中国人IL-18结合蛋白Cdna的克隆和序列分析
作者：傅奕 赵惠仁 裴冬生;, http://www.100md.com
单位：傅奕(徐州医学院生物化学与分子生物学研究中心，江苏 徐州 221002)；赵惠仁(徐州医学院生物化学与分子生物学研究中心，江苏 徐州 221002)；裴冬生(徐州医学院生物化学与分子生物学研究中心，江苏 徐州 221002);, http://www.100md.com
关键词：白细胞介素-18结合蛋白；RT-PCR；cDNA克隆；序列分析;, http://www.100md.com
免疫学杂志000404 [摘 要] 目的 克隆人白介素-18结合蛋白(hIL-18BP)的cDNA，以研究其结构与功能的关系。方法 从中国汉族人的胎盘组织中提取总RNA，以RT-PCR方法扩增出全长585个bp的IL-18BP cDNA，将其与表达载体pcDNA3连接，转化大肠杆菌DH5α，建立了hIL-18BP的cDNA克隆。结果 序列分析表明，与国外文献报道的人IL-18BP的cDNA序列完全一致。结论 hIL-18BP已成功地得到克隆。;, http://www.100md.com
[中图分类号] R392.1 [文献标识码] A;, http://www.100md.com
[文章编号]1000-8861(2000)04-0254-03;, http://www.100md.com
Cloning and sequencing of human IL-18 binding protein cDNA;, http://www.100md.com
FU Yi，ZHAO Hui-ren，PEI Dong-sheng;, http://www.100md.com
(Research Center for Biochemistry and Molecular Biology，Xuzhou Medical College，Xuzhou 221002，China);, http://www.100md.com
[Abstract] Objective To obtain the cDNA of human interleukin-18(IL-18) binding protein(hIL-18BP) and to investigate the relationship between structure and function of hIL-18BP.Methods The total RNA was extracted from human placenta and the intact cDNA of hIL-18BP was amplified by RT-PCR.The cDNA was cloned into pcDNA3 vector and transformed into E.coli DH5α.Results The result of sequencing was completely consistent with the published hIL-18BP cDNA.Conclusion hIL-18BP cDNA has been cloned successfully.
[Key words] interleukin-18 binding protein；RT-PCR；cDNA cloning；DNA sequencing9m21+v2, 百拇医药
IL-18结合蛋白(IL-18BP)是新近发现的一种糖蛋白，系免疫球蛋白超家庭成员。1998年，AIZAWA等[1]首先克隆了小鼠的IL-18BP的cDNA序列，又以小鼠的IL-18BP cDNA作为探针，从正常人肝脏的cDNA文库中筛选出了人的IL-18 BP cDNA。其表达产物能够抑制IL-18诱导Th1等细胞产生IFN-γ、IL-8，还能降低IL-18对NF-κB的激活作用[2]，因此，被认为是IL-18的拮抗剂。为了进一步探讨IL-18BP的结构与功能的关系及其与IL-18相互作用的机制，我们利用RT-PCR的方法首次克隆了中国汉族人的IL-18BP cDNA，并进行了序列分析。9m21+v2, 百拇医药
1 材料与方法9m21+v2, 百拇医药
1.1 主要材料 新鲜的胎盘组织由徐州医学院附属医院妇产科提供；总RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、质粒提取试剂盒均为Promega公司产品；E.coli 菌株DH5α和质粒pcDNA3为本室保存；核酸限制性内切酶EcoR Ⅰ、HindⅢ以及T4DNA连接酶均购自Promega公司。9m21+v2, 百拇医药
1.2 总RNA提取 取液氮冻存的胎盘组织约100 mg，按试剂盒说明书操作，提取总RNA。总RNA沉淀溶于100 μl无核酸酶的水中，-80 °C保存。9m21+v2, 百拇医药
