16S-23S rDNA间隔区序列寡核苷酸探针对结核患者痰标本的检测
作者：张灵霞 庄玉辉 杨华卫 李邦印 夏湘萱
单位：中国人民解放军309医院结核病研究室 100091
关键词：结核病；16S-23S；rDNA间隔区；寡核苷酸探针；斑点杂交
广东医学000816
【摘要】 目的 应用结核分枝杆菌特异的寡核苷酸探针杂交检测结核患者痰标本中的结核分枝杆菌，以评价其在临床应用中的价值。 方法 对生物素标记5’-端的一个20bp的寡核苷酸探针的敏感性、特异性的研究，并应用该探针对90例结核患者和30例非结核患者痰标本进行了检测。 结果 寡核苷酸探针分别检测基因组DNA、350bp PCR扩增产物、250bp PCR扩增产物的敏感性分别为55 ng，0.5 ng，0.1 ng。探针检测特异性实验表明探针检测基因组DNA、350bp PCR扩增产物特异性较差，检测250bp PCR扩增产物则只与结核分枝杆菌杂交。探针检测90例结核患者痰标本结果表明：探针杂交检测临床标本基因组DNA、350bp PCR扩增产物、250bp PCR扩增产物的阳性率分别为33%、83%、80%，而扩增产物电泳阳性率为64%。寡核苷酸探针与30例非结核患者痰标本基因组DNA及PCR扩增产物杂交则全为阴性。 结论 寡核苷酸探针化学发光检测临床标本250bp PCR扩增产物，能提高结核患者痰标本检测的敏感性与特异性。
, 百拇医药
在对16S-23S rDNA间隔区序列进行系统研究的基础上，根据测序结果，选择碱基差异序列设计了一个20bp的寡核苷酸序列，用生物素对其5’-端进行标记，以辣根过氧化物酶催化的化学发光呈色反应，对120例痰标本进行直接检测，现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 菌种来源 24种分枝杆菌来自中国药品生物制品检定所，11种非结核分枝杆菌来自中国科学院微生物学研究所。
1.2 标本收集 90例结核患者痰标本来自本院结核科住院患者，经X线照像、临床指征等确诊。患者痰标本47例涂阳，43例涂阴。30例非结核患者痰标本来自本院呼吸科、肿瘤科及北医三院呼吸科住院患者，痰标本均涂阴。
1.3 引物 引物PL1：5’-GAAGTCGTAACAAGG；PL2：5’-CAAGGCATCCACCAT，根据文献报道设计，扩增产物为350bp，由上海生工生物技术公司合成。引物b ：5’-CGGCAGCGTATCCATTGATG； 5’-CACAAAACGCCCCAACTG，根据引物PL1、PL2扩增产物测序结果，选择碱基差异的一段序列设计的，扩增产物为250bp，由上海生工生物技术公司合成。
, 百拇医药
1.4 DNA探针 寡核苷酸探针来自结核分枝杆菌16S-23SrDNA间隔区序列，其序列为5’-TTTGTGCAATTCTCTGGT-3’生物素标记其5’-端，由赛百胜生物技术公司合成。
1.5 PCR试剂盒 本室自制。
1.6 DNA提取 分枝杆菌及非分枝杆菌标准株及痰标本基因组DNA提取基本上按Hermans介绍的方法，略加改动。
1.7 PCR操作 参照本室设计的25 μl反应体系，稍加改进。引物PL1、PL2循环条件：94℃，1 min；45℃，3 min；72℃，1 min，循环30次，延伸7 min。引物b扩增条件：94℃，1 min；61℃，1 min；72℃，1 min，循环35次，72℃，延伸7 min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。
1.8 寡核苷酸探针的斑点杂交检测方法 点膜、杂交、洗膜及化学发光显色反应分别参照文献[1，2]，并略作改进。具体方法是①将880 ng/μl的结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA稀释为220，110，55，28，14，7，4，2，1，0.5 ng/μl等10个浓度梯度，将两种引物PCR扩增产物分别稀释成50，25，13，7，4，2，1，0.5，0.3，0.1，0.05 ng/μl的不同梯度，在42℃下分别与寡核苷酸探针进行杂交，化学发光进行检测，②将寡核苷酸探针分别对24种分枝杆菌及9种非分枝杆菌的基因组DNA、350bp PCR扩增产物、250bp PCR扩增产物进行杂交，辣根过氧化物酶化学发光进行检测。
