补体C5b-9复合物诱导大鼠肾系膜细胞iNOS mRNA表达的实验研究
作者：王迎伟 何球藻 秦慧莲 高丰光 汤仁仙
单位：王迎伟(徐州医学院免疫 教研室，徐州221002)；何球藻(上海医科大学免疫教研室，上海200032)；秦慧莲(上海医科大学免疫教研室，上海200032)
关键词：补体C5b-9复合物；肾小球系膜细胞；诱生性一 氧化氮合酶一氧化氮
中国免疫学杂志000503 摘 要 目的：观察人血清补体C5b-9复合物对大鼠肾小球系膜细胞(M C)表达诱生性一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的影响。方法：首先 提取人血清补 体C5b-9复合物，然后用人C5b-9复合物刺激培养的大鼠MC，检测MC在受C5b-9复合物刺激 后3、 6、24和48 h时iNOS mRNA的表达情况。同时检测其培养上清液中一氧化氮(NO)代谢产物—— 硝 酸根(NO3-)和亚硝酸根(NO2-)含量的变化。结果： 用 人C5b-9复合物刺激培养大鼠的肾MC能使其表达iNOS mRNA，培养上清液中NO3-/NO 2-含量也明显升高。人C5b-9复合物对MC的刺激作用能部分被相应的抗人C5b-9复合 物抗 体和RNA 合成抑制剂——放线菌素D所抑制。结论：人补体C5b-9复合 物具有刺激大鼠肾MC合成NO的作用。
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中国图书分类号 R392.12
The study on expression of iNOS mRNA in rat gl omerular mesangial cells with human complement C5b-9 complexes
WANG Ying-Wei HE Qiu-Zao QIN Hui-Lian
(Depart ment of Immunology, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002)
Abstract Objective：To investigate effect on expression of inducib le nitr ic oxide synthase (iNOS)mRNA in rat glomerular mesangial cells(MC) with human s erum complement C5b-9 complexes.Methods：Human complement C 5b-9 complexes were isolated and rat glomerular MC were cultured.Then, the expr e ssion of iNOS mRNA in rat glomerular MC and amount of metablism products of nitr ic oxide(NO)-nitrate/nitrite(NO3-/NO2-)in cultured supernatant of glo merular MC were detected after 3,6,24 and 48 h incubation with human C5b-9 com plexes. Results：The expression of iNOS mRNA in cultured g l omerular MC and total NO3-/NO2-in the media from cultured MC were in creased after stimulation with C5b-9 complexes. Further, the stimulating effec t of C5b-9 complexes could be inhibited partially by anti-C5b-9 antibody or ac tin omycin D.Conclusion：The NO synthesis from glomerular MC o f rats can be facilitated by human complement C5b-9 complex stimulation.
, 百拇医药
Key words Complement C5b-9 complex Glomerular mesan gial cell Inducible nitric oxide synthase Nitric oxide
补体C5b-9复合物是补体活化后形成的终末补体膜攻击复合体。已有研究表 明：全溶量的C5b-9复合物能使细胞穿孔坏死，而亚溶量的C5b-9复合物则可 作为有核细胞的一种刺激剂，促进细胞代谢、合成多种生物活性介质[1]。近年来有 学者证实：细菌脂多糖、肿瘤坏死因子等能刺激肾小球系膜细胞(Mesangial cel l,MC)合成一氧化 氮(Nitric oxide,NO)[2]。然而，有关补体C5b-9复合物介导MC表达诱生性一氧化 氮合酶(Induc ible NO synthase,iNOS)及合成NO的作用少见报道，本文应用大鼠MC培养系统观察了C5b -9这一作用。
1 材料与方法
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1.1 人血清补体C5b-9复合物的提取 方法参见文献[3]。提取后 的 C5b-9复合物除作电镜观察外，还经斑点-ELISA(Dot-ELISA)法用抗人C3、C5、C9及C5b- 9复合物抗体(美国DAKO公司)染色鉴定，方法参见文献[4]。
