出血热病毒R22株感染对培养的脐静脉内皮细胞细胞周期及DNA合成率的影响
作者：孟冀昌 古春雷 姚磊 曾萍
单位：孟冀昌 古春雷 姚磊 第三军医大学基础医学部微生物学教研室 重庆，400038；曾萍 四川雅安卫生学校生化教研室 雅安，625000
关键词：肾综合征出血热病毒；内皮细胞；细胞周期；DNA合成率
Effects of HFRS virus R22 strain infection on the cell cycle and DNA synthesis rate of cultured human umbilical vein endothelialEffects of HFRS virus R22 strain infection on the cell cycle and DNA synthesis rate of cultured human umbilical vein endothelial cells
, 百拇医药
提要 方法：采用流式细胞术和3H-TdR渗入法。目的：分析肾综合征出血热病毒R22株感染对人血管内皮细胞(HECs)的细胞周期和细胞DNA合成率的影响。结果：病毒感染可明显延缓HECs细胞周期进程，降低细胞DNA合成率，细胞增殖受到明显的抑制，结论：HFRS病毒对HECs有直接致病作用。
中图法分类号 R373.32
肾综合征出血热(HFRS)病毒感染体外培养的人血管内皮细胞(HECs)的研究表明，虽然感染细胞不发生明显的细胞病变(CPE)，但HECs在细胞超微结构、细胞功能和代谢等方面有一定程度的改变。提示HFRS病毒对HECs有直接致病作用[1]。本实验对HFRS病毒R22株感染培养的HECs的细胞周期和细胞DNA合成率进行了初步研究，现将结果报告如下。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 人脐静脉血管内皮细胞的分离、培养和鉴定
参照Jaffe[2]方法进行。血管内皮细胞的鉴定，依据倒置显微镜观察细胞的形态、排列和生长特性以及直接免疫酶法检测凝血Ⅷ因子相关抗原(Ⅷ∶Ag)来进行鉴定。本实验所用细胞均为原代培养细胞。
1.2 病毒
HFRS病毒R22株由中国预防医学科学院病毒学研究所提供。
1.3 受染HECs的细胞的周期分析
应用流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)对受染48 h后的HECs的细胞周期进行分析，基本步骤如下：取病毒感染48 h后的HECs，0.25%胰酶消化细胞，PBS制备细胞悬液(1.0×106/ml)，加至70%冷乙醇中固定。离心，轻吸弃上清，余少量液体，振悬细胞沉淀，摇匀。RNA酶室温消化10 min，碘化丙啶(PI)室温染色10 min。用流式细胞汁(FACStar PLUS，美国Becton-Dickinson公司产品)对细胞进行自动分析和计数。设置正常细胞对照组。
, 百拇医药
1.4 受染HECs的细胞DNA合成率分析
在应用FCM分析受染细胞细胞周期的同时，采用3H-TdR掺入法检测受染细胞DNA合成率的改变。其基本步骤如下：用96孔细胞培养板制备HECs单层细胞(约2000个细胞/孔)。病毒感染36 h后，加入3H-TdR 37 κB/孔(3H-TdR购自中国科学院原子核研究所)，继续培养12 h。吸弃上清，PBS充分漂洗，0.25%胰酶消化细胞，将消化液收至闪烁瓶内。再用PBS吹吸培养孔2次，一并收集到同一闪烁瓶内。加入水溶性闪烁液20 ml至完全溶液，室温放置2 h后，用LKB液体闪烁计数仪测定每瓶Bq(衰变率/min，Bq=dpm=cpm/E, cpm-计数率/分，E-管效应)。同时设置正常细胞对照组。
2 结果
2.1 受染HECs细胞周期的分析
, 百拇医药
FCM测定细胞周期各时相的百分比，数据显示为一维单参数直方图，经计算机处理，测得感染细胞周期各时相的百分比。经统计学处理，感染组G2+M+S期细胞百分比(23.8%±2.0%)明显低于正常细胞组(36.2±1.8%)，两者相差非常显著。
2.2 受染细胞DNA合成率的测定