, 百拇医药
2 结果
2.1 寡核苷酸探针斑点杂交化学发光检测的敏感性 寡核苷酸探针分别检测基因组DNA、350bp PCR扩增产物、250bp PCR扩增产物的敏感性分别为55，0.5，0.1 ng。
2.2 寡核苷酸探针斑点杂交化学发光检测的特异性 探针与基因组DNA、350bp PCR 扩增产物杂交均与结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、BCG、偶然分枝杆菌、副偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌呈阳性反应，而与250bp PCR扩增产物杂交则只有结核分枝杆菌呈阳性反应，特异性很强。
2.3 寡核苷酸探针斑点杂交化学发光检测痰标本的结果 结核病患者痰标本检测结果见表1；非结核病患者痰标本无论基因组DNA还是PCR扩增产物，杂交结果全为阴性。
表1 寡核苷酸探针对90例结核病患者
, 百拇医药
痰标本检测结果例(%)
例数
基因组DNA
阳性
350bp PCR扩增产物
阳性
250bp PCR扩增产物
阳性
涂阳
47(52)
25(53)
47(100)
, http://www.100md.com 46(98)
涂阴
43(48)
5(12)
38(65)
26(60)
合计
90(100)
30(33)
75(83)
72(80)
3 讨论
多年来，国内外研究者纷纷采用PCR及核苷酸探针检测结核分枝杆菌。核苷酸探针的检测已从同位素发展到非同位素标记，应用逐渐广泛。16S-23S rDNA间隔区序列由于其多变性及普遍存在于各菌种内，用于菌种分类鉴定具有优越性。在对16S-23S rDNA间隔区序列进行系统研究的基础上，根据碱基差异性设计了一段20bp的寡核苷酸探针与PCR相结合，通过化学发光显色检测临床标本中结核分枝杆菌的敏感性和特异性。
, http://www.100md.com
实验表明：寡核苷酸探针与结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA杂交，化学发光检测的敏感性为55 ng，而与350bp PCR扩增产物杂交，检测的敏感性为0.5 ng，与250bp PCR扩增产物杂交，敏感性为0.1 ng。由上可见，在含靶区段的DNA中，随着长度的减少，敏感性升高。特异性实验表明：用引物PL1，PL2对受试的24种分枝杆菌及9种非分枝杆菌进行扩增，全部都能扩增出条带，用寡核苷酸探针对扩增产物进行杂交，化学发光检测，则只有结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、BCG、偶然分枝杆菌、副偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌为阳性。用引物b对受试菌种进行扩增，只有结核分枝杆菌和胃分枝杆菌扩增阳性，杂交结果则只有结核分枝杆菌为阳性。由此可见，杂交后特异性提高。
对90例结核患者痰标本和30例非结核患者痰标本检测结果表明：用探针与基因组DNA杂交，化学发光检测阳性率为33%，低于涂片的52%，不适于临床检测；350bp PCR扩增产物与探针杂交由于特异性差，也不适于临床检测；探针与250bp PCR扩增产物杂交，只有结核分枝杆菌为阳性，特异性提高，检测临床标本的阳性率为80%，高于单纯电泳的64%。
本实验结果表明：寡核苷酸探针与250bp PCR扩增产物结合，通过辣根过氧化物酶化学发光显色，能提高临床标本检测的敏感性和特异性，是临床标本中结核分枝杆菌检测的一种有效方法。
参考文献
1，吴雪琼，庄玉辉，张小刚，等. 光敏生物素标记人型结核分支杆菌DNA探针的研究. 中国防痨杂志，1992，14(2)：79
2，王申五.基因诊断技术.北京：北京医科大学协和医科大学联合出版社， 1992, 94
(收稿日期：2000-02-28), 百拇医药
单位：中国人民解放军309医院结核病研究室 100091
