地高辛标记PCR-SSOP法进行HLA-A.02等位基因检测
作者：翟宁 韩秀萍 贺卫东 宋芳吉
单位：翟宁(中国医科大学第一临床学院皮肤科，沈阳 110001)；韩秀萍(第二临床学院皮肤科)；贺卫东(中国医科大学第一临床学院皮肤科，沈阳 110001)；宋芳吉(中国医科大学第一临床学院皮肤科，沈阳 110001)
关键词：聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针；人类白细胞抗原-A.02；等位基因
中国医科大学学报000323 摘要 目的：建立聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSOP)分型方法，并分析其实用价值。方法：采用一对引物扩增所有HLA-A2特异性抗原，用23个探针和扩增产物杂交，探针用地高辛系统标记和检测，可鉴定A2的25个等位基因，并在中国人群HLA-A.02等位基因的检测中进行应用，用B淋巴母细胞株作阳性对照，同时与聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)检测方法作比较。结果：采用本方法检测HLA-A2等位基因的结果与用PCR-SSP方法检测的结果一致。结论：实验证明本分型技术具有质控好、特异性强、敏感性高、费用低廉、特别是对大样本可快速鉴定结果等优点。
, http://www.100md.com
Detection of HLA-A.02 Alleles Using Polymerase Chain Reaction and Digoxigen-11-2-3
Dideoxyurdinctriphosphate Labeled Oligonucleotide Probes
Zhai Ning Hang Xiuping He Weidong Song Fangji
(Department of Dermatology, The First Clinical College， China Medical University, Shenyang, 110001)
ABSTRACT Objective:The experiment was designed to establish a method of polymerase chain reaction and sequence specific oligonucleotide probes (PCR-SSOP) for identification HLA-A2 alleles, and to analyze the practicability of the method. Methods: A PCR-SSOP typing method, involving a single PCR amplification in conjunction with 23 digoxigenin-labeled oligonucleotide probes, has been employed for the identification of 25 known HLA-A.02 alleles. Twenty A2 (+) samples in Shenyang were analyzed with this method and compared with PCR-SSP typing method. Results: The finding of our method was same with those of PCR-SSP. Conclusion:The method is highly specific and sensitive. The finding of this study has implications for the selection of donor in unrelated bone marrow transplantation and organ transplantation and human genetic studies.
, 百拇医药
KEY WORDS PCR-SSOP; HLA-A.02; allele
目前分子生物学方法在HLA-Ⅱ类基因分型中的应用已经非常广泛，但HLA-Ⅰ类分型仍然以血清学方法为主。随着A、B、C座位不断有新等位基因被发现，显示了HLA-Ⅰ类分子在基因水平的多态性也比抗原水平要高得多，例如HLA-A.02等位基因被WHO正式命名的就有25个[1]。因此建立分辨率高而有效的基因分型方法已成为HLA-Ⅰ类分子多态性研究的重要方向。我们建立了用地高辛标记的聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSOP)检测HLA-A.02等位基因的方法，并在中国人群HLA-A.02等位基因的检测中进行了应用[2]，证明本方法技术稳定、结果可靠。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 主要仪器与材料 A2抗原的血清学分型板由上海市血液中心提供；PCR热循环仪PC-100为美国基因公司产品；Taq酶为Promeg公司产品；PCR扩增用一对引物为第十二届国际组织相容性试验专题讨论会赠送；SSOP杂交采用的23个寡核苷酸探针，部分为第十二届国际组织相容性试验专题讨论会赠送，部分根据第十二届国际组织相容性试验专题讨论会的探针序列由上海生工公司合成；地高辛探针标记和检测试剂及杂交用尼龙膜为美国Sigma公司产品。A2亚型DNA阳性对照均由第十二届国际组织相容性试验专题讨论会提供，其B淋巴母细胞株分别是：GRC138(A.0201)、M7(A.0202)、Gee(A.0203)、WT49(A.0205)、AT(A.0206)、TT527(A.0207)、OZB(A.0209)、XLI-ND(A.0210)、GRC212(A.0211)；5例A2阴性的DNA样本作为阴性对照。
