子宫内膜层粘连蛋白与Norplant致子宫异常出血的相关性研究
作者：史小林 韩学军 翁静 路欣 许晴 翁梨驹
单位：史小林(100054 北京，首都医科大学生殖医学研究中心)；翁静(100054 北京，首都医科大学生殖医学研究中心)；路欣(100054 北京，首都医科大学生殖医学研究中心)；许晴(100054 北京，首都医科大学生殖医学研究中心)；韩学军(首都医科大学附属红十字朝阳医院妇产科)；翁梨驹(首都医科大学附属红十字朝阳医院妇产科)
关键词：左炔诺孕酮；层粘连蛋白；子宫内膜；子宫不规则出血
中华妇产科杂志000313 【摘要】 目的 探讨层粘连蛋白(LN)与Norplant致子宫不规则出血的关系。方法 对正常增殖期妇女子宫内膜(6例)和埋植Norplant半年、1年及2年以上月经规律及有子宫不规则出血妇女(各6例，共36例)的子宫内膜进行组织学观察, 并用显微分光光度计对用免疫组织化学方法显示的子宫内膜LN进行定量分析。结果 使用Norplant妇女的子宫内膜，(1)均无典型的周期特点,腺体明显减少，有腺体发育不同步现象； (2) 有不规则出血者腺上皮基膜和血管内皮基膜LN含量低于月经规律者,尤以埋植半年和1年时明显(P<0.05)。结论 Norplant致子宫异常出血与子宫内膜LN含量的减少有关。
, 百拇医药
Study on Relationship between Endometrium Laminin Expression and Irregular Uterine Bleeding in Norplant Users
SHI Xiaolin*， HAN Xuejun，*WENG Jing，et al.
*Department of Reproductive Medicine, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100054, China
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between endometrium laminin (LN)expression and irregular uterine bleeding in Norplant users. Methods Eighteen endomerium samples obtained during day 10～14th from Norlant users for 1/2, 1 or >2 years respectively with irregular bleeding were studied morphologically and immunohistochemically for LN expression. Six normal proliferative endometria and 18 connterpacts with regular bleeding were used as control. Results In Norplant users,endometrial glands decreased in numbers and asynchromized in appearance. The LN expression on basal lamina of glandular epithelium and vascular endothelium was lower in those with irregular bleeding as compared with regular bleeders (P<0.05). Conclusion The decline of LN expression may related to irregular bleeding in Norplant users.
, 百拇医药
【Key words】 Levonorgestrel;Laminin；Endometrium；Metrorrhagia
Norplant皮下埋植是当前国内外广泛采用的长效避孕措施之一，但使用第1年子宫不规则出血率高达70%以上，为影响接受性的主要原因[1,2]。目前,虽有较多对Norplant干扰月经周期出现不规则出血的机理进行的研究[3,4],但尚未得到完整的结论。因Norplant使用者中仍有部分未出现子宫不规则出血，所以我们对未使用Norplant和使用Norplant半年、1年及2年以上月经规律和有不规则出血妇女的子宫内膜形态学和层粘连蛋白(LN)含量进行观察，探讨不规则子宫出血的病理变化。
资料与方法
一、研究对象
共42例，其中埋植Norplant者36例(Norplant组),取自1997年5月至1998年6月首都医科大学附属红十字朝阳医院计划生育门诊定期随访者,年龄25～40岁,均有完整的月经记录；对照组6例，选取同期在门诊手术室放置宫内节育器的健康育龄妇女,年龄23～36岁，月经规律,连续3个月未用过甾体激素类药物。36例埋植Norplant 者中,埋植半年12例，其中月经规律及有不规则出血者各6例；埋植1年12例，其中月经规律及有不规则出血者各6例；埋植2年12例，其中月经规律及有不规则出血者各6例。
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二、方法
1.取材:在月经周期的增殖期(即月经周期第10～14天)采取子宫内膜。对照组以常规组织学染色确认, Norplant组根据主诉确定。
