FLt-3配基和促血小板生成素对脐血造血祖细胞的协同扩增作用
作者：刘英 吕善根 裴雪涛 冉崇蓉 李梁 冯凯 徐黎
单位：刘英(100853北京，解放军总医院儿科)； 吕善根(100853北京，解放军总医院儿科)； 冉崇蓉(100853北京，解放军总医院儿科)； 裴雪涛(军事医学科学院放射医学研究所 国家生物医学分析中心)； 李梁(军事医学科学院放射医学研究所 国家生物医学分析中心)； 冯凯(军事医学科学院放射医学研究所 国家生物医学分析中心)； 徐黎(军事医学科学院放射医学研究所 国家生物医学分析中心)
关键词：血小板生成素；膜糖蛋白类；胎血；造血干细胞
中华儿科杂志000208 【摘要】 目的 探讨体外同时扩增粒/巨噬细胞系祖细胞(CFU-GM)、巨核细胞系祖细胞(CFU-Mk)的最佳细胞因子组合。方法 利用免疫磁珠法分离纯化脐血CD+34细胞，在液体培养体系中经干细胞因子(SCF)、白细胞介素(IL)-3、IL-6、粒系集落刺激因子(G-CSF)、FLt-3配基( FLt-3 ligand，FL)、促血小板生成素(thrombopoietin，TPO)等不同细胞因子组合扩增14 d，检测CFU-GM、CFU-Mk、CD+34CD-38细胞等的扩增倍数。结果 TPO可协同SCF、IL-3、IL-6、G-CSF对CFU-GM、CFU-Mk的扩增作用；FL对造血干细胞/早期祖细胞的支持能力高于TPO；FL+SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF组合14 d扩增CFU-GM (70±7)倍、CFU-Mk (118±10)倍，明显高于SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF组合对其所扩增的倍数。结论 FL+SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF组合是体外同时扩增CFU-GM和CFU-Mk的最佳细胞因子组合之一。
, 百拇医药
Synergistic effects of FLt-3 ligand and thrombopoietin on the expansion of hematopoietic progenitor cells in cord blood
LIU Ying*, LU Shangen, PEI Xuetao, et al. *
General Hospital of PLA, Beijing 100853, China
【Abstract】 Objective To elucidate the optimal cytokine combinations that would result in the most significantly simultaneous ex vivo expansions of both colony forming unit-granulocyte and macrophage (CFU-GM) and colony forming unit-macrophage(CFU-Mk). Methods CD+34 cells were isolated from umbilical cord blood by using a high-gradient magnetic cell sorting system (MACS), and expanded with various combinations of hematopoietic growth factors (HGFs) which included FLt-3 ligand (FL), thrombopoietin (TPO), stem cell factor (SCF), IL-3, IL-6 granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF), and granulocyte and macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) for 14 days in a liquid culture system. Colony forming cells and antigen expressions were studied by colony forming assays and fluorescence-activated cell sorter (FACS). Results TPO showed synergistic actions with SCF, IL-3, IL-6, G-CSF to expand CFU-GM and CFU-Mk. FL showed a stronger potential for expanding hematopoietic stem cells and early progenitor cells than TPO. The combination of FL+SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF increased expasions of CFU-GM and CFU-Mk by 70±7 fold and 118±10 fold, respectively on day 14 of culture, and was much better than the combination of SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF. Conclusion The combination of FL+SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF might be one of the optimal combinations for significant expansions of CFU-GM and CFU-Mk simultaneously.
