MIP-1α和PF4对造血干/祖细胞作用的对比研究
作者：吴燕峰 黄科 黄绍良
单位：510120 广州市，中山医科大学孙逸仙纪念医院儿科
关键词：造血生长因子；造血祖细胞；造血干细胞；血小板因子4
实用医学杂志000707 摘 要 目的：研究化疗时巨噬细胞炎症蛋白(macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α)和血小板第4因子(platelet factor 4,PF4)对造血干/祖细胞的保护作用。方法：骨髓标本13份，脐血标本10份。分4组：A组为MIP-1α，B组为PF4，C组MIP-1α+PF4，D组为空白对照组，分别检测其细胞周期、细胞活性、集落形成能力等。结果：3个实验组细胞的S+G2期百分比均显著低于D组(P<0.05)；单个核细胞均明显高于D组(P<0.05)；粒-巨噬细胞系集落明显少于预处理前(P<0.05)，但均高于对照组(P<0.05)。C组与A，B组差异无显著意义。结论：化疗过程中，MIP-1α和PF4对造血干/祖细胞有可逆性、选择性保护作用；二者之间无协同作用。
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肿瘤患者化疗后，骨髓造血抑制是常见的并发症，严重时危及患者生命。处于细胞增殖期的造血干/祖细胞由于对化疗药物特别敏感，骨髓抑制严重，所以临床上常用的造血正调控因子疗效也不理想。目前，国内外已将研究重点集中在造血负调控因子。巨噬细胞炎症蛋白(macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α)和血小板第4因子(platelet factor 4,PF4)是两种选择性作用于造血干/祖细胞的负调控因子[1]。但有关两者的侧重点以及是否有协同作用，国内外尚少见报告。本研究通过检测细胞周期、细胞活性、集落形成能力等，比较MIP-1α和PF4单用及联合应用的效果，为临床工作提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验细胞 (1)骨髓标本13份，来自下列13例患者：白血病完全缓解期6例，地中海贫血1例，特发性血小板减少性紫癜2例，淋巴瘤未侵犯骨髓4例。每例均抽取骨髓组织3 ml，肝素抗凝，12 h内分离单个有核细胞。(2)脐血标本10份，每份脐血15 ml，4℃保存，24 h内分离单个有核细胞。
, 百拇医药
1.2 实验方法 (1)将骨髓及脐血标本用1640稀释后加到等量Ficoll分离液液面上，离心20 min(2 000 r/min)，将富含有核细胞的液层吸出，与1640培养液混合离心10 min，将沉淀细胞加入1640+10%胎牛血清(FCS)，制成细胞悬液。细胞终浓度2×106，细胞存活率95%，培养24 h后备用。(2)将复苏后的HL-60细胞悬浮于1640+10%FCS中培养，2～3 d传代一次，细胞浓度2×106，细胞存活率95%以上。(3)实验分4组：A组为MIP-1α，B组为PF4，C组为MIP-1α+PF4，D组为空白对照组。采自每个病例的骨髓及脐血标本均分为5份，分别供A，B，C，D组及预处理前组使用。(4)流式细胞仪(FACS)检测细胞增殖周期：SG2可作为造血干/祖细胞从G0期进入增殖周期的指标。各实验组细胞培养48 h后，培养液洗涤，每份细胞>105，以70%冰酒精固定过夜，FACS测出细胞各周期的DNA相对含量和百分数。以胎盘蓝染色细胞，30 s到1 min内计算细胞拒染数，即为细胞拒染率。FACS测定CD34，CD38细胞含量：每个样品细胞数≥5×104单个核细胞(MNC)，标记抗体为藻红蛋白(PE)结合的CD抗体和异硫氰酸(FITC)标记的CD38抗体，对照为免疫球蛋白藻红蛋白(IG-PE)标记和免疫球蛋白G异硫氰酸(IGG-FITC)标记。根据PE和FITC的荧光激发特性进行双标记参数分析。体外造血干/祖细胞集落培养：第7～14天计数粒-巨噬细胞系集落(CFU-GM)，40个以上细胞组成的细胞团为一个集落。
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1.3 统计学处理 多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。
2 结果
2.1 MIP-1α和PF4对造血细胞增殖周期的影响 见表1。
2.2 MIP-1α和PF4对MNC存活率的影响 A，B，C，D 4组的骨髓MNC分别为79%±6%，74%±9%，79%±6%，48%±14%；脐血MNC分别为79.9%±5.7%，78.2%±4.7%，77.0%±5.4%，59.6%±8.3%。结果表明，加因子的A，B，C 3组的MNC均明显高于D组(P<0.05)，但加因子各组之间差异无显著意义。
表1 MIP-1α及PF4对细胞增殖周期的调控(