2.染色：刮取的子宫内膜组织经10%甲醛固定，石蜡包埋，切片厚4 μm,分别进行苏木精伊红常规组织学染色和LN免疫组织化学(免疫组化)反应。 免疫组化使用链酶亲和素-生物素(labelled streptavidin biotin，LSAB)法, 兔抗人LN(一抗,工作液)及通用型过氧化物酶免疫组化药盒为美国ZYMED公司产品( 购自中山生物技术有限公司)。全部标本在同一时间、同一条件下进行染色。免疫组化反应步骤： (1)切片脱蜡,经下行乙醇放入磷酸盐缓冲液;(2)3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶(室温5 min);(3)正常羊血清抑制非特异性反应(室温5 min);(4)一抗室温反应30 min;(5)生物素标记的二抗(抗兔免疫球蛋白)作用(室温10 min);(6)辣根过氧化物酶标记链霉卵白素室温下反应10 min;(7)二胺基联苯胺显色反应10 min;(8)常规脱水，二甲苯透明，树胶封片。以正常子宫内膜切片为阳性对照，以磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。
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3.结果判定: 免疫组化阳性反应物为黄色。用显微分光光度计(型号：Leitz，MPV-COMBI，德国莱卡公司产品)进行定量测定。每1例标本测定10个区域， 测定透光度值，经计算机处理得到相应的吸光度值，数值越大，说明免疫组化反应越强。
三、统计学方法
采用t检验及方差分析，结果以
±s表示。
结果
一、埋植Norplant后子宫内膜的组织学变化
与对照组比较，Norplant组妇女的子宫内膜表面上皮发育不良,局部有脱落。埋植Norplant后月经规律者的子宫内膜组织中无明显出血，而有不规则出血者中的12例子宫内膜组织浅层(即表面上皮下方)和内膜中层有局部性出血，出血部位的血管多呈断裂状;部分标本的内膜间质呈致密状，其中部分组织伴有纤维增生，也有间质疏松，但共同特点是子宫内膜腺体明显减少，有不同步现象,即同一子宫内膜组织中的腺体可分别表现为增殖期或分泌期改变。
, 百拇医药
二、 埋植Norplant后子宫内膜LN含量的变化
LN主要分布在子宫内膜的表面上皮基膜、腺上皮基膜和血管内皮的基膜处。埋植Norplant后，(1)基膜变薄,有不规则出血者血管基膜有部分断裂现象，特别是埋植半年者变化更明显；(2)有不规则出血者腺上皮基膜和血管基膜的LN含量均低于月经规律者,尤以埋植半年和1年时明显(P<0.05); 表面上皮基膜埋植半年时不规则出血者低于月经规律者(P<0.05)。见表1。
表1 子宫内膜LN免疫组化反应
吸光度值比较(×10-3，±s) 组别
总例
数
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表皮上
皮基膜
血管内
皮基膜
腺上皮
基膜
对照组
6
80.4±0.4
103.2±0.3
119.4±1.8
Norplant组
36
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埋植半年
月经规律
6
76.5±0.3
129.2±0.6*
127.9±0.8
不规则出血
6
33.3±0.2*△
24.9±0.3*△
40.3±0.3*△
, 百拇医药
埋植1年
月经规律
6
111.4±0.6*
135.6±1.8*
105.0±0.4
不规则出血
6
96.6±0.8
105.1±0.2△
59.4±0.8*△
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埋植2年
月经规律
6
85.0±0.8
95.7±0.3
101.2±0.5
不规则出血
6
111.5±1.8*
86.7±1.2
100.8±0.9
*与对照组比较，P<0.05 △与月经规律者比较，P<0.05 讨论
, 百拇医药
本研究发现,Norplant使用者子宫内膜无典型周期特点,即以形态学指标难以辨认子宫内膜的周期,表现为表面上皮发育不良,子宫腺体明显减少,这一变化无疑是受精卵不能正常着床的直接原因。子宫内膜的发育不良可能与Norplant干扰了正常卵巢的激素水平,从而影响子宫内膜性激素水平有直接关系,我们以往的研究证实了这一点[4]。子宫内膜组织的发育不良,往往伴有内膜血管的生长障碍,血管发育不良是子宫不规则出血的主要原因。值得讨论的是,本实验使用的内膜标本中多数是同一患者的内膜组织,即同一Norplant使用者分别在埋植半年、1年后取子宫内膜检查,在此病例范围内发现不规则出血多在埋植半年内发生,而且并不完全随埋植时间的延长而消失,同时埋植后半年内月经规律者并不随埋植时间的延长而出现不规则出血。这一现象提示，Norplant使用者出现不规则出血的主要原因可能与使用者个体差异有关,但这一推论还有待进一步验证。基膜是位于上皮组织下的一层特殊化的细胞外基质，不仅对上皮细胞起物理性支持作用,同时也是防止高分子物质通过的屏障。 基膜的主要成分有LN和IV型胶原蛋白[5]。LN是位于基膜局部的相对分子质量约800 000～1 000 000的大分子糖蛋白,由A链(约400 000)、B1链(约200 000)及B2链(约200 000)组成。LN生物活性除参与细胞连接外,还表现在细胞的增殖、移动、分化等诸方面[6]。LN对维持基膜的正常形态与功能是必要的。