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【Key words】 Thrombopoietin; Membrane glycoproteins; Fetal blood; Hematopoietic stem cell
脐血是新近发展起来的极具潜力的造血干细胞来源，迄今为止世界范围内已进行了600多例脐血造血干细胞移植。由于单份脐血祖细胞绝对数量不足，对于较大儿童或成人则有外周血中性粒细胞，尤其是血小板恢复时间延迟等缺陷[1]。成功地体外扩增脐血造血细胞是脐血移植应用于较大儿童及成人的关键问题。FLt-3配基(FLt-3 ligand，FL)和促血小板生成素(thrombopoietin，TPO)为新近发现的两个作用于造血干细胞/早期祖细胞的细胞因子[2，3]。我们利用FL、TPO与其他常用细胞因子的不同组合对脐血CD+34细胞进行体外扩增，探讨体外扩增巨核系和粒/巨噬系祖细胞的最佳细胞因子组合 。
材料和方法
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一、脐血
来自解放军总医院妇产科，肝素抗凝终浓度为20 U/ml，平均采集量为50～70 ml， 采集后24 h内的细胞悬液经PBS缓冲液稀释，Ficoll(相对密度1.077)梯度离心。收集界面层单个核细胞(MNC)，洗涤备用。
二、脐血CD+34细胞的分离
利用Mini MACS免疫磁性系统进行。即抗CD34抗体QBEND -10(Miltenyi Biotec公司， 德国)与细胞悬液1∶5混匀，4℃孵育20 min；1∶5加入羊抗鼠IgG1免疫磁珠，6～8℃孵育20min，洗涤，制成单细胞悬液。标记细胞通过置于磁场内的分离柱，洗脱去除CD-34细胞，将分离柱移出磁场，加压洗脱，收集CD+34细胞。
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三、脐血CD+34细胞体外液体扩增体系
IMDM培养基中含12.5%马血清(HS)、12.5%胎牛血清(FCS)、5×10-7 mol/L氢化可的松、2×104/ml 的CD+34 细胞及重组人造血细胞生长因子(rhHGFs)的终浓度分别为：FL(Immunex公司，美国)40 ng/ml; TPO(Amgen公司，美国)10 ng/ml; SCF(Sandos公司，美国)50 ng/ml; IL-6(Sandos公司，美国)20 ng/ml; IL-3(Sandos公司，美国)2 ng/ml; GM-CSF(Glaxo公司，美国)40 ng/ml; G-CSF(Amgen公司，美国)20 ng/ml。上述体系接种于12孔板中，1ml/孔，复种3孔，37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养14 d。每周半量换液。rhHGFs每48 h加入体系1次，连续加5次。第14天时取出细胞用于细胞总数、CD+34、CD+34 CD-38细胞、粒/巨噬细胞系祖细胞(CFU-GM)及巨核细胞系祖细胞(CFU-Mk)的检测。
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四、实验分组
(1)SCF+IL-3+IL-6+TPO；(2)SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF；(3)SCF+IL-3+GM-CSF+G-CSF；(4)FL+SCF+IL-3+IL-6；(5)FL+SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF。用同一份脐血分离出的CD+34细胞分别在上述5个组合支持的液体体系中扩增，重复3次。
五、造血祖细胞集落培养
CFC试剂盒(军事医学科学院放射医学研究所)含30%HS、10%牛血清白蛋白(BSA)(Sigma公司，美国)、50 ng/ml 的干细胞因子(SCF)、2 ng/ml 的白细胞介素3(IL-3)、40 ng/ml 粒单集落刺激因子(GM-CSF)、5×103 U/ml 的粒系集落刺激因子(G-CSF)、2 U/ml 的促红细胞生成素(EPO)(Bochinger公司，美国)、5×103CD+34细胞/ml或5×104扩增细胞/ml、IMDM及1.35%甲基纤维素。上述体系接种于24孔板中，0.5 ml/孔，复种3孔，37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养14 d，计数CFU-GM。CFU-Mk培养体系中细胞因子为SCF 50 ng/ml，IL-3为2 ng/ml和TPO为 10 ng/ml，且加用5×105 mol/L 的2-巯基乙醇，其余条件同前，7～9 d计数CFU-Mk。
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六、细胞表面标志的流式细胞仪(FACScan BD，美国)分析
