福建省HIV-l流行毒株的基因序列测定和亚型分析
作者：邵一鸣 邢辉 严延生 陈舸 郑兆双
单位：邵一鸣 邢辉(中国预防医学科学院病毒学研究所 卫生部艾滋病预防和控制中心)；严延生 陈舸 郑兆双(福建省流行病防治研究所)
关键词：人免疫缺陷病毒；基因扩增；亚型分析；核苷酸序列测定
中华微生物学和免疫学杂志000528 【 摘要 】 目的 通过DNA序列分析，确定福建省HIV-1流行毒株的亚型。 方法 从福建省HIV-1抗体阳性者中选择9例经性接触感染HIV-1者，采集其全血分离周围血淋巴细胞(PBMCs)提取DNA作为PCR扩增的模板，设计合成3对套式引物扩增HIV-1前病毒DNA的C2～V3区用于测序。所测序列与HIV-1中的6个亚型的10个国际标准或参考序列进行比较，确定被检标本的型别。 结果
使用PCR技术对9份福建HIV-1阳性感染者PBMC样品进行扩增，获得HIV-1膜蛋白(env)基因的核酸片段，并对其约247bp核苷酸序列进行了分析、比较，证实9份样品中7份为E亚型，其余2份分别为B和C亚型毒株。E亚型各株间序列存在一定差异，组内基因离散率为6.28±2.40。 结论 福建省目前HIV-1的流行株主要为E亚型，流行株的来源较为复杂，株间序列差异不仅与感染时间有关，也和感染地点不同等因素有关，这些特点不同于我国其他一些省份发现的经血传播的HIV-1 B或C亚型，其流行时间不长，株间序列差异不大。
Subtype and sequence analysis of the C2-V3 region of gp120 genes among HIV-1 strains in Fujian province
YAN Yansheng, CHEN Ge, SHAO Yiming, et al.
(Fujian Anti-epidemic Institute, Fuzhou, 350001，P.R.China)
【 Abstract 】 Objective To identify the HIV-1 subtype epidemic in Fujian by nucleotide sequencing. Methods According to the epidemiological data, more than 100 persons with HIV-1 sero-positive were found in Fujian province by the end of 1998. About 95% of them were infected with HIV-1 by heterosexual contacts either abroad or home. In the study, DNA fragments of HIV-1 env gene were amplified by PCR from uncultured peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) obtained from 8 persons infected with HIV and 1 patient with AIDS in the province. The amplified products of C2-V3 region of HIV-1 were sequenced, and about 247bp of sequence from each specimen were compared with the consensus sequence of 10 reference HIV-1 strains which were 1A, 2B, 2C, 3E, 1D and 1F subtypes, respectively. Results DNA fragments could be amplified from 9 PBMC samples by using nested PCR. Sequence analysis showed that there were 3 HIV-1 subtypes, E(n=7), B(n=1)and C(n=1) in the province. Nucleotide differences were seen between each sequence in the E subtype group, and the gene divergence of innergroup was 6.28±2.40. Conclusions The major HIV-1 strain epidemic in Fujian is E subtype which has disseminated to the province varied with sources and times. These characteristics are different with that B and C subtypes found in IDUs in some provinces.
【 Subject words 】 HIV-1; PCR; Nucleotide sequencing; Subtype analysis
人免疫缺陷病毒(HIV)基因的高度变异性，产生出许多具有基因序列特性的亚型(subtype)，并形成一定的地区性分布特点。根据HIV-l基因组中变异性最大、同时也被研究最多的膜蛋白基因(env)核酸和氨基酸序列的同源性，目前已确定了由A～I和O至少10种HIV-1亚型。各亚型间基因核苷酸序列的差异较大，A～I亚型间的差异一般在(22～35)%，而O亚型与A～I各亚型间的差异则高达50%以上〔1-3〕。