±s) 组别
, 百拇医药
骨髓MNC
脐血MNC
HL-60细胞
A组
14.08±7.13*
6.04±2.70*
53.73±27.50
B组
18.68±8.06*
7.88±2.87*
55.46±21.10
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C组
14.32±7.93*
7.45±3.67*
51.03±20.00
D组
24.80±8.10
11.84±3.46
52.80±26.8
注：与D组比较 * P<0.05
2.3 MIP-1α和PF4对CFU-GM的影响 MIP-1α和PF4对造血干/祖细胞集落形成有明显影响，A，B，C 3个实验组CFU-GM明显少于预处理前(P<0.05)，但均高于D组(P<0.05)，且集落大，维持时间长。A，B，C 3个实验组的集落数均差异无显著意义。见表2及表3。
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表2 MIP-1α及PF4对骨髓造血干/祖细胞集落的影响(±s) 组别
检测时间(d)
7
14
21
预处理前组
146.23±67.97
121.51±65.28
82.71±49.99
A组
, 百拇医药
82.23±52.86*△
90.90±61.96*△
69.23±53.78*△
B组
73.16±44.43*△
78.22±50.08*△
61.11±30.67*△
C组
69.12±24.66*△
79.27±30.79*△
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62.33±20.12*△
D组
33.25±14.43*
22.60±7.53*
8.10±7.13*
注：与预处理前组比较，*P<0.05；与D组比较，△P<0.05表3 MIP-1α及PF4对脐血造血干/祖细胞集落的影响(±s) 组别
检测时间(d)
7
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14
21
预处理前组
53.3±13.9
143.6±42.6
81.4±21.5
A组
48.0±17.5*△
74.9±25.3*△
48.6±19.1*△
B组
, 百拇医药 42.7±17.5*△
60.7±18.5*△
47.2±14.5*△
C组
47.1±11.9*△
59.7±20.5*△
39.0±9.5*△
D组
24.9±9.4*
38.9±10.2*
, 百拇医药
13.6±5.7*
注：与预处理前组比较，*P<0.05；与D组比较，△P<0.05
3 讨论
肿瘤患者化疗后的骨髓抑制目前仍然是一个棘手的问题。徐兵等[2]报道化疗后的骨髓抑制发生率成人达33.3%～75%，相关病死率为5.6%～44.4%。在处理方面，人们多选择刺激因子促进化疗后骨髓造血恢复，主要促进中性粒细胞从G0期进入S期，缩短细胞周期，其有效率为70%～80%，但对骨髓抑制严重或已并发感染的病例效果不理想[3]。
骨髓造血细胞中80%～90%的细胞处于静止期，对周期特异性化疗药物不敏感，耐受性好。因此，人们寻找既阻止正常造血细胞进入增殖期，又不影响肿瘤细胞增殖周期的药物。国内外近年来的研究[1～5]证明，MIP-1α，PF4等造血负调控因子具有上述功能。
, 百拇医药
Lord等[4]于1993年发现经MIP-1α预处理可使处于增殖状态的克隆形成单位(CFUS)细胞转入静止期，对静止期的CFUS则抑制DNA合成，阻止细胞进入细胞周期，免受周期特异性药物的影响，而去除化疗药物后细胞能形成集落。PF4对造血细胞增殖具有可逆性抑制作用，主要机制是抑制细胞DNA合成。
本实验显示，MIP-1α和PF4单独应用或联合应用可明显提高正常骨髓及脐血造血细胞对周期特异性化疗药物的耐受性，表现为细胞存活率、CD+34及CD-38细胞含量较空白对照组明显增高(P<0.05)。
国外有学者[5]报道，某些负调控因子具有协同作用。但本实验发现A，B，C 3组的结果与预处理前相比，差异均有显著意义，而3组之间的差异无统计学意义。这说明MIP-1α和PF4两因子无协同保护作用，可能是由于两者联合应用与单因子应用的作用机制相同所致。因此，临床上若想达到协同保护效应，必须选择分子机制、作用途径不同的负调控因子联合应用，以便更好地保护造血细胞。
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参考文献
1，Graham GL,Wringht EG. Identification and characterization of an inhibitor of haemopoietic stem cell proliferation. Nature,1990,344(6265):442～444.