1.2 大鼠肾小球MC的培养与鉴定 具体步骤见文献[5]。
1.3 大鼠iNOS cDNA探针的制备 大鼠iNOS cDNA的重组质粒由瑞士Novar tis公司移植研究室薛春博士惠赠。采用地高辛(Digoxigenin,DIG)RNA标记试剂盒(SP6/T7 ，德国B.M公司)制备cRNA探针方法详见文献[6]。
1.4 培养大鼠肾MC的分组处理 将传代培养1 w的肾MC营养液换成不含 酚红 的RPMI1640并添加10%小牛血清及1 mmol/L精氨酸继续培养24 h。然后将各瓶培养的MC作如 下 分组处理，C5b-9组：应用人C5b-9复合物刺激MC，终浓度为40 μg/ml营养液；C5b-9+a nti- C5b-9组：先加入与C5b-9相同剂量的人C5b-9复合物，随后加入抗人 C5b-9复合物单克 隆抗体， 剂量为20 μl/ml营养液；C5b-9+actinomycin D组：先加入人 C5b-9复合物(剂量同前)， 接 着加入放线菌素D(德国BIB公司)，终浓度为0.05 μg/ml营养液；对照组：仅加营养液 培养。
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1.5 MC总RNA的提取 应用TRIZOL试剂(美国GIBCO公司)提取各组MC在分 组 处理后3、6、24及48 h细胞总RNA，并作1%琼脂糖甲醛变性胶电泳鉴定。另用RNA markerⅡ( B.M公司)作为参照物。
1.6 MC iNOS mRNA的检测
1.6.1 斑点杂交(Dot-blot) 分别取人C5b-9复合物刺激3、6、24及48 h 后 提取的MC总RNA各10 μg点样加在尼龙膜上，用DIG-cRNA iNOS 探针进行杂交，然后 用DIG核苷酸检测试剂盒(B.M 公司)显色观察。
1.6.2 膜杂交(Northern blot) 分别取不同处理的各组MC 24 h提取的 总RNA电泳后，再转至尼龙膜上，其余按Dot-blot法检测。
1.7 MC培养液中NO3-/NO2-含量的测定 采用硝酸还原酶 法测定 不同处理的各组MC经3、6、24及48 h培养后上清液中的NO3-/NO2-的含量， 方法按试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书进行。
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2 结果
2.1 人C5b-9复合物的提取与鉴定 提取的人补体C5b-9复合物电镜负染 多呈 空心环状结构，与国外文献报道一致。Dot-ELISA鉴定显示：抗人C5、抗 C9及C5b-9复合物 抗体染色呈现阳性，而抗人C3染色呈现阴性。
2.2 大鼠肾MC的培养与鉴定 原代培养2 w的MC细胞多呈梭状或星形。 传代 的细胞生长极快，1 w 后细胞形态趋向一致，伴有不规则突起。免疫组化染色显示，生 长的细胞为纯度极高的肾小球MC。
2.3 大鼠iNOS cRNA探针的敏感性 质粒按常规方法扩增、提取、酶切及 标记等步骤制备的大鼠iNOS cRNA探针，其敏感性可达0.1 pg/μl。
2.4 大鼠MC总RNA的电泳结果 提取的各组大鼠MC总RNA电泳结果见图1。
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2.5 点杂交与膜杂交检测结果 Dot-blot检测显示：培养的MC经C5b-9 复合物 刺激3 h后即可见iNOS mRNA表达，但表达量较低。刺激6 h时iNOS mRNA表达明显增加，24 和 48 h时表达十分显著(图2)。Northern blot检测的结果表明(图3)：C5b-9组的MC 24 h时iN OS mRNA 明 显表达， C5b-9+anti-C5b-9组及C5b-9+actinomycin D组iNOS表达量均明显减少，对照 组未见iNOS mRNA的表达 (注 iNOS mRNA其大小在4.5 kb左右)。
图1 4组大鼠肾小球MC总RNA电泳结果
Fig.1 The result of total RNA electrophoresis
of glomerular MC in four g roups
, 百拇医药
Note:A.C5b-9；B.C5b-9+anti-C5b-9；C.C5b-9+actinomycin D；D.Control[ ZK)
图2 点杂交显示用C5b-9刺激后大鼠肾小球MC iNOS mRNA表达结果
Fig.2 The expression of iNOS mRNA in glomerular MC after 3,6,24 an d 48h stimulation with human serum C5b-9 complexes by using Dot-blot assay
图3 膜杂交检测4组肾小球MC 24 h时iNOS mRNA的表达结果
, 百拇医药
Fig.3 The expression of iNOS mRNA of glomerular MC in four groups
after 24 h with various treatment by using Northern blot assay
Note:A.C5b-9；B.C5b-9+anti-C5b-9；C.C5b-9+actinomyc in D；D.Control
表1 4组肾小球MC培养上清液中NO3-/NO2 -含量的变化
Tab.l Changes of NO3-/NO2- content of cultured glomerular
, 百拇医药