1987年1月，福建省发现首例外籍华人AIDS病例，90年代起，感染人数增多，目前已发现100多例感染者。HIV抗体阳性者多数感染地点在东南亚国家，其它感染地点为美国和非洲一些国家〔4〕；1996年以来福建省境内感染者明显增多，1998年发现的HIV感染者占累计发现数的32%，约一半在国内经性接触感染。为了对福建境内的HIV-1毒株有所了解，我们采集了HIV-1感染者血样，对HIV-1毒株env基因的C2～V3区进行了测序和分析，结果如下。
材料与方法
对象和样品：研究对象为9名本省籍HIV-l抗体阳性者(见表1)，3个女性系在境内感染，其中1名系被其夫传染，另1名系休闲娱乐场所女服务人员，余1名也从未出国，但尚不能确定其感染源；6个男性均有涉外史，主要是在东南亚国家。对每名对象采集静脉血3～5ml，肝素抗凝(20U/ml)，用淋巴细胞分离液分离周围血单核细胞(PBMC)，PBS洗2遍，加入含6μg/ml蛋白酶K的裂解液[10mmol/L Tris-HCl(pH8.4)，50mmol/L KCl，2.5mmol/L MgCl2，0.1%gelatin，0.45%NP40，0.45%Tween-20]，使成6×106细胞浓度，60℃温育2h后，95℃ 15min灭活蛋白酶K，样品置-20℃保存。
表1 9例HIV-1抗体阳性者的基本情况
Table 1. General description of 9 cases with antibody positive to HIV-1 Sample code
Sex
Age
Profession
Status
Possible route of infection
Possible location of infection
FJ1U
F
27
Cadre
Infected
Sexual contact
Fujian
FJ2U
M
37
Sailor
Infected
Sexual contact
Mauritius,Singapore
FJ3U
F
32
Worker
Infected
Sexual contact
Fujian
FJ4U
F
24
Unemployed
Infected
Sexual contact
Fujian
FJ5U
M
42
Peasant
Infected
Sexual contact
Thailand,Malaysia
FJ6U
M
29
Sailor
AIDS patient
Sexual contact
Thailand,Japan
FJ7U
M
18
Unemployed
Infected
Sexual contact
Cambodia
FJ8U
M
51
Manager
Infected
Blood
US
FJ10U
M
32
Peasant
Infected
Sexual contact
Singapore
方法
1.PCR按nested-PCR方法设计合成多对PCR引物(表2)，扩增HIV-1 env基因。以env-L/env-i为外侧扩增引物，进行第一次PCR反应，条件为：95℃ 1min变性；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 120s，30个循环；72℃ 10min。取1/10 PCR产物，以env-C/env-k为内侧引物，按上述条件进行第二次PCR扩增env基因C2～V3区。表2 PCR和测序引物
Table 2. Primers used for PCR and sequence analysis Primer
Usage
Sequence(5′～3′)
The site within
env gene
env-L
PCR
TGGGGTACCTGTGTGGAAA
192
env-i
PCR
TATCCCTGCCTAACTCTATT
2056
env-k
PCR
GCCCATAGTGCTTCCTGCTGCTCC
1536
env-C
PCR
CCAATTCCCATACATTATTG
607
env-D3
Seq
CTGTTAAATGGCAGTCTAGCAG
782
env-f2
Seq
CAGTAGAAAAATTCCCCTCCAC
1109
2.PCR产物的纯化：PCR产物经鉴定无误后，切下特异扩增带，用Qiagen公司的Qiaex试剂，按说明提纯扩增的HIV-l DNA片段。回收的DNA溶于10mmol/L Tris-HCl pH8.7，经琼脂糖凝胶电泳后，与相对分子质量标准比较估算核酸浓度。
3.核苷酸序列测定：分别使用env-D3和env-f2为测序引物，以提纯的PCR产物为模板，用ABI公司荧光标记末端终止物循环测序试剂盒，在PE公司9600型PCR仪上进行测序反应，模板用量约lμg，引物用量为6pmol/L，反应产物经提纯后用自动DNA序列分析仪进行序列测定。
4.序列分析测得的序列用SeqEd和DNA软件进行编辑校正，每个样品C2～V3区核苷酸的最终序列根据两个同向测序引物所测结果重叠校核后确定。序列的排列、比较和同源性等分析，使用威斯康星GCG公司软件包完成，具体包括：用Pileup程序对样品及国际标准序列的排列和比较；用Pretty程序计算一组序列的共享序列(consensus sequence)；用Distances计算一组序列间的基因离散率；用Grouptree程序做系统树(phylogenetic tree)分析。
结果
