聚合酶链反应微孔酶免疫法检测新型隐球菌
作者：于文彬 张建芳 苏明权 马越云 刘家云 范金水 丁振若
单位：第四军医大学西京医院检验科，陕西 西安710033
关键词：新型隐球菌；聚合酶链反应；酶免疫法
第四军医大学学报001022 摘 要： 目的 建立一种检测脑膜炎新型隐球菌聚合酶链反应(PCR)产物的微孔酶免疫方法. 方法 对PCR所用2条引物进行双标记，使扩增产物一端标记上生物素，另一端标记上地高辛，通过包被在微孔板上的亲和素捕获固定，然后用碱性磷酸酶标记的地高辛抗体反应后显色测定. 结果 三种PCR产物检测方法的对照分析表明微孔板酶免疫法敏感性最强，加样量38 nL时即可显色，模板DNA经过1011倍稀释后仍为阳性结果；聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖电泳则分别可检测到0.3125 μL，1.25 μL 及107，104稀释度. 对临床脑脊液标本的检测结果微孔板酶免疫法和聚丙烯酰胺凝胶电泳的符合率为100%，二者敏感性均高于琼脂糖电泳. 结论 建立的方法与常规电泳法相比灵敏准确，结果判断客观，重复性也较好；所测结果可相对反应PCR产物量的多少,此方法可取代电泳法成为常规检测PCR产物的方法.
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中图号：R379.5 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)10-1241-03
Experimental research on detecting PCR products of cyrptococcal neoformans by PCR micro-titer EIA
YU Wen-Bin, ZHANG Jian-Fang, SU Ming-Quan, MA Yue-Yun, LIU Jia-Yun, FAN Jin-Shui, DING Zhen-Ruo
(Department of Clinical Laboratory, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
, 百拇医药
Abstract：AIM To establish a micro-titer EIA for detecting PCR products of cyrptococcal neoformans. METHODS The primers were modified so that the two terminals of PCR products were labeled with biotin and digoxin respectively.The products were captured by the streptavidin coated in the micro-titer wells.Then anti-dig antibody-AP conjugates were added into the wells. After washing, the NBT-BCIP were added and then readings of the micro-titers were measured. RESULTS Compared with routine gel electrophoresis, the sensitivity of micro-titer EIA was much higher. It could detect precisely even when loaded with 38 nL positive PCR products and after the positive template had been diluted 1011 times. Polyacrylamide and agarose gel electrophoresis can detect 0.3125 μL,1.25 μL and 107,104 times respectively. The corresponding rate of EIA and polyacrylamide gel electrophoresis was 100% when 15 clinical samples were detected. CONCLUSION The established PCR-EIA was sensitive and accurate.The absorbance of EIA were correlated with the volume of the products.The established method may be used as a routine method for detecting the products of PCR of cyrptococcal neoformans instead of electrophoresis technique.
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Keywords：cyrptococcal neoformans; polymerase chain reaction; enzyme immunoassay
0 引言
新型隐球菌是一种条件致病性真菌，近年来，由于激素、抗生素及免疫抑制剂的应用，造成免疫功能低下成为隐球菌病的主要诱因，使其感染逐年增长. 长期以来对新型隐球菌的实验诊断主要依据墨汁复染、分离培养，早期阳性率低且耗时长，能检出病原体时病已严重，达不到早期诊断和治疗的目的. 根据我们已报道的新型隐球菌特异性引物序列，设计相对应的寡核苷酸探针，将特异性引物5′端标记，建立PCR微孔酶免疫检测方法[1,2]，用于新型隐球菌脑膜炎的快速诊断，从而达到量化分析.
1 材料和方法
1.1 材料 新型隐球菌为西京医院检验科细菌室保存菌株. 15份脑脊液标本为已确诊的隐球菌脑膜炎患者，由西京医院神经内科谭庆荣教授提供. 根据我们已报道[1]的新型隐球菌特异性引物序列，扩增片段426 bp，引物序列如下：CN1 5′ bio-TAC TGC TAC AAC AGG AAG G-3′ CN2 5′ dig-TAA GAC CTC TGA ACA CCG-3′引物由上海生工生物技术公司合成，在合成时CN1 5′端标记生物素，CN2 5′端标记地高辛. Taq DNA聚合酶、4×dNTP购自华美生物工程公司；Streptavidin购自Promega 公司；PE-480扩增仪购自美国PE公司；紫外检测仪购自上海永嘉仪器厂；酶标仪为Labsystem型；碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体购自Boehringer Mannheim公司；电泳仪为北京六一仪器厂产品.