, 百拇医药
1.2 研究对象 经血清学微量淋巴细胞毒方法进行HLA-Ⅰ类抗原分型，确定为HLA-A2阳性标本20例。
1.3 实验方法
1.3.1 模板DNA制备：抽取0.5ml外周血，用酚/氯仿抽提法提取DNA，1%琼脂糖电泳检测DNA纯度。
1.3.2 PCR扩增：PCR反应体系(容量为50μl)包括：400ngDNA、2PAA1和2PAB1引物混合物至0.5μmol/L (引物序列分别为 CTCGTCCCCAGGCTC
TCACTCC和GGTCCCCAGGTCCACTCGGTG)、100μmol/L dNTPs、8%甘油、10×PCR缓冲液5μl和1.5U Taq酶。
PCR循环参数：95℃变性1 min；94℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30个循环；再72℃延伸10 min。扩增产物长度为813 bp。同时设阳性和阴性对照。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
, 百拇医药
1.3.3 SSOP杂交：各探针的序列、特异性杂交及特异性洗膜温度、洗膜时间见表1。探针标记采用地高辛系统的Dig-ddUTP3末端转移法操作。取PCR扩增产物2μl点于尼龙膜上，0.4 mol/L NaOH变性，固定用紫外交联仪处理。杂交膜经封闭、预杂交、杂交、非特异性洗膜、特异性洗膜后，使探针与相应标本的PCR产物发生特异性结合；再用酶标记的地高辛单抗结合后加底物CSPD作用产生化学发光。
2 结果
PCR-SSOP反应格局见表1，可以根据此表来判定HLA-A.02等位基因特异性结果。所有标本均未出现无法指定等位基因的杂交反应格局。20例标本中8例为A.0201、4例为A.0203、6例为A.0206、2例为A.0210，与采用SSP分型方法做出的结果相一致。
, 百拇医药
表1 探针的杂交温度、洗膜时间和HLA-A.02等位基因分型的反应格局
Tab.1 Hybridization temperature and washing time, and hybridization patterns of probes 探针
杂交
温度
(℃)
洗膜
时间
(min)
HLA-A.02等位基因
, 百拇医药
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
14
, 百拇医药
15
16
17
18
19
20
21
22
24
9F
54
20
+
+
, http://www.100md.com
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
, http://www.100md.com
+
9Y
54
20
+
+
+
+
+
+
43Q
54
20
+
, 百拇医药
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
, 百拇医药
+
+
+
+
+
43R
54
20
+
+
+
66RN
54
40
, 百拇医药
+
+
66K
54
30
+
+
+
+
+
+
+
+
+
, http://www.100md.com
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
731D
54
, 百拇医药
40
+
97VM
52
30
+
+
97LM
52
30
+
97VR
54
20
, 百拇医药
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
3.1B1
58
20
+
, 百拇医药
+
+
+
99C
58
30
+
+
+
99Y
56
40
+
+
, 百拇医药
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
, 百拇医药
+
107G
54
30
+
149TE
62
20
+
149AE
64
40
+
149AV
, 百拇医药
64
30
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
, http://www.100md.com
+
+
+
+
+
+
+
+
+
156W-1
58
20
+
+
, http://www.100md.com
+
156Q-1
58
30
+
+
156L
56
40
+
+
+
+
+
, http://www.100md.com
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
163E
62
40
+
, 百拇医药
145TKH
56
30
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
, http://www.100md.com
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
表中“01”即为A.0201等位基因，以此类推；+：表示与SSOP有相同的核酸序列同源性的特异性杂交信号
, 百拇医药
3 讨论
3.1 探针特异性鉴定
用建立的杂交方法对纯合子细胞株DNA进行了分型，结果与标定型结果完全一致，证明所设计的探针特异性好，结果可靠。用经PCR-SSP分型方法已确定HLA-A.02亚型的DNA模板进行比较鉴定，得到了一致结果。
3.2 PCR-SSOP与血清学分型方法的比较