2，徐 兵，周淑芸，刘启发，等. 不同化疗方案治疗老年人急性髓系白血病观察. 实用中西医结合肿瘤杂志，1997，28(1)：17～20 .
3，周敦华，黄绍良. rhG-CSF对小儿急性淋巴细胞白血病化疗后白细胞减少的疗效观察. 中国实用儿科杂志，1996，11(增刊)：170.
4，Lord BI,Dexter TM,Clements JM. Macrophage-inflammatory protein protects multipotent henatopoietic cells from the cyotoxic effects of hydroxyurea in vivo. Blood,1992,79(10):2605～2609.
5，Sten EW,Jacobsen RT,Francis W,et al. The growth response of Lin-thy-1 hematopoietic progenitors to cytokine is determined by the balance between symengy of multiple stimulators and megative cooperation of multiple inhibitors. Exp Hematol,1994,22(10):985～989.
(修回日期：2000-03-09), 百拇医药
单位：510120 广州市，中山医科大学孙逸仙纪念医院儿科
关键词：造血生长因子；造血祖细胞；造血干细胞；血小板因子4
实用医学杂志000707 摘 要 目的：研究化疗时巨噬细胞炎症蛋白(macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α)和血小板第4因子(platelet factor 4,PF4)对造血干/祖细胞的保护作用。方法：骨髓标本13份，脐血标本10份。分4组：A组为MIP-1α，B组为PF4，C组MIP-1α+PF4，D组为空白对照组，分别检测其细胞周期、细胞活性、集落形成能力等。结果：3个实验组细胞的S+G2期百分比均显著低于D组(P<0.05)；单个核细胞均明显高于D组(P<0.05)；粒-巨噬细胞系集落明显少于预处理前(P<0.05)，但均高于对照组(P<0.05)。C组与A，B组差异无显著意义。结论：化疗过程中，MIP-1α和PF4对造血干/祖细胞有可逆性、选择性保护作用；二者之间无协同作用。
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肿瘤患者化疗后，骨髓造血抑制是常见的并发症，严重时危及患者生命。处于细胞增殖期的造血干/祖细胞由于对化疗药物特别敏感，骨髓抑制严重，所以临床上常用的造血正调控因子疗效也不理想。目前，国内外已将研究重点集中在造血负调控因子。巨噬细胞炎症蛋白(macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α)和血小板第4因子(platelet factor 4,PF4)是两种选择性作用于造血干/祖细胞的负调控因子[1]。但有关两者的侧重点以及是否有协同作用，国内外尚少见报告。本研究通过检测细胞周期、细胞活性、集落形成能力等，比较MIP-1α和PF4单用及联合应用的效果，为临床工作提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验细胞 (1)骨髓标本13份，来自下列13例患者：白血病完全缓解期6例，地中海贫血1例，特发性血小板减少性紫癜2例，淋巴瘤未侵犯骨髓4例。每例均抽取骨髓组织3 ml，肝素抗凝，12 h内分离单个有核细胞。(2)脐血标本10份，每份脐血15 ml，4℃保存，24 h内分离单个有核细胞。
, 百拇医药