, 百拇医药
1.2 方法 将新型隐球菌菌株接种于含氯霉素的沙氏肉汤培养基中，50 mL*L-1CO2条件下培养48 h，4000 r*min-1，离心10 m in，收集菌体，用TNE缓冲液洗涤1次，将沉淀混悬于200 μL含250 g*L-1蔗糖的TNE缓冲液中，加蛋白酶K 10 mg*L-1，37℃处理30 min；然后加10 g*L-1 SDS处理30 min，用等体积的酚：氯仿：异戊醇(25∶24∶1)抽提2次，冷乙醇沉淀提取新型隐球菌DNA，真空干燥，TE溶解备用. 取待检脑脊液200 μL，12 000 g离心5 min,弃上清，沉淀中加碱性裂解液(2 mmol*L-1 NaOH,1 mL*L-1吐温-20，1 mL*L-1 Triton-X100，1 mL*L-1 NP-40)98℃ 10 min,12 000 g离心5 min，取上清做模板DNA. PCR扩增反应总体积为25 μL,包括10×PCR缓冲液2.5 μL,4×dNTP 1.5 μL,引物CN1,CN2各0.25 μL,无菌去离子水9.5 μL,模板DNA 10 μL,Taq DNA聚合酶1 U,以无菌石蜡油30 μL覆盖,行PCR循环,循环参数为:95℃ 5 min,94℃ 1 min,58℃ 1 min,72℃ 1 min,32个循环,最后72℃延伸5 min.
, 百拇医药
1.2.1 微孔板酶免疫法检测 ①包被：将Streptavidin以5 mg*L-1溶于包被液(0.01 mol*L-1碳酸盐缓冲液，pH 9.6,含鲑精DNA 200 mg*L-1)中，50 μL每孔加入微孔板中4℃包被过夜； ②杂交反应：甩干微孔板，加入用样品稀释液(0.01 mol*L-1的磷酸盐缓冲液，含鲑精DNA 200 mg*L-1，BSA 3 g*L-1)稀释20倍的PCR反应产物50 μL,37℃孵育1 h,用洗液(0.01 mol*L-1的Tris-HCl,pH 7.5,含0.5 mL*L-1的吐温-20)洗板5 min×3次，然后加入碱性磷酸酶标记的地高辛抗体50 μL(0.4 u/孔)，37℃孵育0.5 h，洗板5 min×3次； ③显色反应：加入碱性磷酸酶显色底物NBT-BCIP 50 μL室温避光反应4 h后加入终止液，酶标仪测620 nm吸光度(A620 nm)，以空白孔调零； ④结果判定：测定孔A620 nm大于阴性对照孔2.1倍以上为阳性. 阴性对照孔A620 nm大于0.05时按实际值计，小于0.05时按0.05计.
, 百拇医药
1.2.2 电泳检测 PCR扩增产物分别用20 g*L-1琼脂糖电泳100 V 30 min，60 g*L-1聚丙烯酰胺凝胶电泳100 V 2 h，EB染色后紫外灯下观察结果. 出现特异性条带者为阳性.
2 结果
2.1 产物量与A620相关性 取5 μL阳性扩增产物倍比稀释后分别用微孔酶免疫法,60 g*L-1聚丙烯酰胺凝胶电泳及20 g*L-1的琼脂糖电泳检测. 结果发现倍比稀释下肉眼可看到前8孔均显色，比色其A620及电泳结果(Tab 1).
2.2 模板量与A620相关性 取1 μL阳性扩增产物，1∶10倍比稀释不同倍数后进行PCR扩增，产物用微孔酶免疫法检测，同时用聚丙烯酰胺凝胶电泳及琼脂糖凝胶电泳检测(Tab 2).
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表 1 产物量与A620检测结果
Tab 1 Correlation between contents of PCR products and obtained A620
CP (nL)
5000
2500
1250
625
312
150
75
38
, 百拇医药
19
1
Negative
A620
0.199
0.173
0.170
0.164
0.163
0.138
0.130
0.127
0.090
, 百拇医药
0.056
0.038
PGE
+
+
+
+
±
-
-
-
-
-
-
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AGE
+
+
±
-
-
-
-
-
-
-
-
表 2 模板DNA量与A620检测结果
, 百拇医药
Tab 2 Correlation between contents of template DNA and obtained A620
DT
101
102
103
104
105
106
107
, 百拇医药 108
109
1010
1011
1012
A620
0.182
0.175
0.185
0.174
0.143
, 百拇医药 0.170
0.171
0.174
0.156
0.138
0.127
0.069
PGE
+
+
+
+
+
, 百拇医药
+
+
-
-
-
-
-
AGE
+
+
+
+
-
-
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-
-
-
-
-
-
CP: contents of PCR products; DT: diluted times of template DNA.