MC supe rnant in four groups
Content of NO3-/NO2-[
,μmol/L)
Group(n=10)
3 h
6 h
24 h
48 h
C5b-9
32.38±11.47
, 百拇医药
52.39±16.162)3)
63.63±18.172)3)
68.18±19.312)3)
C5b-9+anti-C5b-9
31 .93±10.85
34.21±10.52
40.91±9.861)
42.95±11.271)
C5b-9+actinomycin D
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29.20±7.42
31.25±11.59
35.11±10.64
40.80±10.081)
Control
29.32±10.65
26.93±9.94
31.14±16.7 8
30.16±8.46
Note：t test,compared with control group，1)P<0.05,2)P<0.01；compared with C5b-9+anti-C5b-9 group，3)P<0.01
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2.6 MC培养液中NO3-/NO2-含量的变化 处理各组的MC，3 h时培 养上清液中NO3-/NO2-含量尚无明显差异。6 h时各组培养MC上清液中NO 3-/NO2-含量变化已出现差异，具体数据及统计分析归纳于表1。
3 讨论
免疫病理学研究证实，补体C5b-9复合物在肾小球系膜沉积的同时常伴有肾MC损伤和增生反 应。系 膜增生性肾小球肾炎(Mesangial proliferative glomerular nephritis,MPGN)具有补体依 赖性[7]。体外实验发现：亚溶量的C5b-9复合物可作为肾MC的一种激活剂，刺激M C合成一些生物活性介质，参与肾小球细胞的继发性损伤[8]。由于补体介导的反应 具有同源限制性，即种属相同的补体与细胞反应时效率极低，这与细胞表面存在着某些同源 限制因子(Homologous restriction factor,HRF)有关[9]。本文利用提取的人补体 C5b-9复合物刺激大鼠肾小球MC，可避免HRF的干扰现象。
, 百拇医药
NO是一种亲脂性分子，它参与肾细胞损伤的作用近年来已日益为人们所关注[10]。 目前已知，催化底物L-精氨酸生成NO的酶类主要有2种，即结构型NOS(constructive NOS, cNOS)和诱生性NOS(iNOS)，前者为某些细胞所固有，后者则在细胞受到某些因子刺激后方能 表达[2]。本实验应用人血清补体C5b-9复合物刺激体外培养的大鼠肾小球MC，观 察 其对MC表达iNOS mRNA的影响，结果发现，大鼠肾MC在受到人C5b-9刺激后3 h即可检出有iN OS mRNA少量表达，6、24和48 h表达量均明显增加。C5b-9的这种刺激作用可被抗人C5b-9抗 体 所抑制，表现为iNOS mRNA的表达量明显减少。放线菌素D处理亦能抑制MC iNOS mRNA的 表 达。此外，检测MC培养液中NO代谢产物——NO3-/NO2-含量也证实，人C5b-9复合物刺激MC后其培养上清液中NO3-/NO2-含量明显上升,主要见于刺激后6、24和48h。用抗人C5b-9复合物单抗或放线菌素D处理后，其培养上清液NO3-/NO2-的含量明显被抑制。
, 百拇医药
已有报道，补体C5b-9复合物是实验性MPGN的重要致病因素[7]，它可介导多种活 性 物质释放参与肾组织损伤[8]，而MPGN的病理改变又与NO的升高密切相关[7] 。我们过去探讨了人C5b-9复合物刺激体外培养的大鼠MC胞内cGMP升高现象，本文进一步研究了C5b-9诱导MC表达iNOS mRNA和促进NO生成的作用，提示 C 5b-9可能通过这一途径参与MPGN的致病机制。本实验结果将为今后深入探讨MPGN的发病 机理和防治策略等提供有益的启示。
江苏省科委及卫生厅自然科学基金资助(BK97154，H9 723)
作者简介：王迎伟，女，副教授 ，博士生，主要从事肾脏免疫病理研究；
何球藻，男，教授，博士生导师，主要从事免疫病理学研究
高丰光(徐州医学院免疫 教研室，徐州221002)
, 百拇医药
汤仁仙(徐州医学院免疫 教研室，徐州221002)
4 参考文献
1，Schonermark M, Deppisch R,Rideasch G et al. Induction of mediator releas e from human glomerular mesangial cells by the terminal complement components C5 b-9.Int Arch Allergy Appl Immunol,1991;96：331
2，Shultz P J,Archer S L, Rosenberg M E.Inducible nitric oxide synthase mRN A and activity in glomerular mesangial cells.Kidney Int,1994;46：683
, 百拇医药
3，Bhaki S , Tranum jensen J. Terminal membrane C5b-9 complex of human c omplemen t：transition from an amphiphilic to a hydrophilic state through binding of the S protein from serum. J Cell Biol,1982;94：755
