X射线全身照射对小鼠腹腔巨噬细胞NO产生的影响
作者：孙义敏 刘树铮
单位：130021 长春，白求恩医科大学卫生部放射生物学重点实验室
关键词：电离辐射；巨噬细胞；iNOS；NO
中华放射医学与防护杂志000403 【摘要】 目的 观察75 mGy、2.0 GyX射线全身照射后不同时间，小鼠腹腔巨噬细胞NO产生的时程变化及不同剂量照射后24 h时NO、iNOS的含量变化。方法 分光光度法及免疫组织化学方法。结果 iNOS和NO的产生与剂量呈正相关。2.0 Gy照射后，NO从6 h到48 h随时间推移产生量逐渐增加，48 h达峰值，为对照的3.8倍，而后回降。结论 电离辐射可刺激巨噬细胞合成iNOS及产生NO。
Effect of whole body X-irradiation on production of nitric oxide in peritoneal macrophages of mice
, http://www.100md.com
SUN Yimin,LIU Shuzheng.
(MH Radiobiology Research Unit,Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021,China)
【Abstract】 Objective To disclose the changes of nitric oxide (NO) in murine peritoneal macrophages at different time intervals after whole body irradiation (WBI) with 75 mGy and 2.0 Gy X-rays and the changes of NO and induced nitric oxide synthase (iNOS) 24 hours after WBI with 0.05-6.0 Gy X-rays. Methods Immunohistochemistry and spectophotometry were used. Results The expression of iNOS and the production of NO increased in a dose-dependent manner after irradiation.The production of NO increased from 6h to 48h and reached its peak at 48h,which was 3.8-fold of sham-irradiated controls. Conclusion Ionizing radiation stimulates expression of iNOS and production of NO in peritoneal macrophages of mice.
, 百拇医药
【Key words】 Irradiation; Macrophages; Induced nitric oxide synthase； Nitric oxide
NO是一种极其微小而又富有毒性的分子，可以自由通过细胞膜，性质极不稳定，由cNOS和iNOS催化而产生。NO是巨噬细胞杀伤肿瘤细胞和病原微生物的重要物质[1]。本实验旨在观察电离辐射对小鼠腹腔巨噬细胞iNOS的表达及NO的产生的影响。
材料和方法
1.动物和分组：雄性健康昆明系小白鼠，由本校实验动物部提供，体重(20±2)g。动物随机分为对照组和照射组。
2.照射条件：采用Philips深部X射线机，电流10 mA，电压200 kV，滤过板0.5 mmCu和1.0 mmAl。吸收剂量≤200 mGy时，吸收剂量率为12.5 mGy/min；吸收剂量大于200 mGy时，吸收剂量率为0.287 Gy/min。对照组给予假照射。照射后按要求分批处死动物。
, 百拇医药
3.NO测定样品的收集：小鼠受X射线全身照射后不同时间，无菌条件下冲洗腹腔巨噬细胞，离心洗涤后用含10%NBS的1640培养液调细胞浓度为2×106 个/ml，1 ml/孔加到24孔板，37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养2 h，用1640培养液洗涤2次，去除未粘附细胞，加入含LPS 20 μg/ml的1640培养液，1 ml/孔，继续培养40 h，离心收集上清，冻存于-20℃待测。
4.NO含量测定：采用分光光度法检测[2]。
5.iNOS的检测：细胞涂片，辣根过氧化物酶标记ABC免疫组织化学染色，显微镜下观察100个细胞计出阳性细胞数。
6.统计学处理：采用t检验。
结 果
, 百拇医药 1.用60.0 μmol/L的KNO3标准使用液，稀释不同浓度绘制标准曲线。所得回归方程为Y=0.01695+0.00049X，相关系数r=0.9942，P<0.01，上式中Y为吸光度，X为NO-3浓度(μmol/L)。在本实验条件下，NO-3浓度与吸光度之间呈现良好的线性关系。