2.3 临床标本的检测 对15份已确诊为隐球菌脑膜炎患者的脑脊液进行PCR扩增，产物分别用微孔板法、琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测. 结果微孔板法与聚丙烯酰胺凝胶电泳的阳性率均为100%(15/15). 琼脂糖电泳阳性率为93.3%(14/15).
3 讨论
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随着临床分子生物学技术的发展和应用，PCR技术已经发展成为一种较成熟而又敏感快速的临床诊断方法[3]，为感染疾病、遗传性疾病等的诊断提供了精确的诊断依据. 在PCR扩增产物的检测中，常用电泳分析法有：琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳. 琼脂糖电泳制备简便，但分辨力差；聚丙烯酰胺电泳虽然分辨力高，但操作繁琐且技术要求高，电泳时间长. 两种电泳法都需要溴化乙锭这种毒性很强的物质染色，紫外灯下观察，结果判定主观性强且易对人体造成损伤. 样品量多时(几十个或上百个)，操作更是繁琐，工作量大大增加，而且电泳法不利于自动化设计，这都在一定程度上限制了PCR在临床检验中的普及应用.
近年来，为使PCR技术更其标准完善，对PCR检测结果分析正逐步由定性分析向半定量定量分析方向发展[4]，目前发展起来的定量分析方法，主要以荧光标记跟踪法；反向杂交法及酶免疫法等[5-7]. 我们对特异性引物进行正链5′端标记生物素，负链 5′端标记地高辛，建立检测PCR产物的微孔酶免疫法方法，对新型隐球菌扩增产物进行半定量分析，其优点：应用微孔酶免疫法对批量临床标本检测比较简便，又消除了溴化乙锭染色的污染，而且不必在紫外线照射下工作，更利于将来应用于自动化分析系统. 同时又保持了同聚丙烯酰胺凝胶电泳相同甚至更高的分辨力和灵敏度，结果判定客观可靠，从某种程度上吸光度的大小可相对反映产物量的多少，在一定程度上克服了电泳法分析的不足之处.
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本结果显示，随检测时所用PCR产物量的减少，A620也逐渐下降，二者存在一定的相关性. 这说明，用酶免疫法检测时吸光度的大小可反映PCR产物量的多少. 但模板量与吸光度的相关性分析结果却表明：尽管模板经过了109倍的稀释，其吸光度(0.156)与10倍稀释时(0.182)仍无显著性差异. 这说明通过目前的方法尚不能对扩增时的模板进行定量分析，有必要重新设置PCR反应参数，使其扩增在达到平台期之前结束，以期达到定量分析标本中病原体遗传物质的目的.
对3种PCR产物检测方法的对照分析表明微孔酶免疫法敏感性最强，加PCR产物38 nL时即可显色，模板DNA经过1011倍稀释后仍为阳性结果；聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖电泳则分别可检测到0.3125 μL，1.25 μL 及107，104稀释度. 对临床脑脊液标本的检测结果微孔酶免疫法和聚丙烯酰胺凝胶电泳的符合率为100%，二者敏感性均高于琼脂糖电泳. 所以，微孔酶免疫法可取代电泳法成为常规的PCR产物检测方法.
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基金项目：陕西省科技发展研究计划资助项目(1997K12)
作者简介：于文彬(1944-)，男(汉族)，山东省潍坊市人. 1969年上海医科大学医学系毕业，检验科主任、教授，硕士研究生导师，陕西省检验学会副主任委员. 发表论文30篇. Tel.(029)3375455
参考文献：
[1] 苏明权，马越云，谭庆荣et al. 新型隐球菌聚合酶链反应的检测方法.[J] 第四军医大学学报，1997；18(4)：336-338.
[2] Kawai S,Maekawajiri S,Yamane A. Asimple method of detecting amplified DNA with immunobilized probes on microtiter wells[J]. Anal Biochem, 1993;209(1):63-69.
, 百拇医药
[3] He YL,Coutlee F, Saint P et al[J]. Clin Microbiol, 1993;31(5):1040-1047.
