was studied. Method: After L929 mouse fibroblastic cells were expased to the material for 2,4 and 7 days, the optical absorbance was measured with ultraviolet spectrophotometer in 588 wavelength and the cytotoxicity of the material was evaluated. Results:There was slight cytotoxicity. Conclusions:The material is accordance with the biomaterial cytotoxicity for human implant.
, 百拇医药
Key words polymeric calcium phosphate bone cement；L929 mouse fibroblastic cell；cytotoxicity
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999,9(2):110]
羟磷灰石(HA)是人体硬组织(骨、牙)的主要无机成分，有良好的生物相容性和骨结合性[1]，近十几年来在盖髓、牙槽嵴增高、人工牙根和骨缺损修复等方面得到了广泛的应用。但单纯的羟磷灰石多以颗粒状或块状形式提供临床应用，难以满足临床上各种骨缺损修复的需要，并且材料植入后，发现有移位和渗漏现象产生，难以达到治疗目的。国内外从90年代开始磷酸钙骨水泥材料的研究，由于磷酸四钙和磷酸氢钙在酸性条件下能发生凝固反应，并最终转化为羟磷灰石[2～4]，因其凝固前具有可塑性，是一种比较理想的盖髓材料，也是一种在医学领域有广泛应用前景的骨替代材料[5]。本文对自已合成的聚合磷酸钙骨水泥细胞毒性进行评价。
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1 材料和方法
1.1 材料制备
将碳酸钙、磷酸氢钙按一定比例充分混匀，在高温烧结炉中经1?450～1?500℃高温煅烧6h，待炉温降至室温时，从炉中取出合成料，即为磷酸四钙，球磨粉碎，过200目筛，将磷酸四钙和磷酸氢钙按一定比例充分混匀，除去水分，保存在密闭容器中；将丙烯酸、衣康酸按一定比例混合，以双蒸水为反应溶剂，加入一定量的催化剂，通冷凝水，加热、搅拌进行合成反应，生成丙烯酸-衣康酸共聚酸。用双蒸水将该共聚酸配制成300ml/L浓度的固化液。
1.2 实验方法
按3：1的粉液比调拌骨水泥60s，制成直径5mm、厚1mm的圆片，用超声波清洗器清洗，高温、高压消毒，备用。
培养基为含100ml/L小牛血清的Eagle MEM培养液，阴性对照为新鲜培养液。取培养传代3～4d生长旺盛的L929小鼠成纤维细胞，制成浓度为5×107/L的细胞悬液，在每个已加入试样的试管中加入1ml细胞悬液，将试管置于37℃恒温箱培养。
, 百拇医药
各实验试管于37℃恒温箱培养24h后，细胞已贴壁生长，然后进行浸提液交换。弃去各试管内上清液。阴性对照组各试管加入新鲜培养液1ml，材料组各试管中加入含50ml/L材料浸提液的新鲜培养液各1ml进行交换，然后继续置37℃恒温箱培养，2、4、7d后，分别经PBS洗涤、福尔马林液固定、水洗、结晶紫罗兰染色、再水洗、十二烷基硫酸钠处理后，在MPS-2000型岛津紫外分光光度计588nm波长处测定其吸光度，按下列公式计算材料的细胞相对增殖率(RGR)。
根据细胞相对增殖率，进行细胞毒性评级(0～Ⅴ)[6]。
2 结果 (表1)
表1 聚合磷酸钙骨水泥细胞毒性结果 天数
吸光度
, 百拇医药
RGR(%)
毒性级
2
A 0.3021
86.3
Ⅰ
B 0.3500
4
A 0.3488
88.3
Ⅰ
B 0.3948
7
, 百拇医药
A 0.5050
87.8
Ⅰ
B 0.5182
A为样品，B为阴性对照
3 讨论
聚合磷酸钙骨水泥具有可调性，且凝固反应的最终产物为羟磷灰石，可作为牙槽嵴增高、盖髓垫底、根管充填材料，也可用于非负重区域骨缺损修复，近年来已得到越来越多学者和医生的关注。
细胞增殖度试验是一种对材料浸提液进行检测的体外实验。通过在体外模拟体内生长环境，让材料与细胞接触2、4、7d，用紫外分光光度计对各期细胞提取液所含染色量进行588nm波长的吸光度测定，计算出细胞相对增殖率。如细胞生长旺盛，则细胞提取液浓度大，颜色深，吸光度也大，故吸光度的大小可显示细胞的毒性程度。最后将细胞相对增值率转换成细胞毒性级数(0～Ⅴ)。
, 百拇医药
本研究参照了“上海市医用生物材料生物学性能测试标准(1986)”，从研究结果来看，聚合磷酸钙的细胞毒性轻微，符合植入人体生物材料的细胞毒性要求，但在实际应用于人体时，还需要通过综合其它一系列生物学试验指标来对该材料的生物安全性作一个确切的评价。
聚合磷酸钙的动物体内植入试验将另文报道。
参考文献
1 陈德敏，刘义荣，薛淼等. 羟磷灰石生物陶瓷合成及其生物学性能评价. 中华口腔医学杂志，1991，26(5)：294
2 Mandai Y, Shimada S, Sugihara F et al. Hardening material containing tetracalcium phosphate-citric acid-malonic acid. J Jpn Dent Mater, 1987,6:403
, 百拇医药
3 Sabine H, Dickens-Venz, Shozo Takagi et al. Physical and chemical properties of resin-reinforced calcium phosphate cements. Dent Mater,1994,10:100
4 Miyazaki K, Horibe T, Antonucci JM et al. Polymeric calcium phosphate cements:analysis of reaction products and properties. Dent Mater, 1993,9:41
5 Lu JH, Siew C, Robineon JP. New attachene following the use of anovel calcium phosphate system. J Dent Res, 1988,67:352
6 张彩霞，孙皎，孟爱英. 紫外分光光度仪测定不同含量铜银汞合金细胞毒性的新方法. 中华口腔医学杂志，1990，25(3)：216
收稿日期：1998-10-28, 百拇医药