1.3 引物的设计与合成 根据发表的人IL-18BP的cDNA序列，设计PCR引物。上游引物：5’-gcaaagcttatgaccatgagacacaactg-3’，引入了一个Hind Ⅲ酶切位点。下游引物：5’-gcgaattcgtcgacttaaccctgctgctgtggact-3’，引入了一个EcoR Ⅰ酶切位点(加下划线处为酶切位点)。引物由GIBCO BRL公司合成。9m21+v2, 百拇医药
1.4 RT-PCR 加入总RNA 20 μg作为模板，上、下游引物至终浓度1 μmol/L，用Promega公司的RT-PCR系统进行反转录及PCR扩增。反应条件为：94 °C 30 s，61 °C 1 min，68 °C 2 min，40个循环。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。
1.5 cDNA的克隆及扩增 PCR扩增产物经酚-氯仿抽提纯化，HindⅢ和EcoR Ⅰ双酶切及低熔点琼脂糖凝胶电泳回收后，用酚-氯仿抽提纯化。然后与相同酶切并经低熔点琼脂糖凝胶回收纯化的pcDNA3质粒室温连接5 h，用连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，氨苄青平板筛选，37 °C培养过夜。利用pcDNA3中的抗氨苄青基因，筛选出阳性菌落，挑取单克隆菌落，在LB培养基中小量扩增，按Promega公司的试剂盒说明书提取质粒，酶切鉴定。#[&-h2], 百拇医药
1.6 hIL-18BP序列分析 使用ABI377全自动序列分析仪进行测序。#[&-h2], 百拇医药
2 结果#[&-h2], 百拇医药
2.1 IL-18BP的RT-PCR产物分析 将RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，可见一清晰特异扩增带，约600 bp，其大小与理论预期值一致(见图1)。
#[&-h2], 百拇医药
图1电泳分析RT-PCR扩增的hIL-18BP cDNA#[&-h2], 百拇医药
Fig 1Electrophoresis of RT-PCR amplified hIL-18BP#[&-h2], 百拇医药
cDNA#[&-h2], 百拇医药
1：1 kb DNA ladder；2：RT-PCR amplified hIL-18BP cDNA#[&-h2], 百拇医药
2.2 人IL-18 BP cDNA克隆与鉴定 RT-PCR产物经Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ双酶切后，与相同酶切的pcDNA3连接，转化E.coli DH5α，经氨苄青平板筛选得到阳性克隆，提取质粒后再经Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ双酶切鉴定，可见约5 kb的载体片段及600 bp的插入片段(见图2)。#[&-h2], 百拇医药
2.3 人IL-18BP序列分析 对经酶切鉴定初步确认的阳性克隆测序。结果如图3所示：其序列与已知的人IL-18BP cDNA序列[1]一致。
#[&-h2], 百拇医药
图 2pcDNA/hIL-18BP质粒限制性酶切图谱
Fig 2Restriction enzyme mapping of pcDNA/hIL-18BP@2, 百拇医药
plasmid@2, 百拇医药
1：pcDNA/hIL-18BP digested with Hind Ⅲ and EcoR Ⅰ@2, 百拇医药
2：1 kb DNA ladder@2, 百拇医药
3 讨论@2, 百拇医药
1995年、1996年，OKAMURA[3]和USHIO[4]等先后克隆了鼠和人的IL-18。IL-18是一种多效性的细胞因子，它能刺激Th1细胞分泌IFN-γ、GM-CSF和IL-2，并促进Th1细胞增殖，增强FasL介导的Th1细胞的细胞毒性及NK细胞的细胞毒作用。因而IL-18具有抗肿瘤、抗感染等作用，但在一些自身免疫性疾病中，如胰岛素依赖性糖尿病[5]、类风湿关节炎[6]等，IL-18的表达量显著增高，另有文献报道，IL-18还是内毒素所致肝损伤的重要诱导因子[3]，表明IL-18参与介导了这些疾病的病理过程。而IL-18BP能抑制IL-18的这种作用，并有类似于IL-18抗体的功能。因此，IL-18BP有可能用于自身免疫性疾病及内毒素所致肝损伤的治疗。@2, 百拇医药
人IL-18BP有164个氨基酸残基组成，含有一段30个氨基酸残基的信号肽及4个N-糖基化位点。鼠的IL-18BP有165个氨基酸残基组成，含一段28个氨基酸残基的信号肽及4个N-糖基化位点。两者的氨基酸序列有60.8%的同源性[1]。人IL-18BP的基因位于染色体11q13[2]，在人的心、肺及胎盘组织中可检测到IL-18BP mRNA的表达[1]。考虑天然IL-18BP有较强的糖基化，故选用哺乳动物细胞质粒表达载体pcDNA3。IL-18BP的表达、纯化及生物学活性的测定将是我们下一步的工作。@2, 百拇医药