4，王迎伟，杜文平，嵇月红.斑点ELISA法检测SLE患者血中抗肾抗体及其意义.中国实验 临床免疫学杂志，1999；11(1)：12
5，王迎伟，何球藻，秦慧莲.大鼠肾小球系膜细胞的培养与鉴定.徐州医学院学 报，1999；19(1)：15
6，王迎伟，高丰光，何球藻.诱生性一氧化氮合酶(iNOS) cRNA探针的制备及敏感性检测. 徐州医学院学报，1999；19(5)：265
, 百拇医药
7，Brandt J, Pippin J, Schulze M et al. Role of the complement membrane att ack complex C5b-9 in mediating experimental mesangioproliferative glomerulonephriti s. Kidney Int, 1996；49：335
8，王迎伟，何球藻.补体C5b-9 复合物介导肾小球细胞炎性损伤的研究进展.国外 医学*免疫学分册，1999；22(2)：71
9，张 页，周凤兰.补体介导细胞反应的同种限制现象及其产生机制.生 理科学进展，1991；22(3)：231
10，Ignarro L J. Physiology and pathophysiology of nitric oxide. Kidney Int, 199 6；49 (suppl)：s-2
[收稿1999-07-26 修回1999-10-18], 百拇医药
单位：王迎伟(徐州医学院免疫 教研室，徐州221002)；何球藻(上海医科大学免疫教研室，上海200032)；秦慧莲(上海医科大学免疫教研室，上海200032)
关键词：补体C5b-9复合物；肾小球系膜细胞；诱生性一 氧化氮合酶一氧化氮
中国免疫学杂志000503 摘 要 目的：观察人血清补体C5b-9复合物对大鼠肾小球系膜细胞(M C)表达诱生性一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的影响。方法：首先 提取人血清补 体C5b-9复合物，然后用人C5b-9复合物刺激培养的大鼠MC，检测MC在受C5b-9复合物刺激 后3、 6、24和48 h时iNOS mRNA的表达情况。同时检测其培养上清液中一氧化氮(NO)代谢产物—— 硝 酸根(NO3-)和亚硝酸根(NO2-)含量的变化。结果： 用 人C5b-9复合物刺激培养大鼠的肾MC能使其表达iNOS mRNA，培养上清液中NO3-/NO 2-含量也明显升高。人C5b-9复合物对MC的刺激作用能部分被相应的抗人C5b-9复合 物抗 体和RNA 合成抑制剂——放线菌素D所抑制。结论：人补体C5b-9复合 物具有刺激大鼠肾MC合成NO的作用。
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中国图书分类号 R392.12
The study on expression of iNOS mRNA in rat gl omerular mesangial cells with human complement C5b-9 complexes
WANG Ying-Wei HE Qiu-Zao QIN Hui-Lian
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Abstract Objective：To investigate effect on expression of inducib le nitr ic oxide synthase (iNOS)mRNA in rat glomerular mesangial cells(MC) with human s erum complement C5b-9 complexes.Methods：Human complement C 5b-9 complexes were isolated and rat glomerular MC were cultured.Then, the expr e ssion of iNOS mRNA in rat glomerular MC and amount of metablism products of nitr ic oxide(NO)-nitrate/nitrite(NO3-/NO2-)in cultured supernatant of glo merular MC were detected after 3,6,24 and 48 h incubation with human C5b-9 com plexes. Results：The expression of iNOS mRNA in cultured g l omerular MC and total NO3-/NO2-in the media from cultured MC were in creased after stimulation with C5b-9 complexes. Further, the stimulating effec t of C5b-9 complexes could be inhibited partially by anti-C5b-9 antibody or ac tin omycin D.Conclusion：The NO synthesis from glomerular MC o f rats can be facilitated by human complement C5b-9 complex stimulation.