2.电离辐射作用后腹腔巨噬细胞产生NO的变化时程：小鼠受75 mGy及2.0 GyX射线全身照射后，观察照射后6、12、24、48、72、120、168 h，腹腔巨噬细胞产生NO的变化，见表1。由表1可知：小鼠受75 mGyX射线全身照射后，24 h到168 h较对照组均有增高趋势，照射后120 h，显著高于对照组。2.0 Gy照射后，NO产生量从24 h到120 h，均显著高于对照组，照射后48 h，表达量最高。
表1 电离辐射作用后小鼠腹腔巨噬
, 百拇医药
细胞产生NO的时程变化 照射后时间
(h)
n
NO浓度(μmol/L)
75 mGy
2.0 Gy
对照组
5
25.0±12.7
25.0±12.7
6
5
, 百拇医药 26.5±15.8
45.2±10.4*
12
5
13.8±5.2
43.5±18.4
24
5
31.3±9.5
41.2± 2.6*
48
5
, 百拇医药
32.9±16.8
94.7±34.3**
72
5
39.2±5.9
62.3±25.5*
120
5
40.6±2.8*
44.7±13.8*
168
, 百拇医药
5
36.9±5.4
44.7±23.3
注：与对照组比，*P<0.05，**P<0.01 3.电离辐射作用后，腹腔巨噬细胞产生NO的量效关系：小鼠受不同剂量X射线全身照射后24 h获取腹腔巨噬细胞，观察NO产生量的变化。由表2可见：从50 mGy到1.0 Gy范围内，不同剂量照射后NO产生量较对照组均有增高趋势(但无统计学意义)，2.0、4.0、6.0 Gy大剂量照射后均显著高于对照组，且有剂量依赖性，6.0 Gy照射后产生量是对照组的8倍之多。
表2 电离辐射作用24 h后小鼠腹腔巨噬
细胞产生NO的量效关系 吸收剂量(Gy)
, http://www.100md.com n
NO浓度(μmol/L)
对照组
5
25.0±12.7
0.050
5
28.0±9.5
0.075
5
31.3±9.5
0.2
5
, 百拇医药
31.3±21.3
0.5
5
31.8±8.9
1
5
30.6±20.0
2
5
41.2±2.6*
4
5
53.9±14.2**
, 百拇医药
6
5
207.7±12.4**
注：与对照组比，*P<0.05，**P<0.01 4.免疫组织化学方法观察腹腔巨噬细胞iNOS的变化：小鼠受不同剂量X射线全身照射后，24 h冲洗腹腔巨噬细胞，细胞涂片，免疫组织化学染色，显微镜下观察100个细胞计出阳性细胞数，分析不同剂量照射后诱导型NO合酶(iNOS)的表达变化。结果所得：iNOS在对照组即有表达，0.075 Gy照射后表达下降，为对照组的62%，0.5、1.0、2.0 Gy照射后表达量有增加趋势，4.0、6.0 Gy照射后表达量明显增加，分别为对照组的158%和160%。
讨 论
NO是近几年来才引起人们关注的一种具有重要生物活性的化学因子，一般情况下，正常机体就可产生一定量的NO，以维持正常机体的生理功能，但是正常机体一般情况下只有cNOS的表达，没有iNOS的表达，也有文献[3]报道认为正常的肺泡巨噬细胞可有一定量的NO分泌。当机体受到一些刺激因素如LPS、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-6等作用时，可有iNOS的表达，先诱导iNOS mRNA转录，然后再翻译成iNOS蛋白，iNOS蛋白产生后维持时间较长[4]，iNOS可催化产生大量的NO。NO属G蛋白超家族，即可通过激活鸟苷环化酶(GC)，使GTP转化为cGMP，cGMP作为细胞内的信号传递分子参与一些蛋白激酶的活化和一些蛋白质的磷酸化，由此而产生生物效应。
, http://www.100md.com
大量文献报道认为多种细胞因子可以诱导NO的产生，同时，NO产生后也可促进细胞因子的产生。而且NO在感染、肿瘤、炎症中均发挥重要作用，NO参与抗炎和抗肿瘤等病理过程。巨噬细胞合成的NO对肿瘤细胞具有直接的抑制作用，而且M合成NO同时释放TNF可进一步加强对肿瘤的抑制。Rojas[5]等实验证实LPS诱生鼠腹腔M产生NO是剂量依赖性的，BSA也可刺激NO产生，而且产生最大量的时间是在24～48 h。本文实验结果证实，辐射可诱导NO产生和iNOS的表达，且与剂量呈正相关。Ibuki[2]等检测了C57BL/6小鼠腹腔M在体外受6.0 Gy γ射线(137Cs,0.3 Gy/min)照射后NO产生的变化，结果表明：6.0 Gy照射后NO产生量增加，NO产生增加可能是由于辐射激活iNOS的表达，促进NO产生；也可能是由于γ射线直接引起DNA链断裂，激活iNOS的表达；也可能是诱导细胞内产生[HO*]，引起DNA链断裂，激活iNOS表达。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570188)
, 百拇医药
参考文献
1，Macmicking J,Xie QW,Nathan C.Nitric oxide and macrophages function.Annu Rev Immunol,1997,15:323-350.