标记抗体鼠抗人CD34单抗 FITC-HPCA-2 (BD公司，美国)和鼠抗人CD38单抗PE-leu17 (BD公司，美国)分别用于检测CD+34和CD+34CD-38细胞，1∶10(5 μl / 5×105细胞)稀释，4℃孵育20 min，洗涤送检。
七、统计学方法
用SAS软件对CFU-GM、CFU-Mk、CD+34CD-38细胞3个指标的扩增倍数进行随机单位组方差分析；用Student-Newman-Keuls test进行两两比较，显著性水平设为0.05。
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结果
一、脐血CD+34细胞的分离纯化
MiniMACS分离纯化获得的CD+34细胞经FACS检测，其纯度为90.11%～97.57%；回收率62%～75%。
二、TPO对脐血造血祖细胞的扩增作用
TPO和G-CSF分别为巨核细胞系及粒系特异性生长因子。含TPO的SCF+IL-3+ IL-6+TPO组合14 d扩增CFU-Mk (35±5)倍，SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF组合14 d扩增CFU-Mk (32±4)倍，均明显高于不含TPO的SCF+IL-3+GM-CSF+G-CSF组合(4.0±1.0)倍(P<0.05)；G-CSF加入SCF+IL-3+IL-6+TPO对CFU-Mk的扩增倍数无明显影响(P>0.05)。SCF+IL-3+ IL-6+TPO+G-CSF对CFU-GM的扩增能力也明显强于SCF+IL-3+GM-CSF+G-CSF，前者14 d扩增CFU-GM (26±3)倍，后者(12.9±2.2)倍(P<0.05)。可见，TPO不仅对巨核细胞系祖细胞的增殖有明显作用，还可协同G-CSF刺激粒系造血。G-CSF对TPO诱导巨核细胞系分化无显著影响。
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三、FL对脐血早期造血祖细胞的体外扩增作用
CD+34CD-38细胞包括造血干细胞和早期造血祖细胞，这些细胞对早期造血细胞因子，如SCF、IL-3、IL-6无反应，而FL可诱导它们由静止期进入增殖期[4]。FL单独作用只有很弱的集落刺激活性，但与SCF、IL-3、IL-6联合具有十分明显的协同作用，14 d扩增CD+34、CD-38细胞(46±4)倍 ，对细胞分化的压力明显低于含特异性生长因子的SCF+IL3+IL-6+ TPO+G-CSF的组合，后者14 d扩增CD+34CD-38 细胞为(5.3±1.2)倍(P<0.05)。
四、FL、TPO联用对脐血造血祖细胞的扩增作用
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FL+SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF组合14 d扩增CFU-GM (70±7)倍、CFU-Mk (118±10)倍，均明显高于不含FL的组合(P<0.05)。表明，在SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF的组合中加入FL，可加强该体系的支持能力，从而更有效地提高CFU-GM、CFU-Mk的扩增倍数。
讨论
造血细胞生长因子支持的体外扩增为目前造血干细胞体外扩增最广泛的使用方法。以SCF+IL-3为基础的常用组合扩增造血细胞同时伴有造血干细胞/早期祖细胞分化，既限制祖细胞的扩增程度，又影响扩增细胞在体内的长期造血重建。解决问题的关键在于鉴定和分离出可维持造血干细胞自我更新能力的细胞因子。
TPO是促进巨核细胞发育和血小板生成的细胞因子，但大量研究表明其具有协同多系造血的活性。经TPO治疗的猴多向祖细胞(CFU-GEMM)水平上调[5]；c-mpl(是细胞因子TPO的受体)缺陷小鼠的所有造血祖细胞包括多潜能祖细胞及各系定向祖细胞的数量均减少[6]，可见TPO不仅能促进巨核细胞的增殖和分化，并且与其他造血细胞生长因子(HGF)联用还可促进造血干细胞的全系造血[3]。我们研究所用的SCF+IL-3+ IL-6+TPO+G-CSF组合就可较好地同时诱导巨核细胞系和粒/巨噬细胞系祖细胞的分化，且扩增效率显著高于SCF+IL-3+GM-CSF+G-CSF的组合。