[4] Nelson S,Matlow A, McDowell C et al.Detection of bordetella pertussis in clinical specimen by PCR and a microtiter plate-based DNA hybridization[J]. Clin Microbiol, 1997;35(1):117-125.
[5] 杨正林，杨瑞馥，杜 琼et al. 聚合酶链反应微孔板杂交技术用于结核分枝杆菌的检测[J]. 中华医学检验杂志，1998；21(5)：285-287.
[6] 仝文斌，张春英，费 然 et al. 酶免疫法检测丙型肝炎病毒RNA的聚合酶链反应产物[J]. 中华医学检验杂志，1998；21(2)：88-91.
[7] 张东华，陆志檬，金根梯. PCR 扩增杂交试验检测HCV-RNA[J]. 上海医学,1998；21(5)：266-267.
收稿日期:2000-03-10; 修回日期:2000-06-05, http://www.100md.com
单位：第四军医大学西京医院检验科，陕西 西安710033
关键词：新型隐球菌；聚合酶链反应；酶免疫法
第四军医大学学报001022 摘 要： 目的 建立一种检测脑膜炎新型隐球菌聚合酶链反应(PCR)产物的微孔酶免疫方法. 方法 对PCR所用2条引物进行双标记，使扩增产物一端标记上生物素，另一端标记上地高辛，通过包被在微孔板上的亲和素捕获固定，然后用碱性磷酸酶标记的地高辛抗体反应后显色测定. 结果 三种PCR产物检测方法的对照分析表明微孔板酶免疫法敏感性最强，加样量38 nL时即可显色，模板DNA经过1011倍稀释后仍为阳性结果；聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖电泳则分别可检测到0.3125 μL，1.25 μL 及107，104稀释度. 对临床脑脊液标本的检测结果微孔板酶免疫法和聚丙烯酰胺凝胶电泳的符合率为100%，二者敏感性均高于琼脂糖电泳. 结论 建立的方法与常规电泳法相比灵敏准确，结果判断客观，重复性也较好；所测结果可相对反应PCR产物量的多少,此方法可取代电泳法成为常规检测PCR产物的方法.
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中图号：R379.5 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)10-1241-03
Experimental research on detecting PCR products of cyrptococcal neoformans by PCR micro-titer EIA
YU Wen-Bin, ZHANG Jian-Fang, SU Ming-Quan, MA Yue-Yun, LIU Jia-Yun, FAN Jin-Shui, DING Zhen-Ruo
(Department of Clinical Laboratory, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
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Abstract：AIM To establish a micro-titer EIA for detecting PCR products of cyrptococcal neoformans. METHODS The primers were modified so that the two terminals of PCR products were labeled with biotin and digoxin respectively.The products were captured by the streptavidin coated in the micro-titer wells.Then anti-dig antibody-AP conjugates were added into the wells. After washing, the NBT-BCIP were added and then readings of the micro-titers were measured. RESULTS Compared with routine gel electrophoresis, the sensitivity of micro-titer EIA was much higher. It could detect precisely even when loaded with 38 nL positive PCR products and after the positive template had been diluted 1011 times. Polyacrylamide and agarose gel electrophoresis can detect 0.3125 μL,1.25 μL and 107,104 times respectively. The corresponding rate of EIA and polyacrylamide gel electrophoresis was 100% when 15 clinical samples were detected. CONCLUSION The established PCR-EIA was sensitive and accurate.The absorbance of EIA were correlated with the volume of the products.The established method may be used as a routine method for detecting the products of PCR of cyrptococcal neoformans instead of electrophoresis technique.
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Keywords：cyrptococcal neoformans; polymerase chain reaction; enzyme immunoassay
0 引言
新型隐球菌是一种条件致病性真菌，近年来，由于激素、抗生素及免疫抑制剂的应用，造成免疫功能低下成为隐球菌病的主要诱因，使其感染逐年增长. 长期以来对新型隐球菌的实验诊断主要依据墨汁复染、分离培养，早期阳性率低且耗时长，能检出病原体时病已严重，达不到早期诊断和治疗的目的. 根据我们已报道的新型隐球菌特异性引物序列，设计相对应的寡核苷酸探针，将特异性引物5′端标记，建立PCR微孔酶免疫检测方法[1,2]，用于新型隐球菌脑膜炎的快速诊断，从而达到量化分析.