PCR-SSOP可分出HLA-A.02等位基因的25个基因型别，最多仅有2%的错配。这点尤其对骨髓移植中供体的选择以及HLA多态性研究具有重要意义。而采用血清学方法最多可以进行HLA-A2抗原5个亚型的分型，约有30%错配率。
3.3 PCR-SSOP与PCR-SSP分型方法的比较
, http://www.100md.com
对20个样本，采用SSOP法分型比SSP法节省一倍的时间；对20个以上样本，则可节省几倍甚至几十倍的时间；上百个样本的分型结果可通过化学发光、X片曝光，一次即可记录整个实验结果，并且此X片可以长时间地使用；而SSP法则必须经过多次琼脂糖凝胶电泳来记录反应结果，且结果不易保存；SSOP分型方法所需费用只是SSP方法的1/2左右。
总之，PCR-SSOP方法自建立以来，该技术在实践中得到了迅速的发展和推广，特别是在第12届国际组织相容性试验专题讨论会后，已研究和设计出一系列序列特异性探针，可用于基因多态性分析，并一致认为SSOP分型技术具有质控好、特异性强、敏感性高、费用低廉、特别是对大样本可快速鉴定结果等优点。在器官移植和骨髓移植组织配型、与疾病相关性以及群体等位基因分布特征的研究中，已逐步证明该技术不失为一种实用、有效、经济可靠的技术，所以该技术具有广泛的应用前景。
参考文献
1，Arnett K, Parham P. HLA class I nucleotide sequences. Tissue Antigens, 1995,46(2): 217-257.
2，翟宁，冯哲，张雁征，等.沈阳地区汉族HLA-A.02亚型等位基因分布.中华医学遗传学杂志,1999,16(5)：344～345.
收稿日期：1999-03-23, http://www.100md.com
单位：翟宁(中国医科大学第一临床学院皮肤科，沈阳 110001)；韩秀萍(第二临床学院皮肤科)；贺卫东(中国医科大学第一临床学院皮肤科，沈阳 110001)；宋芳吉(中国医科大学第一临床学院皮肤科，沈阳 110001)
关键词：聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针；人类白细胞抗原-A.02；等位基因
中国医科大学学报000323 摘要 目的：建立聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSOP)分型方法，并分析其实用价值。方法：采用一对引物扩增所有HLA-A2特异性抗原，用23个探针和扩增产物杂交，探针用地高辛系统标记和检测，可鉴定A2的25个等位基因，并在中国人群HLA-A.02等位基因的检测中进行应用，用B淋巴母细胞株作阳性对照，同时与聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)检测方法作比较。结果：采用本方法检测HLA-A2等位基因的结果与用PCR-SSP方法检测的结果一致。结论：实验证明本分型技术具有质控好、特异性强、敏感性高、费用低廉、特别是对大样本可快速鉴定结果等优点。
, http://www.100md.com
Detection of HLA-A.02 Alleles Using Polymerase Chain Reaction and Digoxigen-11-2-3
Dideoxyurdinctriphosphate Labeled Oligonucleotide Probes
Zhai Ning Hang Xiuping He Weidong Song Fangji
(Department of Dermatology, The First Clinical College， China Medical University, Shenyang, 110001)
ABSTRACT Objective:The experiment was designed to establish a method of polymerase chain reaction and sequence specific oligonucleotide probes (PCR-SSOP) for identification HLA-A2 alleles, and to analyze the practicability of the method. Methods: A PCR-SSOP typing method, involving a single PCR amplification in conjunction with 23 digoxigenin-labeled oligonucleotide probes, has been employed for the identification of 25 known HLA-A.02 alleles. Twenty A2 (+) samples in Shenyang were analyzed with this method and compared with PCR-SSP typing method. Results: The finding of our method was same with those of PCR-SSP. Conclusion:The method is highly specific and sensitive. The finding of this study has implications for the selection of donor in unrelated bone marrow transplantation and organ transplantation and human genetic studies.
