新生儿肠道病毒感染的检测及其临床意义
作者：陈宗波 董永绥
单位：同济医科大学附属同济医院儿科，武汉 430030
关键词：肠道病毒；婴儿，新生，疾病
同济医科大学学报000334 中图法分类号 R373.2， R722.1
新生儿肠道病毒(EV)感染常见，但因新生儿疾病症状多不典型，故与其他感染及非感染性 疾病鉴别困难[1，2]。目前，实验诊断主要靠组织培养技术，但繁杂费时，不能普 及。本文通过对住院新生儿脑脊液(CSF)、血清及尿液标本中EV RNA 的检测，旨在了解新 生儿EV感染的特征，并探讨一种有效实用的诊断新生儿EV感染的逆转录聚合酶链反应(RT- PCR)方法。
1 对象与方法
1.1研究对象及标本的收集
, http://www.100md.com
为1996年7月至1997年2月滨州医学院附属医院新生儿病房住院患儿，包括无菌性脑膜炎和有 败血症样表现但血及其他标本细菌培养全部阴性者。其中男14例，女9例，平均日龄12.3 d 。患儿入院当天收集血清及尿液标本，同时做腰穿留CSF。所有标本均做常规检查，细菌及 真菌培养均为阴性。阳性对照为102TCID50柯萨奇 B3(CVB3)加入1 ml CSF 中，阴性对照 为正常CSF和PBS。
1.2 实验方法
1.2.1 EV RNA的提取：采用改良酸性胍-酚-仿一步法[3]。
1.2.2 逆转录合成cDNA和PCR扩增：按常规方法进行。扩增产物检测用20 g/L琼脂糖凝胶 电泳 。引物序列选自EV基因组5′端高度保守区域，上游：446 5′-TCCGGCCCCT
GAATGCCGGCTA A T-3′ 468；下游:625 5′-CACCGGAT
, 百拇医药
GGCCAATCCA-3′ 642 。我们已有实验证实[ 4]，用该引物临床常见的42个血清型的EV标准毒株(CVA 1，2，7，9，16；CVB1-6；埃 柯病毒1-9，11，12，14-23，25，26，30，31，33；EV70，71；脊髓灰质炎病毒1-3)均 可被成功地扩增。而对照组的单纯疱疹病毒1型，流行性腮腺炎病毒，乙型脑炎病毒，人巨 细胞病毒检测结果均为阴性。说明所用方法特异可靠。
1.2.3 病毒培养及分型鉴定：CSF、血清及尿液标本分别接种单层Hela和人胚肺细胞，分 离病毒后采用标准中和实验分组鉴定EV的血清型[5]。
2 结果
23 例新生儿中，RT-PCR检测阳性15 例(65.2%)，其中CSF阳性13例，血清阳性8例，尿 液阳性5例；病毒分离阳性8例(34.8%)，其中CSF阳性7例，血清阳性4例，尿液阳性2例。 两种方法比较，RT-PCR敏感性高于病毒培养(χ2=4.26,P<0.05)。病毒分离阳性 者RT-PCR均阳性，而病毒分离阴性的15例中，7例RT-PCR阳性，占46.7%。7例恢复期的CS F、血清及尿液标本，只有1例CSF RT-PCR仍可测的EV RNA，而病毒培养均为阴性。3例出院 1月后复查血清及尿液均为阴性。23例新生儿中，临床诊断为无菌性脑膜炎16例，RT-PCR检 测CSF中EV PCR 阳性11例(68.8%)，4例同时血清中阳性(25.0%)，3例同时尿液中阳性( 18.8%)；败血症9例，血清中EV RNA阳性6例(66.7%)，5例同时CSF 中阳性(55.6%)，4 例同时尿液中阳性(44.4%)。病毒分离共得5个血清型，CVB2型3例，埃柯(Echo)6型2 例，Echo11、CVA9及CVB5各1例。同一病人的各种标本分离的病毒型别一致。
, 百拇医药
3 讨论
新生儿肠道病毒感染常见，本实验显示RT-PCR的敏感性明显高于细胞培养(P<0.05) 。23例新生儿中，RT-PCR诊断EV感染15例，从细胞培养结果来看，有CVB2、5；Echo6、11 及CVA9型肠道病毒感染，并且各种标本分离得EV型别一致。临床诊断为无菌性脑膜炎的16例 患儿中，RT-PCR检测11例CSF中EV RNA阳性，4例同时血清中阳性；9例败血症样患儿中，6 例血清中EV RNA 阳性，5例同时CSF阳性。说明脑膜炎患儿部分病人存在着病毒血症；败血 症样患儿CSF中EV RNA检出率较高。这可能与新生儿期屏障及免疫功能不完善，病毒感染后 易在全身多器官中播散有关。
现址：山东省青岛市海慈医院儿科，青岛 266000
参 考 文 献
1，Jenista J A, Powell K R, Menegus M A. Epidemiology of neonat al enterovirus infection. J Pediatr, 1984,104:6686
, 百拇医药
2，Abzug M J, Levin M J, Rotbart H A. Profile of enterovirus d isease in the first two weeks of life. Pediatr Infect Dis J, 1993,1 2:820
3，陈宗波，董永绥，方 峰等. 一种从脑脊液中提取病毒RNA和DNA的新方法. 中 华医学检验杂志，1998，21(2)：108
4，陈宗波，董永绥. 应用逆转录多聚酶链反映检测肠道病毒感染. 中华儿科杂志 ，1997，35：597
5，im K A, Benyesh-Melnick M. Typing of Viruses by combinati on of antiserum pools: application to traping of enteroviruses(coxsackie and echo). J Immunol, 1960,84:309
(1999-10-18 收稿), 百拇医药
单位：同济医科大学附属同济医院儿科，武汉 430030
