补肾活血中药对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞的影响
作者：谢学军 李翔 肖丹 王毅 杨红 谢春光
单位：谢学军 李翔(成都中医药大学眼科，成都 610075)；肖丹(成都中医药大学制剂教研室)；王毅(成都中医药大学附属医院病理科)；杨红(四川省人民医院病理科)；谢春光(成都中医药大学内科)
关键词：糖尿病；视网膜神经节细胞；Nissl小体；补肾活血
中国中医眼科杂志000403 [摘 要]目的 探讨补肾活血中药对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞的影响。方法 以链脲佐菌素造成大鼠糖尿病模型。利用微机图像分析技术对视网膜神经细胞胞体中Nissl小体进行定量测定和分析。结果 中药治疗组的糖尿病大鼠视网膜神经节细胞胞体中Nissl小体减少程度明显低于阴性对照组和阳性对照Ⅰ组。结论 补肾活血中药有减轻实验性糖尿病大鼠视网膜神经节细胞病理损害的作用。
中图分类号：R289.5；R774.1 文献标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1002-4379(2000)04-0195-04
An observation of influence of traditional Chinese medicine for bushenhuoxue(补肾活血)therapy on retinal ganglion cells in experimental diabetic rats
XIE Xuejun,LI Xiang,XIAO Dan,et al.
(Department of Ophthalmology,Chengdu Traditional Chinese Medicine University,Chengdu 610075,China)
[Abstract]OBJECTIVE To investigate the effect of traditional Chinese medicine for bushenhuoxue(补肾活血) therapy on the pathological damages of the diabetic rats retinal ganglion cells.METHODS The animal model of diabetes was introduced by streptozotocin.The Nissl bodies in the retinal ganglion cells were measured and analyzed quantitatively using computer image analysis system.RESULTS The lost degrees of the Nissl bodies in the diabetic rats retinal ganglion cells in the treated groups were significantly lower than those in both negative and positive control groups.CONCLUSION Traditional Chinese medicine for bushenhuoxue could alleviate the pathological damages of retinal ganglion cells in experimental diabetic rats.
, 百拇医药
[Key words]diabetes mellitus(DM);retinal ganglion cells(RGC);Nissl bodies;bushenhuoxue(补肾活血)
1999年5月～9月我们通过计算机图像分析系统对糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGC)的Nissl小体进行测量和分析，旨在观察补肾活血中药对DM大鼠RGC的保护作用。
1 材料和方法
1.1 实验动物
选用SD大鼠，体重125～150g，雌雄各半。喂养训化两周后，将链脲佐菌素(美国Sigma公司产)溶于0.1mol/L、pH4.6的柠檬酸钠缓冲液中，浓度为1%，随配随用，按50mg/kg体重的剂量行大鼠左下腹皮下注射。造模48h后，于禁食12h后取尾静脉血测定血糖，将血糖浓度大于11.1mmol/L者纳入DM大鼠，并开始计算病程，病程6个月时处死实验动物，同时再测定血糖浓度。
, http://www.100md.com
1.2 动物分组与给药
将DM大鼠按血糖浓度及性别不同，随机分为阴性对照组，阳性对照Ⅰ组，阳性对照Ⅱ组，中药高、中、低剂量组，未造模型的正常同龄鼠为正常对照组。每组动物20只。各实验组灌胃药物均用0.5%羧甲基纤维素溶解为混悬液。
正常对照组：自由摄食饮水，不加任何处理。阴性对照组：每只大鼠灌胃与中药组等容的0.5%羧甲基纤维素溶液。阳性对照Ⅰ组：每只大鼠灌胃相当于成人剂量10倍的降糖灵混悬液每日16.67mg/kg。阳性对照Ⅱ组：每只大鼠灌胃相当于成人剂量10倍的降糖灵和导升明混悬液。中药高、中、低剂量组分别给予相当于临床用药量15倍、10倍及5倍的补肾活血中药再加相当于成人剂量10倍的降糖灵混悬液。每日1次，连续6月。
1.3 实验用药
补肾活血复方制剂：选用干地黄、山茱萸、丹参、葛根等组方制成无糖颗粒制剂，由成都中医药大学制剂教研室和四川省人民医院制剂室共同制备。
, 百拇医药
导升明：由奥地利依比威大药厂生产。
1.4 实验方法
实验至第6个月后，每组随机取10只大鼠，以脊椎脱臼法处死，立即摘出双眼球迅速放入10%中性甲醛液中固定，同时将该固定液注入玻璃体腔内，24h后去除眼前节，放回固定液中再固定72h，石蜡包埋，连续切片，切片厚度4μm。采用甲苯胺蓝-伊红复染法进行Nissl小体的组化染色。