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Key words Complement C5b-9 complex Glomerular mesan gial cell Inducible nitric oxide synthase Nitric oxide
补体C5b-9复合物是补体活化后形成的终末补体膜攻击复合体。已有研究表 明：全溶量的C5b-9复合物能使细胞穿孔坏死，而亚溶量的C5b-9复合物则可 作为有核细胞的一种刺激剂，促进细胞代谢、合成多种生物活性介质[1]。近年来有 学者证实：细菌脂多糖、肿瘤坏死因子等能刺激肾小球系膜细胞(Mesangial cel l,MC)合成一氧化 氮(Nitric oxide,NO)[2]。然而，有关补体C5b-9复合物介导MC表达诱生性一氧化 氮合酶(Induc ible NO synthase,iNOS)及合成NO的作用少见报道，本文应用大鼠MC培养系统观察了C5b -9这一作用。
1 材料与方法
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1.1 人血清补体C5b-9复合物的提取 方法参见文献[3]。提取后 的 C5b-9复合物除作电镜观察外，还经斑点-ELISA(Dot-ELISA)法用抗人C3、C5、C9及C5b- 9复合物抗体(美国DAKO公司)染色鉴定，方法参见文献[4]。
1.2 大鼠肾小球MC的培养与鉴定 具体步骤见文献[5]。
1.3 大鼠iNOS cDNA探针的制备 大鼠iNOS cDNA的重组质粒由瑞士Novar tis公司移植研究室薛春博士惠赠。采用地高辛(Digoxigenin,DIG)RNA标记试剂盒(SP6/T7 ，德国B.M公司)制备cRNA探针方法详见文献[6]。
1.4 培养大鼠肾MC的分组处理 将传代培养1 w的肾MC营养液换成不含 酚红 的RPMI1640并添加10%小牛血清及1 mmol/L精氨酸继续培养24 h。然后将各瓶培养的MC作如 下 分组处理，C5b-9组：应用人C5b-9复合物刺激MC，终浓度为40 μg/ml营养液；C5b-9+a nti- C5b-9组：先加入与C5b-9相同剂量的人C5b-9复合物，随后加入抗人 C5b-9复合物单克 隆抗体， 剂量为20 μl/ml营养液；C5b-9+actinomycin D组：先加入人 C5b-9复合物(剂量同前)， 接 着加入放线菌素D(德国BIB公司)，终浓度为0.05 μg/ml营养液；对照组：仅加营养液 培养。
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1.5 MC总RNA的提取 应用TRIZOL试剂(美国GIBCO公司)提取各组MC在分 组 处理后3、6、24及48 h细胞总RNA，并作1%琼脂糖甲醛变性胶电泳鉴定。另用RNA markerⅡ( B.M公司)作为参照物。
1.6 MC iNOS mRNA的检测
1.6.1 斑点杂交(Dot-blot) 分别取人C5b-9复合物刺激3、6、24及48 h 后 提取的MC总RNA各10 μg点样加在尼龙膜上，用DIG-cRNA iNOS 探针进行杂交，然后 用DIG核苷酸检测试剂盒(B.M 公司)显色观察。
1.6.2 膜杂交(Northern blot) 分别取不同处理的各组MC 24 h提取的 总RNA电泳后，再转至尼龙膜上，其余按Dot-blot法检测。
1.7 MC培养液中NO3-/NO2-含量的测定 采用硝酸还原酶 法测定 不同处理的各组MC经3、6、24及48 h培养后上清液中的NO3-/NO2-的含量， 方法按试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书进行。
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2 结果
2.1 人C5b-9复合物的提取与鉴定 提取的人补体C5b-9复合物电镜负染 多呈 空心环状结构，与国外文献报道一致。Dot-ELISA鉴定显示：抗人C5、抗 C9及C5b-9复合物 抗体染色呈现阳性，而抗人C3染色呈现阴性。
2.2 大鼠肾MC的培养与鉴定 原代培养2 w的MC细胞多呈梭状或星形。 传代 的细胞生长极快，1 w 后细胞形态趋向一致，伴有不规则突起。免疫组化染色显示，生 长的细胞为纯度极高的肾小球MC。
2.3 大鼠iNOS cRNA探针的敏感性 质粒按常规方法扩增、提取、酶切及 标记等步骤制备的大鼠iNOS cRNA探针，其敏感性可达0.1 pg/μl。
2.4 大鼠MC总RNA的电泳结果 提取的各组大鼠MC总RNA电泳结果见图1。