1.2 实验方法 (1)将骨髓及脐血标本用1640稀释后加到等量Ficoll分离液液面上，离心20 min(2 000 r/min)，将富含有核细胞的液层吸出，与1640培养液混合离心10 min，将沉淀细胞加入1640+10%胎牛血清(FCS)，制成细胞悬液。细胞终浓度2×106，细胞存活率95%，培养24 h后备用。(2)将复苏后的HL-60细胞悬浮于1640+10%FCS中培养，2～3 d传代一次，细胞浓度2×106，细胞存活率95%以上。(3)实验分4组：A组为MIP-1α，B组为PF4，C组为MIP-1α+PF4，D组为空白对照组。采自每个病例的骨髓及脐血标本均分为5份，分别供A，B，C，D组及预处理前组使用。(4)流式细胞仪(FACS)检测细胞增殖周期：SG2可作为造血干/祖细胞从G0期进入增殖周期的指标。各实验组细胞培养48 h后，培养液洗涤，每份细胞>105，以70%冰酒精固定过夜，FACS测出细胞各周期的DNA相对含量和百分数。以胎盘蓝染色细胞，30 s到1 min内计算细胞拒染数，即为细胞拒染率。FACS测定CD34，CD38细胞含量：每个样品细胞数≥5×104单个核细胞(MNC)，标记抗体为藻红蛋白(PE)结合的CD抗体和异硫氰酸(FITC)标记的CD38抗体，对照为免疫球蛋白藻红蛋白(IG-PE)标记和免疫球蛋白G异硫氰酸(IGG-FITC)标记。根据PE和FITC的荧光激发特性进行双标记参数分析。体外造血干/祖细胞集落培养：第7～14天计数粒-巨噬细胞系集落(CFU-GM)，40个以上细胞组成的细胞团为一个集落。
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1.3 统计学处理 多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。
2 结果
2.1 MIP-1α和PF4对造血细胞增殖周期的影响 见表1。
2.2 MIP-1α和PF4对MNC存活率的影响 A，B，C，D 4组的骨髓MNC分别为79%±6%，74%±9%，79%±6%，48%±14%；脐血MNC分别为79.9%±5.7%，78.2%±4.7%，77.0%±5.4%，59.6%±8.3%。结果表明，加因子的A，B，C 3组的MNC均明显高于D组(P<0.05)，但加因子各组之间差异无显著意义。
表1 MIP-1α及PF4对细胞增殖周期的调控(
±s) 组别, 百拇医药
骨髓MNC
脐血MNC
HL-60细胞
A组
14.08±7.13*
6.04±2.70*
53.73±27.50
B组
18.68±8.06*
7.88±2.87*
55.46±21.10
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C组
14.32±7.93*
7.45±3.67*
51.03±20.00
D组
24.80±8.10
11.84±3.46
52.80±26.8
注：与D组比较 * P<0.05
2.3 MIP-1α和PF4对CFU-GM的影响 MIP-1α和PF4对造血干/祖细胞集落形成有明显影响，A，B，C 3个实验组CFU-GM明显少于预处理前(P<0.05)，但均高于D组(P<0.05)，且集落大，维持时间长。A，B，C 3个实验组的集落数均差异无显著意义。见表2及表3。
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表2 MIP-1α及PF4对骨髓造血干/祖细胞集落的影响(
±s) 组别检测时间(d)
7
14
21
预处理前组
146.23±67.97
121.51±65.28
82.71±49.99
A组
, 百拇医药
82.23±52.86*△
90.90±61.96*△
69.23±53.78*△
B组
73.16±44.43*△
78.22±50.08*△
61.11±30.67*△
C组
69.12±24.66*△
79.27±30.79*△
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62.33±20.12*△
D组
33.25±14.43*
22.60±7.53*
8.10±7.13*
注：与预处理前组比较，*P<0.05；与D组比较，△P<0.05表3 MIP-1α及PF4对脐血造血干/祖细胞集落的影响(
±s) 组别检测时间(d)
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预处理前组
53.3±13.9
143.6±42.6
81.4±21.5
A组
48.0±17.5*△