1 材料和方法
1.1 材料 新型隐球菌为西京医院检验科细菌室保存菌株. 15份脑脊液标本为已确诊的隐球菌脑膜炎患者，由西京医院神经内科谭庆荣教授提供. 根据我们已报道[1]的新型隐球菌特异性引物序列，扩增片段426 bp，引物序列如下：CN1 5′ bio-TAC TGC TAC AAC AGG AAG G-3′ CN2 5′ dig-TAA GAC CTC TGA ACA CCG-3′引物由上海生工生物技术公司合成，在合成时CN1 5′端标记生物素，CN2 5′端标记地高辛. Taq DNA聚合酶、4×dNTP购自华美生物工程公司；Streptavidin购自Promega 公司；PE-480扩增仪购自美国PE公司；紫外检测仪购自上海永嘉仪器厂；酶标仪为Labsystem型；碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体购自Boehringer Mannheim公司；电泳仪为北京六一仪器厂产品.
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1.2 方法 将新型隐球菌菌株接种于含氯霉素的沙氏肉汤培养基中，50 mL*L-1CO2条件下培养48 h，4000 r*min-1，离心10 m in，收集菌体，用TNE缓冲液洗涤1次，将沉淀混悬于200 μL含250 g*L-1蔗糖的TNE缓冲液中，加蛋白酶K 10 mg*L-1，37℃处理30 min；然后加10 g*L-1 SDS处理30 min，用等体积的酚：氯仿：异戊醇(25∶24∶1)抽提2次，冷乙醇沉淀提取新型隐球菌DNA，真空干燥，TE溶解备用. 取待检脑脊液200 μL，12 000 g离心5 min,弃上清，沉淀中加碱性裂解液(2 mmol*L-1 NaOH,1 mL*L-1吐温-20，1 mL*L-1 Triton-X100，1 mL*L-1 NP-40)98℃ 10 min,12 000 g离心5 min，取上清做模板DNA. PCR扩增反应总体积为25 μL,包括10×PCR缓冲液2.5 μL,4×dNTP 1.5 μL,引物CN1,CN2各0.25 μL,无菌去离子水9.5 μL,模板DNA 10 μL,Taq DNA聚合酶1 U,以无菌石蜡油30 μL覆盖,行PCR循环,循环参数为:95℃ 5 min,94℃ 1 min,58℃ 1 min,72℃ 1 min,32个循环,最后72℃延伸5 min.
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1.2.1 微孔板酶免疫法检测 ①包被：将Streptavidin以5 mg*L-1溶于包被液(0.01 mol*L-1碳酸盐缓冲液，pH 9.6,含鲑精DNA 200 mg*L-1)中，50 μL每孔加入微孔板中4℃包被过夜； ②杂交反应：甩干微孔板，加入用样品稀释液(0.01 mol*L-1的磷酸盐缓冲液，含鲑精DNA 200 mg*L-1，BSA 3 g*L-1)稀释20倍的PCR反应产物50 μL,37℃孵育1 h,用洗液(0.01 mol*L-1的Tris-HCl,pH 7.5,含0.5 mL*L-1的吐温-20)洗板5 min×3次，然后加入碱性磷酸酶标记的地高辛抗体50 μL(0.4 u/孔)，37℃孵育0.5 h，洗板5 min×3次； ③显色反应：加入碱性磷酸酶显色底物NBT-BCIP 50 μL室温避光反应4 h后加入终止液，酶标仪测620 nm吸光度(A620 nm)，以空白孔调零； ④结果判定：测定孔A620 nm大于阴性对照孔2.1倍以上为阳性. 阴性对照孔A620 nm大于0.05时按实际值计，小于0.05时按0.05计.
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1.2.2 电泳检测 PCR扩增产物分别用20 g*L-1琼脂糖电泳100 V 30 min，60 g*L-1聚丙烯酰胺凝胶电泳100 V 2 h，EB染色后紫外灯下观察结果. 出现特异性条带者为阳性.
2 结果
2.1 产物量与A620相关性 取5 μL阳性扩增产物倍比稀释后分别用微孔酶免疫法,60 g*L-1聚丙烯酰胺凝胶电泳及20 g*L-1的琼脂糖电泳检测. 结果发现倍比稀释下肉眼可看到前8孔均显色，比色其A620及电泳结果(Tab 1).
2.2 模板量与A620相关性 取1 μL阳性扩增产物，1∶10倍比稀释不同倍数后进行PCR扩增，产物用微孔酶免疫法检测，同时用聚丙烯酰胺凝胶电泳及琼脂糖凝胶电泳检测(Tab 2).