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FL可诱导处于静止期的造血干细胞/早期祖细胞进入增殖期，使他们对早期造血细胞因子，如 SCF、IL-3、IL-6产生增殖反应。Bhatia等[7]和Conneally 等[8]的研究结果均表明，FL+ SCF+IL-3+IL-6+G-CSF组合可在体外短期维持造血干细胞的自我更新能力。我们的研究则表明，FL+SCF+IL-3+IL-6对扩增体系的支持能力高于SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF。两个组合联合形成的FL+SCF+ IL-3+ IL-6+TPO+G-CSF可进一步提高CFU-GM和CFU-Mk的扩增倍数。我们在随后的实验中将该组合扩增14 d的脐血细胞移植亚致死剂量照射的严重联合免疫缺陷病(SCID)小鼠取得成功，并在移植后存活6周的SCID小鼠骨髓中仍检测到人造血细胞。提示该组合可保留造血干细胞/早期祖细胞自我更新及造血重建的能力。因此，FL+SCF+ IL-3+ IL-6+TPO+G-CSF组合是满足临床移植需要的最佳细胞因子组合之一，在脐血移植中用于较大儿童及成人。在减少外周血干细胞动员次数和分离时间、自体造血干细胞移植时的肿瘤净化、造血干细胞作为靶细胞的基因治疗、大剂量放化疗后的造血支持治疗等方面具有广阔的应用前景。
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基金项目：国家杰出青年科学基金资助项目(39825111)
参考文献：：
[1]Cairo MS, Wagner JE. Placental and/or umbilical cord blood: an alternative source of hematopoietic stem cells for transplantation. Blood, 1997,90:4665-4678.
[2]Hannum C, Culpepper J, Campbell D, et al. Ligand for Flt3/Flk2 receptor tyrosine kinase regulates growth of hemopoietic stem cells and is encoded by variant RNAs. Nature, 1994,368:643-648.
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[3]Kaushansky K. Thrombopoietin:understanding and manipulating platelet production. Annu Rev Med, 1997,48:1-11.
[4]Shah AJ, Smogorzewska EM, Hannum C, et al. Flt3 ligand induces proliferation of quiescent human bone marrow CD+34CD-38 cells and maintains progenitor cells in vitro. Blood, 1996,87:3563-3570.
[5]Farese AM, Hunt P,Grab LB, et al. Combined administration of recombinant human megakaryocyte growth and development factor and granulocyte colony-stimulation factor enhances multilineage hematopoietic reconstitution in non human primates after radiation-induced marrow aplasia. J Clin Invest, 1996,9 :2145-2151.
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[6]Alexander WS, Roberts AW, Nicola NA, et al. Deficiencies in progenitor cells of multiple hematopoietic lineages and defective megakaryocytopoiesis in mice lacking the thrombopoietic receptor c-mpl. Blood, 1996,87:2162-2170.
[7]Bhatia M, Bonnet D, Kapp U, et al. Quantitative analysis reveals expansion of human hematopoietic repopulating cells after short-term ex vivo culture. J Exp Med, 1997,186:619-624.
[8]Conneally E, Cashman J, Petzer A, et al. Expansion in vitro of transplantable humam cord blood stem cells demonstrated using a quantitative assay of their lymph-myeloid repopulating activity in nonobese diabetic-scid/scid mice. Proc Natl Acad ci USA, 1997,94:9836-9841.