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子宫内膜的上皮组织包括表面上皮、腺上皮和血管内皮。 Norplant使用者特别是不规则出血者基膜LN明显减少,而且部分血管基膜发生断裂,断裂血管周围可见不同程度的出血。子宫螺旋动脉属终末支，无分支,每支动脉供血的内膜区域甚小,因此在内膜中的血管断裂出血表现为局部性。但Nor- plant使用者内膜出血部位更多的是发生在表面上皮的浅层,说明Norplant使用者内膜出血多发生在毛细血管和小静脉。 Norplant使用者子宫内膜表面上皮的基膜,特别是不规则出血者的基膜LN明显变薄,说明其支持与屏障作用减弱,因此在内膜浅层发生出血现象时,血液容易通过表面上皮而进入子宫腔。提示，血管基膜LN含量的减少,致使血管基膜的不完整而发生断裂，是Norplant致子宫异常出血的病理变化之一。但对于造成LN减少的诱因还有待进一步探讨。
本课题受北京市自然科学基金资助(编号:7982015)
参考文献
, 百拇医药 1，翁梨驹. 避孕研究现状与趋势. 中华妇产科杂志, 1996,31:515-518.
2，郑树衡.皮下埋植剂研究及临床应用. 生殖与避孕, 1995,15:3-7.
3，No authors listed. Menstrual disorders and progestin contraception. Proceedings of a meeting. Bali, Indonesia, 14-15 October 1995. Hum Reprod, 1996, 11 (Suppl 2): 1-190.
4，韩学军,翁梨驹,史小林，等. Norplant使用者子宫内膜形态与性激素受体变化的研究. 首都医科大学学报, 1998,19:348-360.
5，史小林,诸定寿,翁静. 人子宫内膜细胞外基质在月经周期中变化的研究. 生殖与避孕, 1994,14:407-411.
6，史小林. 生物体研究的新方向——细胞外基质和细胞粘附因子.解剖学报,1999,30:189-191.
(收稿日期：1999-03-24), 百拇医药
单位：史小林(100054 北京，首都医科大学生殖医学研究中心)；翁静(100054 北京，首都医科大学生殖医学研究中心)；路欣(100054 北京，首都医科大学生殖医学研究中心)；许晴(100054 北京，首都医科大学生殖医学研究中心)；韩学军(首都医科大学附属红十字朝阳医院妇产科)；翁梨驹(首都医科大学附属红十字朝阳医院妇产科)
关键词：左炔诺孕酮；层粘连蛋白；子宫内膜；子宫不规则出血
中华妇产科杂志000313 【摘要】 目的 探讨层粘连蛋白(LN)与Norplant致子宫不规则出血的关系。方法 对正常增殖期妇女子宫内膜(6例)和埋植Norplant半年、1年及2年以上月经规律及有子宫不规则出血妇女(各6例，共36例)的子宫内膜进行组织学观察, 并用显微分光光度计对用免疫组织化学方法显示的子宫内膜LN进行定量分析。结果 使用Norplant妇女的子宫内膜，(1)均无典型的周期特点,腺体明显减少，有腺体发育不同步现象； (2) 有不规则出血者腺上皮基膜和血管内皮基膜LN含量低于月经规律者,尤以埋植半年和1年时明显(P<0.05)。结论 Norplant致子宫异常出血与子宫内膜LN含量的减少有关。
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Study on Relationship between Endometrium Laminin Expression and Irregular Uterine Bleeding in Norplant Users
SHI Xiaolin*， HAN Xuejun，*WENG Jing，et al.
*Department of Reproductive Medicine, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100054, China
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between endometrium laminin (LN)expression and irregular uterine bleeding in Norplant users. Methods Eighteen endomerium samples obtained during day 10～14th from Norlant users for 1/2, 1 or >2 years respectively with irregular bleeding were studied morphologically and immunohistochemically for LN expression. Six normal proliferative endometria and 18 connterpacts with regular bleeding were used as control. Results In Norplant users,endometrial glands decreased in numbers and asynchromized in appearance. The LN expression on basal lamina of glandular epithelium and vascular endothelium was lower in those with irregular bleeding as compared with regular bleeders (P<0.05). Conclusion The decline of LN expression may related to irregular bleeding in Norplant users.