2， Ibuki Y,Goto R.Enhancement of NO production from resident peritoneal macrophages by in vitro gamma irradiation and its relationship to reactive oxygen intermediates.Free Radic Biol Med,1997,22:1029-1035.
3， Oswald IP,Gazzinelli RT,Sher A.IL-10 synergizes with IL-4 and transforming growth factor β to inhibit macrophages cytotoxic activity. J Immunol,1992,148:3578-3580.
, 百拇医药
4， Michael A,Marletta,Poksyn S,et al.Macrophages oxidation of larginine to nitrite and nitrate:nitric oxide is an intermediate. Biochemistry,1988,27:8706-8711.
5， Rojas A,Caveda L,Romay C,et al.Effect of advanced glycosylation and production on the induction of nitric oxide synthase in murine macrophages.Biochem Biophys Res Commun,1996,225:358-362.
(收稿日期:1999-10-29), http://www.100md.com
单位：130021 长春，白求恩医科大学卫生部放射生物学重点实验室
关键词：电离辐射；巨噬细胞；iNOS；NO
中华放射医学与防护杂志000403 【摘要】 目的 观察75 mGy、2.0 GyX射线全身照射后不同时间，小鼠腹腔巨噬细胞NO产生的时程变化及不同剂量照射后24 h时NO、iNOS的含量变化。方法 分光光度法及免疫组织化学方法。结果 iNOS和NO的产生与剂量呈正相关。2.0 Gy照射后，NO从6 h到48 h随时间推移产生量逐渐增加，48 h达峰值，为对照的3.8倍，而后回降。结论 电离辐射可刺激巨噬细胞合成iNOS及产生NO。
Effect of whole body X-irradiation on production of nitric oxide in peritoneal macrophages of mice
, http://www.100md.com
SUN Yimin,LIU Shuzheng.
(MH Radiobiology Research Unit,Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021,China)
【Abstract】 Objective To disclose the changes of nitric oxide (NO) in murine peritoneal macrophages at different time intervals after whole body irradiation (WBI) with 75 mGy and 2.0 Gy X-rays and the changes of NO and induced nitric oxide synthase (iNOS) 24 hours after WBI with 0.05-6.0 Gy X-rays. Methods Immunohistochemistry and spectophotometry were used. Results The expression of iNOS and the production of NO increased in a dose-dependent manner after irradiation.The production of NO increased from 6h to 48h and reached its peak at 48h,which was 3.8-fold of sham-irradiated controls. Conclusion Ionizing radiation stimulates expression of iNOS and production of NO in peritoneal macrophages of mice.