收稿日期：1998-10-20, http://www.100md.com
单位：刘英(100853北京，解放军总医院儿科)； 吕善根(100853北京，解放军总医院儿科)； 冉崇蓉(100853北京，解放军总医院儿科)； 裴雪涛(军事医学科学院放射医学研究所 国家生物医学分析中心)； 李梁(军事医学科学院放射医学研究所 国家生物医学分析中心)； 冯凯(军事医学科学院放射医学研究所 国家生物医学分析中心)； 徐黎(军事医学科学院放射医学研究所 国家生物医学分析中心)
关键词：血小板生成素；膜糖蛋白类；胎血；造血干细胞
中华儿科杂志000208 【摘要】 目的 探讨体外同时扩增粒/巨噬细胞系祖细胞(CFU-GM)、巨核细胞系祖细胞(CFU-Mk)的最佳细胞因子组合。方法 利用免疫磁珠法分离纯化脐血CD+34细胞，在液体培养体系中经干细胞因子(SCF)、白细胞介素(IL)-3、IL-6、粒系集落刺激因子(G-CSF)、FLt-3配基( FLt-3 ligand，FL)、促血小板生成素(thrombopoietin，TPO)等不同细胞因子组合扩增14 d，检测CFU-GM、CFU-Mk、CD+34CD-38细胞等的扩增倍数。结果 TPO可协同SCF、IL-3、IL-6、G-CSF对CFU-GM、CFU-Mk的扩增作用；FL对造血干细胞/早期祖细胞的支持能力高于TPO；FL+SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF组合14 d扩增CFU-GM (70±7)倍、CFU-Mk (118±10)倍，明显高于SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF组合对其所扩增的倍数。结论 FL+SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF组合是体外同时扩增CFU-GM和CFU-Mk的最佳细胞因子组合之一。
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Synergistic effects of FLt-3 ligand and thrombopoietin on the expansion of hematopoietic progenitor cells in cord blood
LIU Ying*, LU Shangen, PEI Xuetao, et al. *
General Hospital of PLA, Beijing 100853, China
【Abstract】 Objective To elucidate the optimal cytokine combinations that would result in the most significantly simultaneous ex vivo expansions of both colony forming unit-granulocyte and macrophage (CFU-GM) and colony forming unit-macrophage(CFU-Mk). Methods CD+34 cells were isolated from umbilical cord blood by using a high-gradient magnetic cell sorting system (MACS), and expanded with various combinations of hematopoietic growth factors (HGFs) which included FLt-3 ligand (FL), thrombopoietin (TPO), stem cell factor (SCF), IL-3, IL-6 granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF), and granulocyte and macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) for 14 days in a liquid culture system. Colony forming cells and antigen expressions were studied by colony forming assays and fluorescence-activated cell sorter (FACS). Results TPO showed synergistic actions with SCF, IL-3, IL-6, G-CSF to expand CFU-GM and CFU-Mk. FL showed a stronger potential for expanding hematopoietic stem cells and early progenitor cells than TPO. The combination of FL+SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF increased expasions of CFU-GM and CFU-Mk by 70±7 fold and 118±10 fold, respectively on day 14 of culture, and was much better than the combination of SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF. Conclusion The combination of FL+SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF might be one of the optimal combinations for significant expansions of CFU-GM and CFU-Mk simultaneously.