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【Key words】 Levonorgestrel;Laminin；Endometrium；Metrorrhagia
Norplant皮下埋植是当前国内外广泛采用的长效避孕措施之一，但使用第1年子宫不规则出血率高达70%以上，为影响接受性的主要原因[1,2]。目前,虽有较多对Norplant干扰月经周期出现不规则出血的机理进行的研究[3,4],但尚未得到完整的结论。因Norplant使用者中仍有部分未出现子宫不规则出血，所以我们对未使用Norplant和使用Norplant半年、1年及2年以上月经规律和有不规则出血妇女的子宫内膜形态学和层粘连蛋白(LN)含量进行观察，探讨不规则子宫出血的病理变化。
资料与方法
一、研究对象
共42例，其中埋植Norplant者36例(Norplant组),取自1997年5月至1998年6月首都医科大学附属红十字朝阳医院计划生育门诊定期随访者,年龄25～40岁,均有完整的月经记录；对照组6例，选取同期在门诊手术室放置宫内节育器的健康育龄妇女,年龄23～36岁，月经规律,连续3个月未用过甾体激素类药物。36例埋植Norplant 者中,埋植半年12例，其中月经规律及有不规则出血者各6例；埋植1年12例，其中月经规律及有不规则出血者各6例；埋植2年12例，其中月经规律及有不规则出血者各6例。
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二、方法
1.取材:在月经周期的增殖期(即月经周期第10～14天)采取子宫内膜。对照组以常规组织学染色确认, Norplant组根据主诉确定。
2.染色：刮取的子宫内膜组织经10%甲醛固定，石蜡包埋，切片厚4 μm,分别进行苏木精伊红常规组织学染色和LN免疫组织化学(免疫组化)反应。 免疫组化使用链酶亲和素-生物素(labelled streptavidin biotin，LSAB)法, 兔抗人LN(一抗,工作液)及通用型过氧化物酶免疫组化药盒为美国ZYMED公司产品( 购自中山生物技术有限公司)。全部标本在同一时间、同一条件下进行染色。免疫组化反应步骤： (1)切片脱蜡,经下行乙醇放入磷酸盐缓冲液;(2)3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶(室温5 min);(3)正常羊血清抑制非特异性反应(室温5 min);(4)一抗室温反应30 min;(5)生物素标记的二抗(抗兔免疫球蛋白)作用(室温10 min);(6)辣根过氧化物酶标记链霉卵白素室温下反应10 min;(7)二胺基联苯胺显色反应10 min;(8)常规脱水，二甲苯透明，树胶封片。以正常子宫内膜切片为阳性对照，以磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。
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3.结果判定: 免疫组化阳性反应物为黄色。用显微分光光度计(型号：Leitz，MPV-COMBI，德国莱卡公司产品)进行定量测定。每1例标本测定10个区域， 测定透光度值，经计算机处理得到相应的吸光度值，数值越大，说明免疫组化反应越强。
三、统计学方法
采用t检验及方差分析，结果以
±s表示。结果
一、埋植Norplant后子宫内膜的组织学变化
与对照组比较，Norplant组妇女的子宫内膜表面上皮发育不良,局部有脱落。埋植Norplant后月经规律者的子宫内膜组织中无明显出血，而有不规则出血者中的12例子宫内膜组织浅层(即表面上皮下方)和内膜中层有局部性出血，出血部位的血管多呈断裂状;部分标本的内膜间质呈致密状，其中部分组织伴有纤维增生，也有间质疏松，但共同特点是子宫内膜腺体明显减少，有不同步现象,即同一子宫内膜组织中的腺体可分别表现为增殖期或分泌期改变。
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二、 埋植Norplant后子宫内膜LN含量的变化
LN主要分布在子宫内膜的表面上皮基膜、腺上皮基膜和血管内皮的基膜处。埋植Norplant后，(1)基膜变薄,有不规则出血者血管基膜有部分断裂现象，特别是埋植半年者变化更明显；(2)有不规则出血者腺上皮基膜和血管基膜的LN含量均低于月经规律者,尤以埋植半年和1年时明显(P<0.05); 表面上皮基膜埋植半年时不规则出血者低于月经规律者(P<0.05)。见表1。
表1 子宫内膜LN免疫组化反应
吸光度值比较(×10-3，
±s) 组别总例
数
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表皮上
皮基膜
血管内
皮基膜
腺上皮
基膜
对照组