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表 1 产物量与A620检测结果
Tab 1 Correlation between contents of PCR products and obtained A620
CP (nL)
5000
2500
1250
625
312
150
75
38
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19
1
Negative
A620
0.199
0.173
0.170
0.164
0.163
0.138
0.130
0.127
0.090
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0.056
0.038
PGE
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±
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AGE
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表 2 模板DNA量与A620检测结果
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Tab 2 Correlation between contents of template DNA and obtained A620
DT
101
102
103
104
105
106
107
, 百拇医药 108
109
1010
1011
1012
A620
0.182
0.175
0.185
0.174
0.143
, 百拇医药 0.170
0.171
0.174
0.156
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0.127
0.069
PGE
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CP: contents of PCR products; DT: diluted times of template DNA.
2.3 临床标本的检测 对15份已确诊为隐球菌脑膜炎患者的脑脊液进行PCR扩增，产物分别用微孔板法、琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测. 结果微孔板法与聚丙烯酰胺凝胶电泳的阳性率均为100%(15/15). 琼脂糖电泳阳性率为93.3%(14/15).
3 讨论
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随着临床分子生物学技术的发展和应用，PCR技术已经发展成为一种较成熟而又敏感快速的临床诊断方法[3]，为感染疾病、遗传性疾病等的诊断提供了精确的诊断依据. 在PCR扩增产物的检测中，常用电泳分析法有：琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳. 琼脂糖电泳制备简便，但分辨力差；聚丙烯酰胺电泳虽然分辨力高，但操作繁琐且技术要求高，电泳时间长. 两种电泳法都需要溴化乙锭这种毒性很强的物质染色，紫外灯下观察，结果判定主观性强且易对人体造成损伤. 样品量多时(几十个或上百个)，操作更是繁琐，工作量大大增加，而且电泳法不利于自动化设计，这都在一定程度上限制了PCR在临床检验中的普及应用.
近年来，为使PCR技术更其标准完善，对PCR检测结果分析正逐步由定性分析向半定量定量分析方向发展[4]，目前发展起来的定量分析方法，主要以荧光标记跟踪法；反向杂交法及酶免疫法等[5-7]. 我们对特异性引物进行正链5′端标记生物素，负链 5′端标记地高辛，建立检测PCR产物的微孔酶免疫法方法，对新型隐球菌扩增产物进行半定量分析，其优点：应用微孔酶免疫法对批量临床标本检测比较简便，又消除了溴化乙锭染色的污染，而且不必在紫外线照射下工作，更利于将来应用于自动化分析系统. 同时又保持了同聚丙烯酰胺凝胶电泳相同甚至更高的分辨力和灵敏度，结果判定客观可靠，从某种程度上吸光度的大小可相对反映产物量的多少，在一定程度上克服了电泳法分析的不足之处.
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本结果显示，随检测时所用PCR产物量的减少，A620也逐渐下降，二者存在一定的相关性. 这说明，用酶免疫法检测时吸光度的大小可反映PCR产物量的多少. 但模板量与吸光度的相关性分析结果却表明：尽管模板经过了109倍的稀释，其吸光度(0.156)与10倍稀释时(0.182)仍无显著性差异. 这说明通过目前的方法尚不能对扩增时的模板进行定量分析，有必要重新设置PCR反应参数，使其扩增在达到平台期之前结束，以期达到定量分析标本中病原体遗传物质的目的.
对3种PCR产物检测方法的对照分析表明微孔酶免疫法敏感性最强，加PCR产物38 nL时即可显色，模板DNA经过1011倍稀释后仍为阳性结果；聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖电泳则分别可检测到0.3125 μL，1.25 μL 及107，104稀释度. 对临床脑脊液标本的检测结果微孔酶免疫法和聚丙烯酰胺凝胶电泳的符合率为100%，二者敏感性均高于琼脂糖电泳. 所以，微孔酶免疫法可取代电泳法成为常规的PCR产物检测方法.
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基金项目：陕西省科技发展研究计划资助项目(1997K12)
作者简介：于文彬(1944-)，男(汉族)，山东省潍坊市人. 1969年上海医科大学医学系毕业，检验科主任、教授，硕士研究生导师，陕西省检验学会副主任委员. 发表论文30篇. Tel.(029)3375455
参考文献：
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收稿日期:2000-03-10; 修回日期:2000-06-05, http://www.100md.com