NOVICK等[7]曾报道在人的尿液中分离、纯化得到一分子量为38 kd的蛋白质，认为是IL-18的可溶性受体。经氨基酸序列分析，该蛋白就是IL-18BP。但IL-18BP无跨膜区域[1]。而后随着IL-18受体(IL-1Rrp和AcPL)的成功克隆[8，9]，进一步表明了IL-18BP并非IL-18的可溶性受体，而是通过与IL-18结合抑制IL-18与其受体的结合而发挥作用的蛋白质。
图3hIL-18BP cDNA的核苷酸序列-\6w, 百拇医药
Fig 3Nucleotide sequence of hIL-18BP cDNA-\6w, 百拇医药
IL-18BP的克隆成功，有助于进一步研究IL-18BP的功能及其与IL-18的相互关系，也为IL-18BP的临床应用奠定了基础。-\6w, 百拇医药
[作者简介] 傅奕(1975-)，女 ，江苏锡山市人，助教，硕士生，主要从事白介素等细胞因子方面的研究。-\6w, 百拇医药
[参考文献]-\6w, 百拇医药
[1] AIZAWA Y，AKITA K，TANIAI M，et al.Cloning and expression of interleukin-18 binding protein[J].FEBS Lett，1999，445(2，3)：338-342.-\6w, 百拇医药
[2] NOVICK D，KIM SH，FANTUZZI G，et al.Interleukin-18 binding protein：a novel modulator of the Th1 cytokine response[J].Immunity，1999，10(1)：127-136.-\6w, 百拇医药
[3] OKAMURA H，TSUTSUI H，KOMATSU T，et al.Cloning of a new cytokine that induces IFN-γ production by T cells[J].Nature，1995，378(2)：88-91.-\6w, 百拇医药
[4] USHIO S，NAMBA M，OKURA T，et al.Cloning of the cDNA for human IFN-γ- inducing factor，expression in Escherichia coli，and studies on the biologic activities of the protein[J].J Immunol，1996，156(11)：4 274-4 279.-\6w, 百拇医药
[5] ROTHE H，JENKINS NA，COPELAND NG，et al.Active stage of autoimmune diabetes is associated with the expression of a novel cytokine，IGIF，which is located near Idd2[J].J Clin Invest，1997，99(3)：469-474.-\6w, 百拇医药
[6] KOHNO K，KURIMOTO M.Molecule of the month interleukin-18，a cytokine which resembles IL-1 structurally and IL-12 functionally but exerts its effect independently of both[J].Clin Immunol Immunopath，1998，86(1)：11-15.-\6w, 百拇医药
[7] NOVICK D，DINARELLO CA，RUBINSTEIN M.Soluble IL-18 receptor in human urine：characterization and purification (abstract) [J].Cytokine，1997，9：963.-\6w, 百拇医药
[8] TORIGOE K，USHIO S，OKURA T，et al.Purification and characterization of the human interleukin-18 receptor[J].J Biol Chem，1997，272(41)：25 737-25 742.-\6w, 百拇医药
[9] TERESA LB，ELISABETH T，TIMOTHY AB，et al.Cloning of a novel receptor subunit，AcPL，required for interleukin-18 signaling[J].J Biol Chem，1998，273(45)：29 445-29 450.-\6w, 百拇医药