, 百拇医药
【Key words】 Irradiation; Macrophages; Induced nitric oxide synthase； Nitric oxide
NO是一种极其微小而又富有毒性的分子，可以自由通过细胞膜，性质极不稳定，由cNOS和iNOS催化而产生。NO是巨噬细胞杀伤肿瘤细胞和病原微生物的重要物质[1]。本实验旨在观察电离辐射对小鼠腹腔巨噬细胞iNOS的表达及NO的产生的影响。
材料和方法
1.动物和分组：雄性健康昆明系小白鼠，由本校实验动物部提供，体重(20±2)g。动物随机分为对照组和照射组。
2.照射条件：采用Philips深部X射线机，电流10 mA，电压200 kV，滤过板0.5 mmCu和1.0 mmAl。吸收剂量≤200 mGy时，吸收剂量率为12.5 mGy/min；吸收剂量大于200 mGy时，吸收剂量率为0.287 Gy/min。对照组给予假照射。照射后按要求分批处死动物。
, 百拇医药
3.NO测定样品的收集：小鼠受X射线全身照射后不同时间，无菌条件下冲洗腹腔巨噬细胞，离心洗涤后用含10%NBS的1640培养液调细胞浓度为2×106 个/ml，1 ml/孔加到24孔板，37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养2 h，用1640培养液洗涤2次，去除未粘附细胞，加入含LPS 20 μg/ml的1640培养液，1 ml/孔，继续培养40 h，离心收集上清，冻存于-20℃待测。
4.NO含量测定：采用分光光度法检测[2]。
5.iNOS的检测：细胞涂片，辣根过氧化物酶标记ABC免疫组织化学染色，显微镜下观察100个细胞计出阳性细胞数。
6.统计学处理：采用t检验。
结 果
, 百拇医药 1.用60.0 μmol/L的KNO3标准使用液，稀释不同浓度绘制标准曲线。所得回归方程为Y=0.01695+0.00049X，相关系数r=0.9942，P<0.01，上式中Y为吸光度，X为NO-3浓度(μmol/L)。在本实验条件下，NO-3浓度与吸光度之间呈现良好的线性关系。
2.电离辐射作用后腹腔巨噬细胞产生NO的变化时程：小鼠受75 mGy及2.0 GyX射线全身照射后，观察照射后6、12、24、48、72、120、168 h，腹腔巨噬细胞产生NO的变化，见表1。由表1可知：小鼠受75 mGyX射线全身照射后，24 h到168 h较对照组均有增高趋势，照射后120 h，显著高于对照组。2.0 Gy照射后，NO产生量从24 h到120 h，均显著高于对照组，照射后48 h，表达量最高。
表1 电离辐射作用后小鼠腹腔巨噬
, 百拇医药
细胞产生NO的时程变化 照射后时间
(h)
n
NO浓度(μmol/L)
75 mGy
2.0 Gy
对照组
5
25.0±12.7
25.0±12.7
6
5
, 百拇医药 26.5±15.8
45.2±10.4*
12
5
13.8±5.2
43.5±18.4
24
5
31.3±9.5
41.2± 2.6*
48
5
, 百拇医药
32.9±16.8
94.7±34.3**
72
5
39.2±5.9
62.3±25.5*
120
5
40.6±2.8*
44.7±13.8*
168
, 百拇医药
5
36.9±5.4
44.7±23.3
注：与对照组比，*P<0.05，**P<0.01 3.电离辐射作用后，腹腔巨噬细胞产生NO的量效关系：小鼠受不同剂量X射线全身照射后24 h获取腹腔巨噬细胞，观察NO产生量的变化。由表2可见：从50 mGy到1.0 Gy范围内，不同剂量照射后NO产生量较对照组均有增高趋势(但无统计学意义)，2.0、4.0、6.0 Gy大剂量照射后均显著高于对照组，且有剂量依赖性，6.0 Gy照射后产生量是对照组的8倍之多。
表2 电离辐射作用24 h后小鼠腹腔巨噬
细胞产生NO的量效关系 吸收剂量(Gy)
, http://www.100md.com n
NO浓度(μmol/L)
对照组
5
25.0±12.7
0.050
5
28.0±9.5
0.075
5
31.3±9.5
0.2
5
, 百拇医药
31.3±21.3
0.5
5
31.8±8.9
1
5
30.6±20.0
2
5
41.2±2.6*
4
5
53.9±14.2**
, 百拇医药
6
5
207.7±12.4**