关键词：结核病；16S-23S；rDNA间隔区；寡核苷酸探针；斑点杂交
广东医学000816
【摘要】 目的 应用结核分枝杆菌特异的寡核苷酸探针杂交检测结核患者痰标本中的结核分枝杆菌，以评价其在临床应用中的价值。 方法 对生物素标记5’-端的一个20bp的寡核苷酸探针的敏感性、特异性的研究，并应用该探针对90例结核患者和30例非结核患者痰标本进行了检测。 结果 寡核苷酸探针分别检测基因组DNA、350bp PCR扩增产物、250bp PCR扩增产物的敏感性分别为55 ng，0.5 ng，0.1 ng。探针检测特异性实验表明探针检测基因组DNA、350bp PCR扩增产物特异性较差，检测250bp PCR扩增产物则只与结核分枝杆菌杂交。探针检测90例结核患者痰标本结果表明：探针杂交检测临床标本基因组DNA、350bp PCR扩增产物、250bp PCR扩增产物的阳性率分别为33%、83%、80%，而扩增产物电泳阳性率为64%。寡核苷酸探针与30例非结核患者痰标本基因组DNA及PCR扩增产物杂交则全为阴性。 结论 寡核苷酸探针化学发光检测临床标本250bp PCR扩增产物，能提高结核患者痰标本检测的敏感性与特异性。
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在对16S-23S rDNA间隔区序列进行系统研究的基础上，根据测序结果，选择碱基差异序列设计了一个20bp的寡核苷酸序列，用生物素对其5’-端进行标记，以辣根过氧化物酶催化的化学发光呈色反应，对120例痰标本进行直接检测，现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 菌种来源 24种分枝杆菌来自中国药品生物制品检定所，11种非结核分枝杆菌来自中国科学院微生物学研究所。
1.2 标本收集 90例结核患者痰标本来自本院结核科住院患者，经X线照像、临床指征等确诊。患者痰标本47例涂阳，43例涂阴。30例非结核患者痰标本来自本院呼吸科、肿瘤科及北医三院呼吸科住院患者，痰标本均涂阴。
1.3 引物 引物PL1：5’-GAAGTCGTAACAAGG；PL2：5’-CAAGGCATCCACCAT，根据文献报道设计，扩增产物为350bp，由上海生工生物技术公司合成。引物b ：5’-CGGCAGCGTATCCATTGATG； 5’-CACAAAACGCCCCAACTG，根据引物PL1、PL2扩增产物测序结果，选择碱基差异的一段序列设计的，扩增产物为250bp，由上海生工生物技术公司合成。
, 百拇医药
1.4 DNA探针 寡核苷酸探针来自结核分枝杆菌16S-23SrDNA间隔区序列，其序列为5’-TTTGTGCAATTCTCTGGT-3’生物素标记其5’-端，由赛百胜生物技术公司合成。
1.5 PCR试剂盒 本室自制。
1.6 DNA提取 分枝杆菌及非分枝杆菌标准株及痰标本基因组DNA提取基本上按Hermans介绍的方法，略加改动。
1.7 PCR操作 参照本室设计的25 μl反应体系，稍加改进。引物PL1、PL2循环条件：94℃，1 min；45℃，3 min；72℃，1 min，循环30次，延伸7 min。引物b扩增条件：94℃，1 min；61℃，1 min；72℃，1 min，循环35次，72℃，延伸7 min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。
1.8 寡核苷酸探针的斑点杂交检测方法 点膜、杂交、洗膜及化学发光显色反应分别参照文献[1，2]，并略作改进。具体方法是①将880 ng/μl的结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA稀释为220，110，55，28，14，7，4，2，1，0.5 ng/μl等10个浓度梯度，将两种引物PCR扩增产物分别稀释成50，25，13，7，4，2，1，0.5，0.3，0.1，0.05 ng/μl的不同梯度，在42℃下分别与寡核苷酸探针进行杂交，化学发光进行检测，②将寡核苷酸探针分别对24种分枝杆菌及9种非分枝杆菌的基因组DNA、350bp PCR扩增产物、250bp PCR扩增产物进行杂交，辣根过氧化物酶化学发光进行检测。