[收稿日期] 1999-12-14； [修回日期] 2000-04-11(傅奕 赵惠仁 裴冬生)
单位：傅奕(徐州医学院生物化学与分子生物学研究中心，江苏 徐州 221002)；赵惠仁(徐州医学院生物化学与分子生物学研究中心，江苏 徐州 221002)；裴冬生(徐州医学院生物化学与分子生物学研究中心，江苏 徐州 221002);, http://www.100md.com
关键词：白细胞介素-18结合蛋白；RT-PCR；cDNA克隆；序列分析;, http://www.100md.com
免疫学杂志000404 [摘 要] 目的 克隆人白介素-18结合蛋白(hIL-18BP)的cDNA，以研究其结构与功能的关系。方法 从中国汉族人的胎盘组织中提取总RNA，以RT-PCR方法扩增出全长585个bp的IL-18BP cDNA，将其与表达载体pcDNA3连接，转化大肠杆菌DH5α，建立了hIL-18BP的cDNA克隆。结果 序列分析表明，与国外文献报道的人IL-18BP的cDNA序列完全一致。结论 hIL-18BP已成功地得到克隆。;, http://www.100md.com
[中图分类号] R392.1 [文献标识码] A;, http://www.100md.com
[文章编号]1000-8861(2000)04-0254-03;, http://www.100md.com
Cloning and sequencing of human IL-18 binding protein cDNA;, http://www.100md.com
FU Yi，ZHAO Hui-ren，PEI Dong-sheng;, http://www.100md.com
(Research Center for Biochemistry and Molecular Biology，Xuzhou Medical College，Xuzhou 221002，China);, http://www.100md.com
[Abstract] Objective To obtain the cDNA of human interleukin-18(IL-18) binding protein(hIL-18BP) and to investigate the relationship between structure and function of hIL-18BP.Methods The total RNA was extracted from human placenta and the intact cDNA of hIL-18BP was amplified by RT-PCR.The cDNA was cloned into pcDNA3 vector and transformed into E.coli DH5α.Results The result of sequencing was completely consistent with the published hIL-18BP cDNA.Conclusion hIL-18BP cDNA has been cloned successfully.
[Key words] interleukin-18 binding protein；RT-PCR；cDNA cloning；DNA sequencing9m21+v2, 百拇医药
IL-18结合蛋白(IL-18BP)是新近发现的一种糖蛋白，系免疫球蛋白超家庭成员。1998年，AIZAWA等[1]首先克隆了小鼠的IL-18BP的cDNA序列，又以小鼠的IL-18BP cDNA作为探针，从正常人肝脏的cDNA文库中筛选出了人的IL-18 BP cDNA。其表达产物能够抑制IL-18诱导Th1等细胞产生IFN-γ、IL-8，还能降低IL-18对NF-κB的激活作用[2]，因此，被认为是IL-18的拮抗剂。为了进一步探讨IL-18BP的结构与功能的关系及其与IL-18相互作用的机制，我们利用RT-PCR的方法首次克隆了中国汉族人的IL-18BP cDNA，并进行了序列分析。9m21+v2, 百拇医药
1 材料与方法9m21+v2, 百拇医药
1.1 主要材料 新鲜的胎盘组织由徐州医学院附属医院妇产科提供；总RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、质粒提取试剂盒均为Promega公司产品；E.coli 菌株DH5α和质粒pcDNA3为本室保存；核酸限制性内切酶EcoR Ⅰ、HindⅢ以及T4DNA连接酶均购自Promega公司。9m21+v2, 百拇医药
1.2 总RNA提取 取液氮冻存的胎盘组织约100 mg，按试剂盒说明书操作，提取总RNA。总RNA沉淀溶于100 μl无核酸酶的水中，-80 °C保存。9m21+v2, 百拇医药