感染细胞组3H-TdR摄入量为(1498.75±91.67)Bq/孔，而正常细胞组为(1698.95±191.71)Bq/孔，经统计学处理，感染组3H-TdR摄入量明显低于正常细胞组。两者相差显著(P<0.05)。
3 讨论
张继明等[3]用76.118和UR两株汉坦病毒感染HECs，应用FCM检测HECs的细胞周期，发现病毒感染组S期细胞的相对数明显低于正常细胞对照组(P<0.05)，认为HFRS病毒感染对HECs的细胞周期进程有明显的影响。为了解HFRS病毒R22株感染是否可以影响HECs的细胞周期及细胞DNA合成，本实验在应用FCM检测细胞周期的同时，采用3H-TdR掺入法对感染细胞DNA合成率进行检测，结果发现在早期(48 h)病毒感染组G2+M+S期细胞百分数明显低于正常细胞对照组(P<0.01)，对3H-TdR的摄入量也明显减少(P<0.05)，表明HFRS病毒感染，可明显减缓HECs细胞周期进程，降低细胞DNA合成率，抑制细胞的增殖，该结果为HFRS病毒对HECs的直接致病作用提供了证据，此外，这是否能部分说明HFRS病毒对HECs直接致病作用的机制，尚待进一步的研究。
, http://www.100md.com
参考文献
1 朱 平，杨为松，刘 健，等.肾综合征出血热病毒感染人血管内皮细胞的观察.中华医学杂志，1989，69(10)：588
2 Jaffe E A, Nachman R L, Becker C G, et al. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphological criteria. J Clin Invest,1973,52(11):2745
3 张继明，孙 涛，杨佩珍，等.汉坦病毒感染对人血管内皮细胞的细胞周期进程的影响.中国媒介生物学控制杂志，1994，5(特1)：87
(收稿：1998-05-19；修回：1999-01-04), 百拇医药
单位：孟冀昌 古春雷 姚磊 第三军医大学基础医学部微生物学教研室 重庆，400038；曾萍 四川雅安卫生学校生化教研室 雅安，625000
关键词：肾综合征出血热病毒；内皮细胞；细胞周期；DNA合成率
Effects of HFRS virus R22 strain infection on the cell cycle and DNA synthesis rate of cultured human umbilical vein endothelialEffects of HFRS virus R22 strain infection on the cell cycle and DNA synthesis rate of cultured human umbilical vein endothelial cells
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提要 方法：采用流式细胞术和3H-TdR渗入法。目的：分析肾综合征出血热病毒R22株感染对人血管内皮细胞(HECs)的细胞周期和细胞DNA合成率的影响。结果：病毒感染可明显延缓HECs细胞周期进程，降低细胞DNA合成率，细胞增殖受到明显的抑制，结论：HFRS病毒对HECs有直接致病作用。
中图法分类号 R373.32
肾综合征出血热(HFRS)病毒感染体外培养的人血管内皮细胞(HECs)的研究表明，虽然感染细胞不发生明显的细胞病变(CPE)，但HECs在细胞超微结构、细胞功能和代谢等方面有一定程度的改变。提示HFRS病毒对HECs有直接致病作用[1]。本实验对HFRS病毒R22株感染培养的HECs的细胞周期和细胞DNA合成率进行了初步研究，现将结果报告如下。
1 材料和方法
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1.1 人脐静脉血管内皮细胞的分离、培养和鉴定
参照Jaffe[2]方法进行。血管内皮细胞的鉴定，依据倒置显微镜观察细胞的形态、排列和生长特性以及直接免疫酶法检测凝血Ⅷ因子相关抗原(Ⅷ∶Ag)来进行鉴定。本实验所用细胞均为原代培养细胞。
1.2 病毒