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2.5 点杂交与膜杂交检测结果 Dot-blot检测显示：培养的MC经C5b-9 复合物 刺激3 h后即可见iNOS mRNA表达，但表达量较低。刺激6 h时iNOS mRNA表达明显增加，24 和 48 h时表达十分显著(图2)。Northern blot检测的结果表明(图3)：C5b-9组的MC 24 h时iN OS mRNA 明 显表达， C5b-9+anti-C5b-9组及C5b-9+actinomycin D组iNOS表达量均明显减少，对照 组未见iNOS mRNA的表达 (注 iNOS mRNA其大小在4.5 kb左右)。
图1 4组大鼠肾小球MC总RNA电泳结果
Fig.1 The result of total RNA electrophoresis
of glomerular MC in four g roups
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Note:A.C5b-9；B.C5b-9+anti-C5b-9；C.C5b-9+actinomycin D；D.Control[ ZK)
图2 点杂交显示用C5b-9刺激后大鼠肾小球MC iNOS mRNA表达结果
Fig.2 The expression of iNOS mRNA in glomerular MC after 3,6,24 an d 48h stimulation with human serum C5b-9 complexes by using Dot-blot assay
图3 膜杂交检测4组肾小球MC 24 h时iNOS mRNA的表达结果
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Fig.3 The expression of iNOS mRNA of glomerular MC in four groups
after 24 h with various treatment by using Northern blot assay
Note:A.C5b-9；B.C5b-9+anti-C5b-9；C.C5b-9+actinomyc in D；D.Control
表1 4组肾小球MC培养上清液中NO3-/NO2 -含量的变化
Tab.l Changes of NO3-/NO2- content of cultured glomerular
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MC supe rnant in four groups
Content of NO3-/NO2-[
,μmol/L)Group(n=10)
3 h
6 h
24 h
48 h
C5b-9
32.38±11.47
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52.39±16.162)3)
63.63±18.172)3)
68.18±19.312)3)
C5b-9+anti-C5b-9
31 .93±10.85
34.21±10.52
40.91±9.861)
42.95±11.271)
C5b-9+actinomycin D
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29.20±7.42
31.25±11.59
35.11±10.64
40.80±10.081)
Control
29.32±10.65
26.93±9.94
31.14±16.7 8
30.16±8.46
Note：t test,compared with control group，1)P<0.05,2)P<0.01；compared with C5b-9+anti-C5b-9 group，3)P<0.01
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2.6 MC培养液中NO3-/NO2-含量的变化 处理各组的MC，3 h时培 养上清液中NO3-/NO2-含量尚无明显差异。6 h时各组培养MC上清液中NO 3-/NO2-含量变化已出现差异，具体数据及统计分析归纳于表1。
3 讨论
免疫病理学研究证实，补体C5b-9复合物在肾小球系膜沉积的同时常伴有肾MC损伤和增生反 应。系 膜增生性肾小球肾炎(Mesangial proliferative glomerular nephritis,MPGN)具有补体依 赖性[7]。体外实验发现：亚溶量的C5b-9复合物可作为肾MC的一种激活剂，刺激M C合成一些生物活性介质，参与肾小球细胞的继发性损伤[8]。由于补体介导的反应 具有同源限制性，即种属相同的补体与细胞反应时效率极低，这与细胞表面存在着某些同源 限制因子(Homologous restriction factor,HRF)有关[9]。本文利用提取的人补体 C5b-9复合物刺激大鼠肾小球MC，可避免HRF的干扰现象。