74.9±25.3*△
48.6±19.1*△
B组
, 百拇医药 42.7±17.5*△
60.7±18.5*△
47.2±14.5*△
C组
47.1±11.9*△
59.7±20.5*△
39.0±9.5*△
D组
24.9±9.4*
38.9±10.2*
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13.6±5.7*
注：与预处理前组比较，*P<0.05；与D组比较，△P<0.05
3 讨论
肿瘤患者化疗后的骨髓抑制目前仍然是一个棘手的问题。徐兵等[2]报道化疗后的骨髓抑制发生率成人达33.3%～75%，相关病死率为5.6%～44.4%。在处理方面，人们多选择刺激因子促进化疗后骨髓造血恢复，主要促进中性粒细胞从G0期进入S期，缩短细胞周期，其有效率为70%～80%，但对骨髓抑制严重或已并发感染的病例效果不理想[3]。
骨髓造血细胞中80%～90%的细胞处于静止期，对周期特异性化疗药物不敏感，耐受性好。因此，人们寻找既阻止正常造血细胞进入增殖期，又不影响肿瘤细胞增殖周期的药物。国内外近年来的研究[1～5]证明，MIP-1α，PF4等造血负调控因子具有上述功能。
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Lord等[4]于1993年发现经MIP-1α预处理可使处于增殖状态的克隆形成单位(CFUS)细胞转入静止期，对静止期的CFUS则抑制DNA合成，阻止细胞进入细胞周期，免受周期特异性药物的影响，而去除化疗药物后细胞能形成集落。PF4对造血细胞增殖具有可逆性抑制作用，主要机制是抑制细胞DNA合成。
本实验显示，MIP-1α和PF4单独应用或联合应用可明显提高正常骨髓及脐血造血细胞对周期特异性化疗药物的耐受性，表现为细胞存活率、CD+34及CD-38细胞含量较空白对照组明显增高(P<0.05)。
国外有学者[5]报道，某些负调控因子具有协同作用。但本实验发现A，B，C 3组的结果与预处理前相比，差异均有显著意义，而3组之间的差异无统计学意义。这说明MIP-1α和PF4两因子无协同保护作用，可能是由于两者联合应用与单因子应用的作用机制相同所致。因此，临床上若想达到协同保护效应，必须选择分子机制、作用途径不同的负调控因子联合应用，以便更好地保护造血细胞。
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参考文献
1，Graham GL,Wringht EG. Identification and characterization of an inhibitor of haemopoietic stem cell proliferation. Nature,1990,344(6265):442～444.
2，徐 兵，周淑芸，刘启发，等. 不同化疗方案治疗老年人急性髓系白血病观察. 实用中西医结合肿瘤杂志，1997，28(1)：17～20 .
3，周敦华，黄绍良. rhG-CSF对小儿急性淋巴细胞白血病化疗后白细胞减少的疗效观察. 中国实用儿科杂志，1996，11(增刊)：170.
4，Lord BI,Dexter TM,Clements JM. Macrophage-inflammatory protein protects multipotent henatopoietic cells from the cyotoxic effects of hydroxyurea in vivo. Blood,1992,79(10):2605～2609.
5，Sten EW,Jacobsen RT,Francis W,et al. The growth response of Lin-thy-1 hematopoietic progenitors to cytokine is determined by the balance between symengy of multiple stimulators and megative cooperation of multiple inhibitors. Exp Hematol,1994,22(10):985～989.
(修回日期：2000-03-09), 百拇医药