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2 结果
2.1 寡核苷酸探针斑点杂交化学发光检测的敏感性 寡核苷酸探针分别检测基因组DNA、350bp PCR扩增产物、250bp PCR扩增产物的敏感性分别为55，0.5，0.1 ng。
2.2 寡核苷酸探针斑点杂交化学发光检测的特异性 探针与基因组DNA、350bp PCR 扩增产物杂交均与结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、BCG、偶然分枝杆菌、副偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌呈阳性反应，而与250bp PCR扩增产物杂交则只有结核分枝杆菌呈阳性反应，特异性很强。
2.3 寡核苷酸探针斑点杂交化学发光检测痰标本的结果 结核病患者痰标本检测结果见表1；非结核病患者痰标本无论基因组DNA还是PCR扩增产物，杂交结果全为阴性。
表1 寡核苷酸探针对90例结核病患者
, 百拇医药
痰标本检测结果例(%)
例数
基因组DNA
阳性
350bp PCR扩增产物
阳性
250bp PCR扩增产物
阳性
涂阳
47(52)
25(53)
47(100)
, http://www.100md.com 46(98)
涂阴
43(48)
5(12)
38(65)
26(60)
合计
90(100)
30(33)
75(83)
72(80)
3 讨论
多年来，国内外研究者纷纷采用PCR及核苷酸探针检测结核分枝杆菌。核苷酸探针的检测已从同位素发展到非同位素标记，应用逐渐广泛。16S-23S rDNA间隔区序列由于其多变性及普遍存在于各菌种内，用于菌种分类鉴定具有优越性。在对16S-23S rDNA间隔区序列进行系统研究的基础上，根据碱基差异性设计了一段20bp的寡核苷酸探针与PCR相结合，通过化学发光显色检测临床标本中结核分枝杆菌的敏感性和特异性。
, http://www.100md.com
实验表明：寡核苷酸探针与结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA杂交，化学发光检测的敏感性为55 ng，而与350bp PCR扩增产物杂交，检测的敏感性为0.5 ng，与250bp PCR扩增产物杂交，敏感性为0.1 ng。由上可见，在含靶区段的DNA中，随着长度的减少，敏感性升高。特异性实验表明：用引物PL1，PL2对受试的24种分枝杆菌及9种非分枝杆菌进行扩增，全部都能扩增出条带，用寡核苷酸探针对扩增产物进行杂交，化学发光检测，则只有结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、BCG、偶然分枝杆菌、副偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌为阳性。用引物b对受试菌种进行扩增，只有结核分枝杆菌和胃分枝杆菌扩增阳性，杂交结果则只有结核分枝杆菌为阳性。由此可见，杂交后特异性提高。
对90例结核患者痰标本和30例非结核患者痰标本检测结果表明：用探针与基因组DNA杂交，化学发光检测阳性率为33%，低于涂片的52%，不适于临床检测；350bp PCR扩增产物与探针杂交由于特异性差，也不适于临床检测；探针与250bp PCR扩增产物杂交，只有结核分枝杆菌为阳性，特异性提高，检测临床标本的阳性率为80%，高于单纯电泳的64%。
本实验结果表明：寡核苷酸探针与250bp PCR扩增产物结合，通过辣根过氧化物酶化学发光显色，能提高临床标本检测的敏感性和特异性，是临床标本中结核分枝杆菌检测的一种有效方法。
参考文献
1，吴雪琼，庄玉辉，张小刚，等. 光敏生物素标记人型结核分支杆菌DNA探针的研究. 中国防痨杂志，1992，14(2)：79
2，王申五.基因诊断技术.北京：北京医科大学协和医科大学联合出版社， 1992, 94
(收稿日期：2000-02-28), 百拇医药