6
80.4±0.4
103.2±0.3
119.4±1.8
Norplant组
36
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埋植半年
月经规律
6
76.5±0.3
129.2±0.6*
127.9±0.8
不规则出血
6
33.3±0.2*△
24.9±0.3*△
40.3±0.3*△
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埋植1年
月经规律
6
111.4±0.6*
135.6±1.8*
105.0±0.4
不规则出血
6
96.6±0.8
105.1±0.2△
59.4±0.8*△
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埋植2年
月经规律
6
85.0±0.8
95.7±0.3
101.2±0.5
不规则出血
6
111.5±1.8*
86.7±1.2
100.8±0.9
*与对照组比较，P<0.05 △与月经规律者比较，P<0.05 讨论
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本研究发现,Norplant使用者子宫内膜无典型周期特点,即以形态学指标难以辨认子宫内膜的周期,表现为表面上皮发育不良,子宫腺体明显减少,这一变化无疑是受精卵不能正常着床的直接原因。子宫内膜的发育不良可能与Norplant干扰了正常卵巢的激素水平,从而影响子宫内膜性激素水平有直接关系,我们以往的研究证实了这一点[4]。子宫内膜组织的发育不良,往往伴有内膜血管的生长障碍,血管发育不良是子宫不规则出血的主要原因。值得讨论的是,本实验使用的内膜标本中多数是同一患者的内膜组织,即同一Norplant使用者分别在埋植半年、1年后取子宫内膜检查,在此病例范围内发现不规则出血多在埋植半年内发生,而且并不完全随埋植时间的延长而消失,同时埋植后半年内月经规律者并不随埋植时间的延长而出现不规则出血。这一现象提示，Norplant使用者出现不规则出血的主要原因可能与使用者个体差异有关,但这一推论还有待进一步验证。基膜是位于上皮组织下的一层特殊化的细胞外基质，不仅对上皮细胞起物理性支持作用,同时也是防止高分子物质通过的屏障。 基膜的主要成分有LN和IV型胶原蛋白[5]。LN是位于基膜局部的相对分子质量约800 000～1 000 000的大分子糖蛋白,由A链(约400 000)、B1链(约200 000)及B2链(约200 000)组成。LN生物活性除参与细胞连接外,还表现在细胞的增殖、移动、分化等诸方面[6]。LN对维持基膜的正常形态与功能是必要的。
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子宫内膜的上皮组织包括表面上皮、腺上皮和血管内皮。 Norplant使用者特别是不规则出血者基膜LN明显减少,而且部分血管基膜发生断裂,断裂血管周围可见不同程度的出血。子宫螺旋动脉属终末支，无分支,每支动脉供血的内膜区域甚小,因此在内膜中的血管断裂出血表现为局部性。但Nor- plant使用者内膜出血部位更多的是发生在表面上皮的浅层,说明Norplant使用者内膜出血多发生在毛细血管和小静脉。 Norplant使用者子宫内膜表面上皮的基膜,特别是不规则出血者的基膜LN明显变薄,说明其支持与屏障作用减弱,因此在内膜浅层发生出血现象时,血液容易通过表面上皮而进入子宫腔。提示，血管基膜LN含量的减少,致使血管基膜的不完整而发生断裂，是Norplant致子宫异常出血的病理变化之一。但对于造成LN减少的诱因还有待进一步探讨。
本课题受北京市自然科学基金资助(编号:7982015)
参考文献
, 百拇医药 1，翁梨驹. 避孕研究现状与趋势. 中华妇产科杂志, 1996,31:515-518.
2，郑树衡.皮下埋植剂研究及临床应用. 生殖与避孕, 1995,15:3-7.
3，No authors listed. Menstrual disorders and progestin contraception. Proceedings of a meeting. Bali, Indonesia, 14-15 October 1995. Hum Reprod, 1996, 11 (Suppl 2): 1-190.
4，韩学军,翁梨驹,史小林，等. Norplant使用者子宫内膜形态与性激素受体变化的研究. 首都医科大学学报, 1998,19:348-360.
5，史小林,诸定寿,翁静. 人子宫内膜细胞外基质在月经周期中变化的研究. 生殖与避孕, 1994,14:407-411.
6，史小林. 生物体研究的新方向——细胞外基质和细胞粘附因子.解剖学报,1999,30:189-191.
(收稿日期：1999-03-24), 百拇医药