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【Key words】 Thrombopoietin; Membrane glycoproteins; Fetal blood; Hematopoietic stem cell
脐血是新近发展起来的极具潜力的造血干细胞来源，迄今为止世界范围内已进行了600多例脐血造血干细胞移植。由于单份脐血祖细胞绝对数量不足，对于较大儿童或成人则有外周血中性粒细胞，尤其是血小板恢复时间延迟等缺陷[1]。成功地体外扩增脐血造血细胞是脐血移植应用于较大儿童及成人的关键问题。FLt-3配基(FLt-3 ligand，FL)和促血小板生成素(thrombopoietin，TPO)为新近发现的两个作用于造血干细胞/早期祖细胞的细胞因子[2，3]。我们利用FL、TPO与其他常用细胞因子的不同组合对脐血CD+34细胞进行体外扩增，探讨体外扩增巨核系和粒/巨噬系祖细胞的最佳细胞因子组合 。
材料和方法
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一、脐血
来自解放军总医院妇产科，肝素抗凝终浓度为20 U/ml，平均采集量为50～70 ml， 采集后24 h内的细胞悬液经PBS缓冲液稀释，Ficoll(相对密度1.077)梯度离心。收集界面层单个核细胞(MNC)，洗涤备用。
二、脐血CD+34细胞的分离
利用Mini MACS免疫磁性系统进行。即抗CD34抗体QBEND -10(Miltenyi Biotec公司， 德国)与细胞悬液1∶5混匀，4℃孵育20 min；1∶5加入羊抗鼠IgG1免疫磁珠，6～8℃孵育20min，洗涤，制成单细胞悬液。标记细胞通过置于磁场内的分离柱，洗脱去除CD-34细胞，将分离柱移出磁场，加压洗脱，收集CD+34细胞。
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三、脐血CD+34细胞体外液体扩增体系
IMDM培养基中含12.5%马血清(HS)、12.5%胎牛血清(FCS)、5×10-7 mol/L氢化可的松、2×104/ml 的CD+34 细胞及重组人造血细胞生长因子(rhHGFs)的终浓度分别为：FL(Immunex公司，美国)40 ng/ml; TPO(Amgen公司，美国)10 ng/ml; SCF(Sandos公司，美国)50 ng/ml; IL-6(Sandos公司，美国)20 ng/ml; IL-3(Sandos公司，美国)2 ng/ml; GM-CSF(Glaxo公司，美国)40 ng/ml; G-CSF(Amgen公司，美国)20 ng/ml。上述体系接种于12孔板中，1ml/孔，复种3孔，37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养14 d。每周半量换液。rhHGFs每48 h加入体系1次，连续加5次。第14天时取出细胞用于细胞总数、CD+34、CD+34 CD-38细胞、粒/巨噬细胞系祖细胞(CFU-GM)及巨核细胞系祖细胞(CFU-Mk)的检测。
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四、实验分组
(1)SCF+IL-3+IL-6+TPO；(2)SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF；(3)SCF+IL-3+GM-CSF+G-CSF；(4)FL+SCF+IL-3+IL-6；(5)FL+SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF。用同一份脐血分离出的CD+34细胞分别在上述5个组合支持的液体体系中扩增，重复3次。
五、造血祖细胞集落培养
CFC试剂盒(军事医学科学院放射医学研究所)含30%HS、10%牛血清白蛋白(BSA)(Sigma公司，美国)、50 ng/ml 的干细胞因子(SCF)、2 ng/ml 的白细胞介素3(IL-3)、40 ng/ml 粒单集落刺激因子(GM-CSF)、5×103 U/ml 的粒系集落刺激因子(G-CSF)、2 U/ml 的促红细胞生成素(EPO)(Bochinger公司，美国)、5×103CD+34细胞/ml或5×104扩增细胞/ml、IMDM及1.35%甲基纤维素。上述体系接种于24孔板中，0.5 ml/孔，复种3孔，37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养14 d，计数CFU-GM。CFU-Mk培养体系中细胞因子为SCF 50 ng/ml，IL-3为2 ng/ml和TPO为 10 ng/ml，且加用5×105 mol/L 的2-巯基乙醇，其余条件同前，7～9 d计数CFU-Mk。
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六、细胞表面标志的流式细胞仪(FACScan BD，美国)分析
标记抗体鼠抗人CD34单抗 FITC-HPCA-2 (BD公司，美国)和鼠抗人CD38单抗PE-leu17 (BD公司，美国)分别用于检测CD+34和CD+34CD-38细胞，1∶10(5 μl / 5×105细胞)稀释，4℃孵育20 min，洗涤送检。
七、统计学方法