, 百拇医药
KEY WORDS PCR-SSOP; HLA-A.02; allele
目前分子生物学方法在HLA-Ⅱ类基因分型中的应用已经非常广泛，但HLA-Ⅰ类分型仍然以血清学方法为主。随着A、B、C座位不断有新等位基因被发现，显示了HLA-Ⅰ类分子在基因水平的多态性也比抗原水平要高得多，例如HLA-A.02等位基因被WHO正式命名的就有25个[1]。因此建立分辨率高而有效的基因分型方法已成为HLA-Ⅰ类分子多态性研究的重要方向。我们建立了用地高辛标记的聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSOP)检测HLA-A.02等位基因的方法，并在中国人群HLA-A.02等位基因的检测中进行了应用[2]，证明本方法技术稳定、结果可靠。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 主要仪器与材料 A2抗原的血清学分型板由上海市血液中心提供；PCR热循环仪PC-100为美国基因公司产品；Taq酶为Promeg公司产品；PCR扩增用一对引物为第十二届国际组织相容性试验专题讨论会赠送；SSOP杂交采用的23个寡核苷酸探针，部分为第十二届国际组织相容性试验专题讨论会赠送，部分根据第十二届国际组织相容性试验专题讨论会的探针序列由上海生工公司合成；地高辛探针标记和检测试剂及杂交用尼龙膜为美国Sigma公司产品。A2亚型DNA阳性对照均由第十二届国际组织相容性试验专题讨论会提供，其B淋巴母细胞株分别是：GRC138(A.0201)、M7(A.0202)、Gee(A.0203)、WT49(A.0205)、AT(A.0206)、TT527(A.0207)、OZB(A.0209)、XLI-ND(A.0210)、GRC212(A.0211)；5例A2阴性的DNA样本作为阴性对照。
, 百拇医药
1.2 研究对象 经血清学微量淋巴细胞毒方法进行HLA-Ⅰ类抗原分型，确定为HLA-A2阳性标本20例。
1.3 实验方法
1.3.1 模板DNA制备：抽取0.5ml外周血，用酚/氯仿抽提法提取DNA，1%琼脂糖电泳检测DNA纯度。
1.3.2 PCR扩增：PCR反应体系(容量为50μl)包括：400ngDNA、2PAA1和2PAB1引物混合物至0.5μmol/L (引物序列分别为 CTCGTCCCCAGGCTC
TCACTCC和GGTCCCCAGGTCCACTCGGTG)、100μmol/L dNTPs、8%甘油、10×PCR缓冲液5μl和1.5U Taq酶。
PCR循环参数：95℃变性1 min；94℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30个循环；再72℃延伸10 min。扩增产物长度为813 bp。同时设阳性和阴性对照。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
, 百拇医药
1.3.3 SSOP杂交：各探针的序列、特异性杂交及特异性洗膜温度、洗膜时间见表1。探针标记采用地高辛系统的Dig-ddUTP3末端转移法操作。取PCR扩增产物2μl点于尼龙膜上，0.4 mol/L NaOH变性，固定用紫外交联仪处理。杂交膜经封闭、预杂交、杂交、非特异性洗膜、特异性洗膜后，使探针与相应标本的PCR产物发生特异性结合；再用酶标记的地高辛单抗结合后加底物CSPD作用产生化学发光。
2 结果
PCR-SSOP反应格局见表1，可以根据此表来判定HLA-A.02等位基因特异性结果。所有标本均未出现无法指定等位基因的杂交反应格局。20例标本中8例为A.0201、4例为A.0203、6例为A.0206、2例为A.0210，与采用SSP分型方法做出的结果相一致。
, 百拇医药
表1 探针的杂交温度、洗膜时间和HLA-A.02等位基因分型的反应格局
Tab.1 Hybridization temperature and washing time, and hybridization patterns of probes 探针
杂交
温度
(℃)
洗膜
时间
(min)
HLA-A.02等位基因
, 百拇医药
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
14
, 百拇医药
15
16
17
18
19
20
21
22
24
9F
54
20
+
+
, http://www.100md.com
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