HFRS病毒R22株由中国预防医学科学院病毒学研究所提供。
1.3 受染HECs的细胞的周期分析
应用流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)对受染48 h后的HECs的细胞周期进行分析，基本步骤如下：取病毒感染48 h后的HECs，0.25%胰酶消化细胞，PBS制备细胞悬液(1.0×106/ml)，加至70%冷乙醇中固定。离心，轻吸弃上清，余少量液体，振悬细胞沉淀，摇匀。RNA酶室温消化10 min，碘化丙啶(PI)室温染色10 min。用流式细胞汁(FACStar PLUS，美国Becton-Dickinson公司产品)对细胞进行自动分析和计数。设置正常细胞对照组。
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1.4 受染HECs的细胞DNA合成率分析
在应用FCM分析受染细胞细胞周期的同时，采用3H-TdR掺入法检测受染细胞DNA合成率的改变。其基本步骤如下：用96孔细胞培养板制备HECs单层细胞(约2000个细胞/孔)。病毒感染36 h后，加入3H-TdR 37 κB/孔(3H-TdR购自中国科学院原子核研究所)，继续培养12 h。吸弃上清，PBS充分漂洗，0.25%胰酶消化细胞，将消化液收至闪烁瓶内。再用PBS吹吸培养孔2次，一并收集到同一闪烁瓶内。加入水溶性闪烁液20 ml至完全溶液，室温放置2 h后，用LKB液体闪烁计数仪测定每瓶Bq(衰变率/min，Bq=dpm=cpm/E, cpm-计数率/分，E-管效应)。同时设置正常细胞对照组。
2 结果
2.1 受染HECs细胞周期的分析
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FCM测定细胞周期各时相的百分比，数据显示为一维单参数直方图，经计算机处理，测得感染细胞周期各时相的百分比。经统计学处理，感染组G2+M+S期细胞百分比(23.8%±2.0%)明显低于正常细胞组(36.2±1.8%)，两者相差非常显著。
2.2 受染细胞DNA合成率的测定
感染细胞组3H-TdR摄入量为(1498.75±91.67)Bq/孔，而正常细胞组为(1698.95±191.71)Bq/孔，经统计学处理，感染组3H-TdR摄入量明显低于正常细胞组。两者相差显著(P<0.05)。
3 讨论
张继明等[3]用76.118和UR两株汉坦病毒感染HECs，应用FCM检测HECs的细胞周期，发现病毒感染组S期细胞的相对数明显低于正常细胞对照组(P<0.05)，认为HFRS病毒感染对HECs的细胞周期进程有明显的影响。为了解HFRS病毒R22株感染是否可以影响HECs的细胞周期及细胞DNA合成，本实验在应用FCM检测细胞周期的同时，采用3H-TdR掺入法对感染细胞DNA合成率进行检测，结果发现在早期(48 h)病毒感染组G2+M+S期细胞百分数明显低于正常细胞对照组(P<0.01)，对3H-TdR的摄入量也明显减少(P<0.05)，表明HFRS病毒感染，可明显减缓HECs细胞周期进程，降低细胞DNA合成率，抑制细胞的增殖，该结果为HFRS病毒对HECs的直接致病作用提供了证据，此外，这是否能部分说明HFRS病毒对HECs直接致病作用的机制，尚待进一步的研究。
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参考文献
1 朱 平，杨为松，刘 健，等.肾综合征出血热病毒感染人血管内皮细胞的观察.中华医学杂志，1989，69(10)：588
2 Jaffe E A, Nachman R L, Becker C G, et al. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphological criteria. J Clin Invest,1973,52(11):2745
3 张继明，孙 涛，杨佩珍，等.汉坦病毒感染对人血管内皮细胞的细胞周期进程的影响.中国媒介生物学控制杂志，1994，5(特1)：87
(收稿：1998-05-19；修回：1999-01-04), 百拇医药