经nested-PCR扩增后，从9份HIV-l阳性者PBMCs样品中获得可用于序列测定的HIV-1 env基因的目的片段。由env-D3和env-f2引物所得测序结果进行编辑整理，取中部247核苷酸序列，应用Pileup和Pretty程序进行有关排列和比较，计算出其共享序列(见图1)。将9个毒株核苷酸序列分别与6个国际标准亚型(A～F)和其它4个参考毒株[SF2-ENV(B)、AF067155-ENV(C)、CM240X(E)和GX-ECOM(E)]的共享序列进行比较，计算彼此间的基因离散率，结果FJ1U、FJ2U、FJ4U、FJ5U、FJ6U、FJ7U和FJ10U 7份标本的序列接近E亚型代表株Econ、GX-Econ和CM240X，其离散率介于(5.1～5.9)%，组内基因离散率为(6.5±2.6)%，而与A、B、C、D和 表3 福建HIV-1 E亚型毒株与A～E国际亚型和部分参考毒株基因离散率的比较F亚型共享序列间的离散率至少高于21.0%以上(见表3)；其余2份标本，FJ3U序列接近C亚型代表株CCON和AF067155-ENV，离散率分别为13.0%和11.5%，而与其它亚型的离散率至少超过23.0%；FJ8U序列接近B亚型代表株BCON和SF2-ENV，离散率分别为7.8%及13.0%，而与其它亚型的离散率至少超过20.0%。
Table 3. Genetic distances between HIV-1 E subtypes of Fujian and 5 international HIV-1 subtypes as well as some HIV-1 reference strains Subtype
Genetic distance (
±s，%)Intergroup
ACON
BCON
CCON
DCON
E
FCON
ECON
GX-ECON
CM240
E
6.5±2.6
22.3±1.9
22.1±2.1
23.4±2.6
26.7±2.7
5.1±2.1
5.9±2.3
5.3±2.4
21.7±2.4
图1 福建9份HIV-1抗体阳性标本C2～V3区核苷酸序列及其共享序列
Fig 1. Nucleotide sequence alignment and consensus sequence of 9 samples of HIV-1 antibody positive in Fujian
进一步的系统树分析(见图2)证实，FJ8U与B亚型代表株聚集，FJ3U与C亚型代表株聚集，FJ1U、FJ2U、FJ4U～FJ7U，FJ10U 7个毒株与E亚型代表株聚集而远离其它国际亚型毒株序列，因此，根据离散率计算及系统树分析结果，确定FJ8U为B亚型，FJ3U为C亚型，其它7个毒株均为E亚型。
图2 福建省HIV-1 毒株的系统树分析
Fig 2. Phynogenetic relationship of sequences of HIV-1 subtypes in Fujian
FJ1 to FJ8, and FJ10U represented the C2～V3 region sequences of 9 HIV-1 strains in Fujian. ACON was as the reference sequence of HIV-1 A subtype, BCON and SF2ENV were as B, CCON and AF067155ENV were as C, DCON was as D; ECON,GX-ECON and CM240X were as E, and FCON was as F subtype
讨论
流行病学资料表明，本研究中9名感染者中6名为男性，均有出国史并有不正当性关系，而3名女性也是从性途径获得感染，因此标本基本上可以反映福建HIV-1流行毒株的状况，有一定的代表性。
9例核苷酸序列分析证实E亚型有7份，B、C亚型各占1例，说明福建HIV-1流行株目前系以E亚型为主。由于福建HIV的流行现状主要以性接触途径缓慢传播扩散，因此，如果在新感染者中，其它型别尤其是B亚型增多时，则应考虑其它传播方式的发生，如静脉吸毒人群中发生HIV-1的流行。
经血传播HIV-1速度快，在一定时间内，相同亚型毒株之间基因组核苷酸序列差异小，离散率低，如云南、新疆、四川和湖北等地静脉吸毒人群中流行的B、C亚型，彼此间基因离散率一般不超过2%〔5-8〕。本研究中E亚型与国际或参考毒株比较，离散率介于(5.1～5.9)%之间，且组内基因离散率也相对较大，为6.5±2.6，由于HIV-1经性接触传播是一种散发流行的过程，与血源性传播可造成局部暴发流行过程不同，E亚型流行株离散率间的差异可能是不同感染地点、不同感染毒株以及流行时间不同等综合因素的结果。
参考文献
1，Myers G,Korber B, Smith RF, et al. Human retroviruses and AIDS, l993, Los Alamos, New Mexico: Los Alamos National Laboratory, 1993.
2，Weniger BG, Yutaka Takebe, Ou CY, et al. The molecular epidemiology of HIV in Asia. AIDS, 1994, 8(suppl 2):S1-S14.
3，Janssons W, Fransen K, Loussert A, et al. Genetic and phylogenetic analysis of env subtypes G and H in central Africa. AIDS Res Hum Retroviruses, 1994,10:877-879.
4，严延生，郑兆双，邵一鸣，等. 福建省艾滋病的流行特征及流行趋势分析. 中华流行病学杂志，1999, 20:23-62.
5，邵一鸣，赵全壁，管永军. 1995年云南瑞丽HIV-1毒株的基因变异和分析. 病毒学报，1996，12:9-17.
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(收稿日期：1999-04-14)