, http://www.100md.com
+
9Y
54
20
+
+
+
+
+
+
43Q
54
20
+
, 百拇医药
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
, 百拇医药
+
+
+
+
+
43R
54
20
+
+
+
66RN
54
40
, 百拇医药
+
+
66K
54
30
+
+
+
+
+
+
+
+
+
, http://www.100md.com
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
731D
54
, 百拇医药
40
+
97VM
52
30
+
+
97LM
52
30
+
97VR
54
20
, 百拇医药
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
3.1B1
58
20
+
, 百拇医药
+
+
+
99C
58
30
+
+
+
99Y
56
40
+
+
, 百拇医药
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
, 百拇医药
+
107G
54
30
+
149TE
62
20
+
149AE
64
40
+
149AV
, 百拇医药
64
30
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
, http://www.100md.com
+
+
+
+
+
+
+
+
+
156W-1
58
20
+
+
, http://www.100md.com
+
156Q-1
58
30
+
+
156L
56
40
+
+
+
+
+
, http://www.100md.com
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
163E
62
40
+
, 百拇医药
145TKH
56
30
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
, http://www.100md.com
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
表中“01”即为A.0201等位基因，以此类推；+：表示与SSOP有相同的核酸序列同源性的特异性杂交信号
, 百拇医药
3 讨论
3.1 探针特异性鉴定
用建立的杂交方法对纯合子细胞株DNA进行了分型，结果与标定型结果完全一致，证明所设计的探针特异性好，结果可靠。用经PCR-SSP分型方法已确定HLA-A.02亚型的DNA模板进行比较鉴定，得到了一致结果。
3.2 PCR-SSOP与血清学分型方法的比较
PCR-SSOP可分出HLA-A.02等位基因的25个基因型别，最多仅有2%的错配。这点尤其对骨髓移植中供体的选择以及HLA多态性研究具有重要意义。而采用血清学方法最多可以进行HLA-A2抗原5个亚型的分型，约有30%错配率。
3.3 PCR-SSOP与PCR-SSP分型方法的比较
, http://www.100md.com
对20个样本，采用SSOP法分型比SSP法节省一倍的时间；对20个以上样本，则可节省几倍甚至几十倍的时间；上百个样本的分型结果可通过化学发光、X片曝光，一次即可记录整个实验结果，并且此X片可以长时间地使用；而SSP法则必须经过多次琼脂糖凝胶电泳来记录反应结果，且结果不易保存；SSOP分型方法所需费用只是SSP方法的1/2左右。
总之，PCR-SSOP方法自建立以来，该技术在实践中得到了迅速的发展和推广，特别是在第12届国际组织相容性试验专题讨论会后，已研究和设计出一系列序列特异性探针，可用于基因多态性分析，并一致认为SSOP分型技术具有质控好、特异性强、敏感性高、费用低廉、特别是对大样本可快速鉴定结果等优点。在器官移植和骨髓移植组织配型、与疾病相关性以及群体等位基因分布特征的研究中，已逐步证明该技术不失为一种实用、有效、经济可靠的技术，所以该技术具有广泛的应用前景。
参考文献
1，Arnett K, Parham P. HLA class I nucleotide sequences. Tissue Antigens, 1995,46(2): 217-257.
2，翟宁，冯哲，张雁征，等.沈阳地区汉族HLA-A.02亚型等位基因分布.中华医学遗传学杂志,1999,16(5)：344～345.
收稿日期：1999-03-23, http://www.100md.com