关键词：肠道病毒；婴儿，新生，疾病
同济医科大学学报000334 中图法分类号 R373.2， R722.1
新生儿肠道病毒(EV)感染常见，但因新生儿疾病症状多不典型，故与其他感染及非感染性 疾病鉴别困难[1，2]。目前，实验诊断主要靠组织培养技术，但繁杂费时，不能普 及。本文通过对住院新生儿脑脊液(CSF)、血清及尿液标本中EV RNA 的检测，旨在了解新 生儿EV感染的特征，并探讨一种有效实用的诊断新生儿EV感染的逆转录聚合酶链反应(RT- PCR)方法。
1 对象与方法
1.1研究对象及标本的收集
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为1996年7月至1997年2月滨州医学院附属医院新生儿病房住院患儿，包括无菌性脑膜炎和有 败血症样表现但血及其他标本细菌培养全部阴性者。其中男14例，女9例，平均日龄12.3 d 。患儿入院当天收集血清及尿液标本，同时做腰穿留CSF。所有标本均做常规检查，细菌及 真菌培养均为阴性。阳性对照为102TCID50柯萨奇 B3(CVB3)加入1 ml CSF 中，阴性对照 为正常CSF和PBS。
1.2 实验方法
1.2.1 EV RNA的提取：采用改良酸性胍-酚-仿一步法[3]。
1.2.2 逆转录合成cDNA和PCR扩增：按常规方法进行。扩增产物检测用20 g/L琼脂糖凝胶 电泳 。引物序列选自EV基因组5′端高度保守区域，上游：446 5′-TCCGGCCCCT
GAATGCCGGCTA A T-3′ 468；下游:625 5′-CACCGGAT
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GGCCAATCCA-3′ 642 。我们已有实验证实[ 4]，用该引物临床常见的42个血清型的EV标准毒株(CVA 1，2，7，9，16；CVB1-6；埃 柯病毒1-9，11，12，14-23，25，26，30，31，33；EV70，71；脊髓灰质炎病毒1-3)均 可被成功地扩增。而对照组的单纯疱疹病毒1型，流行性腮腺炎病毒，乙型脑炎病毒，人巨 细胞病毒检测结果均为阴性。说明所用方法特异可靠。
1.2.3 病毒培养及分型鉴定：CSF、血清及尿液标本分别接种单层Hela和人胚肺细胞，分 离病毒后采用标准中和实验分组鉴定EV的血清型[5]。
2 结果
23 例新生儿中，RT-PCR检测阳性15 例(65.2%)，其中CSF阳性13例，血清阳性8例，尿 液阳性5例；病毒分离阳性8例(34.8%)，其中CSF阳性7例，血清阳性4例，尿液阳性2例。 两种方法比较，RT-PCR敏感性高于病毒培养(χ2=4.26,P<0.05)。病毒分离阳性 者RT-PCR均阳性，而病毒分离阴性的15例中，7例RT-PCR阳性，占46.7%。7例恢复期的CS F、血清及尿液标本，只有1例CSF RT-PCR仍可测的EV RNA，而病毒培养均为阴性。3例出院 1月后复查血清及尿液均为阴性。23例新生儿中，临床诊断为无菌性脑膜炎16例，RT-PCR检 测CSF中EV PCR 阳性11例(68.8%)，4例同时血清中阳性(25.0%)，3例同时尿液中阳性( 18.8%)；败血症9例，血清中EV RNA阳性6例(66.7%)，5例同时CSF 中阳性(55.6%)，4 例同时尿液中阳性(44.4%)。病毒分离共得5个血清型，CVB2型3例，埃柯(Echo)6型2 例，Echo11、CVA9及CVB5各1例。同一病人的各种标本分离的病毒型别一致。
, 百拇医药
3 讨论
新生儿肠道病毒感染常见，本实验显示RT-PCR的敏感性明显高于细胞培养(P<0.05) 。23例新生儿中，RT-PCR诊断EV感染15例，从细胞培养结果来看，有CVB2、5；Echo6、11 及CVA9型肠道病毒感染，并且各种标本分离得EV型别一致。临床诊断为无菌性脑膜炎的16例 患儿中，RT-PCR检测11例CSF中EV RNA阳性，4例同时血清中阳性；9例败血症样患儿中，6 例血清中EV RNA 阳性，5例同时CSF阳性。说明脑膜炎患儿部分病人存在着病毒血症；败血 症样患儿CSF中EV RNA检出率较高。这可能与新生儿期屏障及免疫功能不完善，病毒感染后 易在全身多器官中播散有关。
现址：山东省青岛市海慈医院儿科，青岛 266000
参 考 文 献
1，Jenista J A, Powell K R, Menegus M A. Epidemiology of neonat al enterovirus infection. J Pediatr, 1984,104:6686
, 百拇医药
2，Abzug M J, Levin M J, Rotbart H A. Profile of enterovirus d isease in the first two weeks of life. Pediatr Infect Dis J, 1993,1 2:820
3，陈宗波，董永绥，方 峰等. 一种从脑脊液中提取病毒RNA和DNA的新方法. 中 华医学检验杂志，1998，21(2)：108
4，陈宗波，董永绥. 应用逆转录多聚酶链反映检测肠道病毒感染. 中华儿科杂志 ，1997，35：597
5，im K A, Benyesh-Melnick M. Typing of Viruses by combinati on of antiserum pools: application to traping of enteroviruses(coxsackie and echo). J Immunol, 1960,84:309
(1999-10-18 收稿), 百拇医药