1.3 引物的设计与合成 根据发表的人IL-18BP的cDNA序列，设计PCR引物。上游引物：5’-gcaaagcttatgaccatgagacacaactg-3’，引入了一个Hind Ⅲ酶切位点。下游引物：5’-gcgaattcgtcgacttaaccctgctgctgtggact-3’，引入了一个EcoR Ⅰ酶切位点(加下划线处为酶切位点)。引物由GIBCO BRL公司合成。9m21+v2, 百拇医药
1.4 RT-PCR 加入总RNA 20 μg作为模板，上、下游引物至终浓度1 μmol/L，用Promega公司的RT-PCR系统进行反转录及PCR扩增。反应条件为：94 °C 30 s，61 °C 1 min，68 °C 2 min，40个循环。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。
1.5 cDNA的克隆及扩增 PCR扩增产物经酚-氯仿抽提纯化，HindⅢ和EcoR Ⅰ双酶切及低熔点琼脂糖凝胶电泳回收后，用酚-氯仿抽提纯化。然后与相同酶切并经低熔点琼脂糖凝胶回收纯化的pcDNA3质粒室温连接5 h，用连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，氨苄青平板筛选，37 °C培养过夜。利用pcDNA3中的抗氨苄青基因，筛选出阳性菌落，挑取单克隆菌落，在LB培养基中小量扩增，按Promega公司的试剂盒说明书提取质粒，酶切鉴定。#[&-h2], 百拇医药
1.6 hIL-18BP序列分析 使用ABI377全自动序列分析仪进行测序。#[&-h2], 百拇医药
2 结果#[&-h2], 百拇医药
2.1 IL-18BP的RT-PCR产物分析 将RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，可见一清晰特异扩增带，约600 bp，其大小与理论预期值一致(见图1)。
#[&-h2], 百拇医药图1电泳分析RT-PCR扩增的hIL-18BP cDNA#[&-h2], 百拇医药
Fig 1Electrophoresis of RT-PCR amplified hIL-18BP#[&-h2], 百拇医药
cDNA#[&-h2], 百拇医药
1：1 kb DNA ladder；2：RT-PCR amplified hIL-18BP cDNA#[&-h2], 百拇医药
2.2 人IL-18 BP cDNA克隆与鉴定 RT-PCR产物经Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ双酶切后，与相同酶切的pcDNA3连接，转化E.coli DH5α，经氨苄青平板筛选得到阳性克隆，提取质粒后再经Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ双酶切鉴定，可见约5 kb的载体片段及600 bp的插入片段(见图2)。#[&-h2], 百拇医药
2.3 人IL-18BP序列分析 对经酶切鉴定初步确认的阳性克隆测序。结果如图3所示：其序列与已知的人IL-18BP cDNA序列[1]一致。
#[&-h2], 百拇医药图 2pcDNA/hIL-18BP质粒限制性酶切图谱
Fig 2Restriction enzyme mapping of pcDNA/hIL-18BP@2, 百拇医药
plasmid@2, 百拇医药
1：pcDNA/hIL-18BP digested with Hind Ⅲ and EcoR Ⅰ@2, 百拇医药
2：1 kb DNA ladder@2, 百拇医药
3 讨论@2, 百拇医药
1995年、1996年，OKAMURA[3]和USHIO[4]等先后克隆了鼠和人的IL-18。IL-18是一种多效性的细胞因子，它能刺激Th1细胞分泌IFN-γ、GM-CSF和IL-2，并促进Th1细胞增殖，增强FasL介导的Th1细胞的细胞毒性及NK细胞的细胞毒作用。因而IL-18具有抗肿瘤、抗感染等作用，但在一些自身免疫性疾病中，如胰岛素依赖性糖尿病[5]、类风湿关节炎[6]等，IL-18的表达量显著增高，另有文献报道，IL-18还是内毒素所致肝损伤的重要诱导因子[3]，表明IL-18参与介导了这些疾病的病理过程。而IL-18BP能抑制IL-18的这种作用，并有类似于IL-18抗体的功能。因此，IL-18BP有可能用于自身免疫性疾病及内毒素所致肝损伤的治疗。@2, 百拇医药
人IL-18BP有164个氨基酸残基组成，含有一段30个氨基酸残基的信号肽及4个N-糖基化位点。鼠的IL-18BP有165个氨基酸残基组成，含一段28个氨基酸残基的信号肽及4个N-糖基化位点。两者的氨基酸序列有60.8%的同源性[1]。人IL-18BP的基因位于染色体11q13[2]，在人的心、肺及胎盘组织中可检测到IL-18BP mRNA的表达[1]。考虑天然IL-18BP有较强的糖基化，故选用哺乳动物细胞质粒表达载体pcDNA3。IL-18BP的表达、纯化及生物学活性的测定将是我们下一步的工作。@2, 百拇医药