注：与对照组比，*P<0.05，**P<0.01 4.免疫组织化学方法观察腹腔巨噬细胞iNOS的变化：小鼠受不同剂量X射线全身照射后，24 h冲洗腹腔巨噬细胞，细胞涂片，免疫组织化学染色，显微镜下观察100个细胞计出阳性细胞数，分析不同剂量照射后诱导型NO合酶(iNOS)的表达变化。结果所得：iNOS在对照组即有表达，0.075 Gy照射后表达下降，为对照组的62%，0.5、1.0、2.0 Gy照射后表达量有增加趋势，4.0、6.0 Gy照射后表达量明显增加，分别为对照组的158%和160%。
讨 论
NO是近几年来才引起人们关注的一种具有重要生物活性的化学因子，一般情况下，正常机体就可产生一定量的NO，以维持正常机体的生理功能，但是正常机体一般情况下只有cNOS的表达，没有iNOS的表达，也有文献[3]报道认为正常的肺泡巨噬细胞可有一定量的NO分泌。当机体受到一些刺激因素如LPS、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-6等作用时，可有iNOS的表达，先诱导iNOS mRNA转录，然后再翻译成iNOS蛋白，iNOS蛋白产生后维持时间较长[4]，iNOS可催化产生大量的NO。NO属G蛋白超家族，即可通过激活鸟苷环化酶(GC)，使GTP转化为cGMP，cGMP作为细胞内的信号传递分子参与一些蛋白激酶的活化和一些蛋白质的磷酸化，由此而产生生物效应。
, http://www.100md.com
大量文献报道认为多种细胞因子可以诱导NO的产生，同时，NO产生后也可促进细胞因子的产生。而且NO在感染、肿瘤、炎症中均发挥重要作用，NO参与抗炎和抗肿瘤等病理过程。巨噬细胞合成的NO对肿瘤细胞具有直接的抑制作用，而且M合成NO同时释放TNF可进一步加强对肿瘤的抑制。Rojas[5]等实验证实LPS诱生鼠腹腔M产生NO是剂量依赖性的，BSA也可刺激NO产生，而且产生最大量的时间是在24～48 h。本文实验结果证实，辐射可诱导NO产生和iNOS的表达，且与剂量呈正相关。Ibuki[2]等检测了C57BL/6小鼠腹腔M在体外受6.0 Gy γ射线(137Cs,0.3 Gy/min)照射后NO产生的变化，结果表明：6.0 Gy照射后NO产生量增加，NO产生增加可能是由于辐射激活iNOS的表达，促进NO产生；也可能是由于γ射线直接引起DNA链断裂，激活iNOS的表达；也可能是诱导细胞内产生[HO*]，引起DNA链断裂，激活iNOS表达。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570188)
, 百拇医药
参考文献
1，Macmicking J,Xie QW,Nathan C.Nitric oxide and macrophages function.Annu Rev Immunol,1997,15:323-350.
2， Ibuki Y,Goto R.Enhancement of NO production from resident peritoneal macrophages by in vitro gamma irradiation and its relationship to reactive oxygen intermediates.Free Radic Biol Med,1997,22:1029-1035.
3， Oswald IP,Gazzinelli RT,Sher A.IL-10 synergizes with IL-4 and transforming growth factor β to inhibit macrophages cytotoxic activity. J Immunol,1992,148:3578-3580.
, 百拇医药
4， Michael A,Marletta,Poksyn S,et al.Macrophages oxidation of larginine to nitrite and nitrate:nitric oxide is an intermediate. Biochemistry,1988,27:8706-8711.
5， Rojas A,Caveda L,Romay C,et al.Effect of advanced glycosylation and production on the induction of nitric oxide synthase in murine macrophages.Biochem Biophys Res Commun,1996,225:358-362.
(收稿日期:1999-10-29), http://www.100md.com