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NO是一种亲脂性分子，它参与肾细胞损伤的作用近年来已日益为人们所关注[10]。 目前已知，催化底物L-精氨酸生成NO的酶类主要有2种，即结构型NOS(constructive NOS, cNOS)和诱生性NOS(iNOS)，前者为某些细胞所固有，后者则在细胞受到某些因子刺激后方能 表达[2]。本实验应用人血清补体C5b-9复合物刺激体外培养的大鼠肾小球MC，观 察 其对MC表达iNOS mRNA的影响，结果发现，大鼠肾MC在受到人C5b-9刺激后3 h即可检出有iN OS mRNA少量表达，6、24和48 h表达量均明显增加。C5b-9的这种刺激作用可被抗人C5b-9抗 体 所抑制，表现为iNOS mRNA的表达量明显减少。放线菌素D处理亦能抑制MC iNOS mRNA的 表 达。此外，检测MC培养液中NO代谢产物——NO3-/NO2-含量也证实，人C5b-9复合物刺激MC后其培养上清液中NO3-/NO2-含量明显上升,主要见于刺激后6、24和48h。用抗人C5b-9复合物单抗或放线菌素D处理后，其培养上清液NO3-/NO2-的含量明显被抑制。
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已有报道，补体C5b-9复合物是实验性MPGN的重要致病因素[7]，它可介导多种活 性 物质释放参与肾组织损伤[8]，而MPGN的病理改变又与NO的升高密切相关[7] 。我们过去探讨了人C5b-9复合物刺激体外培养的大鼠MC胞内cGMP升高现象，本文进一步研究了C5b-9诱导MC表达iNOS mRNA和促进NO生成的作用，提示 C 5b-9可能通过这一途径参与MPGN的致病机制。本实验结果将为今后深入探讨MPGN的发病 机理和防治策略等提供有益的启示。
江苏省科委及卫生厅自然科学基金资助(BK97154，H9 723)
作者简介：王迎伟，女，副教授 ，博士生，主要从事肾脏免疫病理研究；
何球藻，男，教授，博士生导师，主要从事免疫病理学研究
高丰光(徐州医学院免疫 教研室，徐州221002)
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汤仁仙(徐州医学院免疫 教研室，徐州221002)
4 参考文献
1，Schonermark M, Deppisch R,Rideasch G et al. Induction of mediator releas e from human glomerular mesangial cells by the terminal complement components C5 b-9.Int Arch Allergy Appl Immunol,1991;96：331
2，Shultz P J,Archer S L, Rosenberg M E.Inducible nitric oxide synthase mRN A and activity in glomerular mesangial cells.Kidney Int,1994;46：683
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3，Bhaki S , Tranum jensen J. Terminal membrane C5b-9 complex of human c omplemen t：transition from an amphiphilic to a hydrophilic state through binding of the S protein from serum. J Cell Biol,1982;94：755
4，王迎伟，杜文平，嵇月红.斑点ELISA法检测SLE患者血中抗肾抗体及其意义.中国实验 临床免疫学杂志，1999；11(1)：12
5，王迎伟，何球藻，秦慧莲.大鼠肾小球系膜细胞的培养与鉴定.徐州医学院学 报，1999；19(1)：15
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8，王迎伟，何球藻.补体C5b-9 复合物介导肾小球细胞炎性损伤的研究进展.国外 医学*免疫学分册，1999；22(2)：71
9，张 页，周凤兰.补体介导细胞反应的同种限制现象及其产生机制.生 理科学进展，1991；22(3)：231
10，Ignarro L J. Physiology and pathophysiology of nitric oxide. Kidney Int, 199 6；49 (suppl)：s-2
[收稿1999-07-26 修回1999-10-18], 百拇医药