NOVICK等[7]曾报道在人的尿液中分离、纯化得到一分子量为38 kd的蛋白质，认为是IL-18的可溶性受体。经氨基酸序列分析，该蛋白就是IL-18BP。但IL-18BP无跨膜区域[1]。而后随着IL-18受体(IL-1Rrp和AcPL)的成功克隆[8，9]，进一步表明了IL-18BP并非IL-18的可溶性受体，而是通过与IL-18结合抑制IL-18与其受体的结合而发挥作用的蛋白质。
图3hIL-18BP cDNA的核苷酸序列-\6w, 百拇医药
Fig 3Nucleotide sequence of hIL-18BP cDNA-\6w, 百拇医药
IL-18BP的克隆成功，有助于进一步研究IL-18BP的功能及其与IL-18的相互关系，也为IL-18BP的临床应用奠定了基础。-\6w, 百拇医药
[作者简介] 傅奕(1975-)，女 ，江苏锡山市人，助教，硕士生，主要从事白介素等细胞因子方面的研究。-\6w, 百拇医药
[参考文献]-\6w, 百拇医药
[1] AIZAWA Y，AKITA K，TANIAI M，et al.Cloning and expression of interleukin-18 binding protein[J].FEBS Lett，1999，445(2，3)：338-342.-\6w, 百拇医药
[2] NOVICK D，KIM SH，FANTUZZI G，et al.Interleukin-18 binding protein：a novel modulator of the Th1 cytokine response[J].Immunity，1999，10(1)：127-136.-\6w, 百拇医药
[3] OKAMURA H，TSUTSUI H，KOMATSU T，et al.Cloning of a new cytokine that induces IFN-γ production by T cells[J].Nature，1995，378(2)：88-91.-\6w, 百拇医药
[4] USHIO S，NAMBA M，OKURA T，et al.Cloning of the cDNA for human IFN-γ- inducing factor，expression in Escherichia coli，and studies on the biologic activities of the protein[J].J Immunol，1996，156(11)：4 274-4 279.-\6w, 百拇医药
[5] ROTHE H，JENKINS NA，COPELAND NG，et al.Active stage of autoimmune diabetes is associated with the expression of a novel cytokine，IGIF，which is located near Idd2[J].J Clin Invest，1997，99(3)：469-474.-\6w, 百拇医药
[6] KOHNO K，KURIMOTO M.Molecule of the month interleukin-18，a cytokine which resembles IL-1 structurally and IL-12 functionally but exerts its effect independently of both[J].Clin Immunol Immunopath，1998，86(1)：11-15.-\6w, 百拇医药
[7] NOVICK D，DINARELLO CA，RUBINSTEIN M.Soluble IL-18 receptor in human urine：characterization and purification (abstract) [J].Cytokine，1997，9：963.-\6w, 百拇医药
[8] TORIGOE K，USHIO S，OKURA T，et al.Purification and characterization of the human interleukin-18 receptor[J].J Biol Chem，1997，272(41)：25 737-25 742.-\6w, 百拇医药
[9] TERESA LB，ELISABETH T，TIMOTHY AB，et al.Cloning of a novel receptor subunit，AcPL，required for interleukin-18 signaling[J].J Biol Chem，1998，273(45)：29 445-29 450.-\6w, 百拇医药
[收稿日期] 1999-12-14； [修回日期] 2000-04-11(傅奕 赵惠仁 裴冬生)