用SAS软件对CFU-GM、CFU-Mk、CD+34CD-38细胞3个指标的扩增倍数进行随机单位组方差分析；用Student-Newman-Keuls test进行两两比较，显著性水平设为0.05。
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结果
一、脐血CD+34细胞的分离纯化
MiniMACS分离纯化获得的CD+34细胞经FACS检测，其纯度为90.11%～97.57%；回收率62%～75%。
二、TPO对脐血造血祖细胞的扩增作用
TPO和G-CSF分别为巨核细胞系及粒系特异性生长因子。含TPO的SCF+IL-3+ IL-6+TPO组合14 d扩增CFU-Mk (35±5)倍，SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF组合14 d扩增CFU-Mk (32±4)倍，均明显高于不含TPO的SCF+IL-3+GM-CSF+G-CSF组合(4.0±1.0)倍(P<0.05)；G-CSF加入SCF+IL-3+IL-6+TPO对CFU-Mk的扩增倍数无明显影响(P>0.05)。SCF+IL-3+ IL-6+TPO+G-CSF对CFU-GM的扩增能力也明显强于SCF+IL-3+GM-CSF+G-CSF，前者14 d扩增CFU-GM (26±3)倍，后者(12.9±2.2)倍(P<0.05)。可见，TPO不仅对巨核细胞系祖细胞的增殖有明显作用，还可协同G-CSF刺激粒系造血。G-CSF对TPO诱导巨核细胞系分化无显著影响。
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三、FL对脐血早期造血祖细胞的体外扩增作用
CD+34CD-38细胞包括造血干细胞和早期造血祖细胞，这些细胞对早期造血细胞因子，如SCF、IL-3、IL-6无反应，而FL可诱导它们由静止期进入增殖期[4]。FL单独作用只有很弱的集落刺激活性，但与SCF、IL-3、IL-6联合具有十分明显的协同作用，14 d扩增CD+34、CD-38细胞(46±4)倍 ，对细胞分化的压力明显低于含特异性生长因子的SCF+IL3+IL-6+ TPO+G-CSF的组合，后者14 d扩增CD+34CD-38 细胞为(5.3±1.2)倍(P<0.05)。
四、FL、TPO联用对脐血造血祖细胞的扩增作用
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FL+SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF组合14 d扩增CFU-GM (70±7)倍、CFU-Mk (118±10)倍，均明显高于不含FL的组合(P<0.05)。表明，在SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF的组合中加入FL，可加强该体系的支持能力，从而更有效地提高CFU-GM、CFU-Mk的扩增倍数。
讨论
造血细胞生长因子支持的体外扩增为目前造血干细胞体外扩增最广泛的使用方法。以SCF+IL-3为基础的常用组合扩增造血细胞同时伴有造血干细胞/早期祖细胞分化，既限制祖细胞的扩增程度，又影响扩增细胞在体内的长期造血重建。解决问题的关键在于鉴定和分离出可维持造血干细胞自我更新能力的细胞因子。
TPO是促进巨核细胞发育和血小板生成的细胞因子，但大量研究表明其具有协同多系造血的活性。经TPO治疗的猴多向祖细胞(CFU-GEMM)水平上调[5]；c-mpl(是细胞因子TPO的受体)缺陷小鼠的所有造血祖细胞包括多潜能祖细胞及各系定向祖细胞的数量均减少[6]，可见TPO不仅能促进巨核细胞的增殖和分化，并且与其他造血细胞生长因子(HGF)联用还可促进造血干细胞的全系造血[3]。我们研究所用的SCF+IL-3+ IL-6+TPO+G-CSF组合就可较好地同时诱导巨核细胞系和粒/巨噬细胞系祖细胞的分化，且扩增效率显著高于SCF+IL-3+GM-CSF+G-CSF的组合。
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FL可诱导处于静止期的造血干细胞/早期祖细胞进入增殖期，使他们对早期造血细胞因子，如 SCF、IL-3、IL-6产生增殖反应。Bhatia等[7]和Conneally 等[8]的研究结果均表明，FL+ SCF+IL-3+IL-6+G-CSF组合可在体外短期维持造血干细胞的自我更新能力。我们的研究则表明，FL+SCF+IL-3+IL-6对扩增体系的支持能力高于SCF+IL-3+IL-6+TPO+G-CSF。两个组合联合形成的FL+SCF+ IL-3+ IL-6+TPO+G-CSF可进一步提高CFU-GM和CFU-Mk的扩增倍数。我们在随后的实验中将该组合扩增14 d的脐血细胞移植亚致死剂量照射的严重联合免疫缺陷病(SCID)小鼠取得成功，并在移植后存活6周的SCID小鼠骨髓中仍检测到人造血细胞。提示该组合可保留造血干细胞/早期祖细胞自我更新及造血重建的能力。因此，FL+SCF+ IL-3+ IL-6+TPO+G-CSF组合是满足临床移植需要的最佳细胞因子组合之一，在脐血移植中用于较大儿童及成人。在减少外周血干细胞动员次数和分离时间、自体造血干细胞移植时的肿瘤净化、造血干细胞作为靶细胞的基因治疗、大剂量放化疗后的造血支持治疗等方面具有广阔的应用前景。
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基金项目：国家杰出青年科学基金资助项目(39825111)
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收稿日期：1998-10-20, http://www.100md.com