1.5 RGC胞体中Nissl小体灰度的测定
每张切片随机选5个视野，以RGC层为测量框，采用Mias—200型图形图像分析仪(四川大学图形图像研究所)对Nissl小体的灰度进行测量，求取均值代表该切片的测量值。所测数据使用Spss软件作单因素方差分析。
2 结果
, 百拇医药
2.1 正常大鼠与DM大鼠RGC的Nissl染色对比观察
正常大鼠RGC胞体中含有较多的呈紫蓝色、颗粒状及小块状的Nissl小体(见图1)。阴性对照组DM大鼠RGC胞体中的Nissl小体数量明显减少，呈不同程度的溶解状(见图2)。
图1 正常组 视网膜神经节细胞胞体中含有丰富的Nissl小体(N.N) Nissl染色 ×200
图2 阴性对照组(病理组) 视网膜神经节细胞胞体中的Nissl小体(N.N)明显减少，呈不同程度的溶解状 Nissl染色 ×200
2.2 补肾活血复方制剂对DM大鼠RGC胞体中Nissl小体的影响
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采用计算机自动图形图像分析系统对各实验组大鼠RGC胞体中Nissl小体进行定量测定，并对所测数据进行单因素方差分析(见表1)。
表1 各组大鼠RGC胞体中Nissl小体的检测结果
(
±s)n=10 组 别
Nissl小体
t1值
P1值
t2值
P2值
正常对照组
, 百拇医药
115.80±9.40
5.189
<0.001
—
—
阴性对照组
98.53±6.94
—
—
5.189
<0.001
阳性对照Ⅰ组
105.10±4.40
, 百拇医药
2.178
<0.05
2.469
<0.05
阳性对照Ⅱ组
108.18±5.84
3.109
<0.01
2.113
>0.05
中药低剂量组
108.85±6.81
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3.325
<0.01
1.404
>0.05
中药中剂量组
110.84±11.42
3.967
<0.01
1.678
>0.05
中药高剂量组
112.75±6.97
, 百拇医药
3.623
<0.01
0.704
>0.05
注：t1为各组分别与阴性对照组相比；t2为各组分别与正常对照组相比
从表1可见，与阴性对照组相比，阳性对照Ⅰ、Ⅱ组以及中药各治疗组DM大鼠RGC胞体中的Nissl小体灰度均明显高于阴性对照组，其差异均有显著意义；与正常对照组相比，仅阴性对照组以及阳性对照Ⅰ组的Nissl小体灰度明显低于正常对照组，其差异有显著意义。其余各组间比较，差异均无显著意义。说明阴性对照组DM大鼠在病程6个月时，其RGC的Nissl小体明显减少。阳性对照Ⅰ组DM大鼠RGC的Nissl小体减少的程度虽然较阴性对照组轻(P<0.05)，但与正常对照组相比仍然明显减少(P<0.05)；各中药治疗组和阳性对照Ⅱ组DM大鼠RGC的Nissl小体量不仅高于阴性对照组(P<0.05～0.001)，而且与正常对照组比较差异无显著意义(P>0.05)。
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2.3 实验各组大鼠的血糖变化情况
病程0月、6月各组实验动物血糖水平如表2所示。从表2可见，阴性对照组DM大鼠病程0月与6月时血糖相比，差异无显著意义，中药各治疗组以及阳性对照Ⅰ组、Ⅱ组DM大鼠的血糖浓度在治疗后均明显下降，与治疗前相比，差异均有显著意义。说明链脲佐菌素性DM大鼠经过6个月的时间，其高血糖状态仍未能自然改善。
表2 各组大鼠血糖浓度0月与6月时比较
(±s)n=16 组 别
血糖(mmol/L)
t值或
t′值
, 百拇医药
P值
0月
6月
正常对照组
4.70±2.01
4.81±1.97
0.217
>0.05
阴性对照组
26.80±7.00
23.64±6.71
1.014
, 百拇医药 >0.05
阳性对照Ⅰ组
27.60±7.88
12.95±5.84
8.231
<0.01
阳性对照Ⅱ组
27.16±7.14
10.89±4.94
9.274
<0.01
中药低剂量组
, 百拇医药
26.97±6.94
10.13±4.74
9.068
<0.001
中药中剂量组
25.93±6.01
9.14±3.71
10.231
<0.001
中药高剂量组
26.84±7.01
7.63±2.89
, 百拇医药
11.473
<0.001
3 讨论
糖尿病眼部并发症是一种重要的致盲原因，探讨其发病机理和寻求有效的治疗方法，是国内外眼科界研究的热点之一。我们过去的研究工作已显示，DM大鼠视神经纤维呈不同程度的退行性改变，补肾活血药物能减轻此种改变〔1，2〕。而RGC是视网膜的输出神经元，其轴突即为视神经纤维。因此，我们采用Nissl染色法、并结合计算机图像分析系统对各实验组RGC胞体中的Nissl小体进行定量分析，以进一步研DM性视路损害和补肾活血复方制剂对其防治作用。
Nissl染色法是德国病理组织学家Franz Nissl所创立，它为中枢神经的研究开辟了细胞构筑学的途径，被广泛用于中枢神经病理组织学的研究。Nissl小体是神经元的特征性结构，对缺血缺氧等损害因素十分敏感，实际上它是由许多平行排列的粗面内质网以及游离其间的核蛋白和多核蛋白体组成〔3〕。而RGC的粗面内质网颇为明显，同时它也是将氨基酸合成蛋白质的最为活跃的视网膜细胞〔4〕。我们的实验结果提示，在高血糖状态持续6个月后，DM大鼠RGC的Nissl小体明显减少或呈不同程度的溶解，说明DM大鼠的视网膜组织不仅存在微血管的病理损害〔5〕，而且其RGC也存在退行性改变，这一结果也支持了我们前期的研究工作〔2〕。本实验结果还显示，补肾活血复方制剂能减轻或阻止DM大鼠RGC Nissl小体的溶解或减少，从而说明补肾活血复方制剂具有保护DM大鼠RGC的作用，同时亦预示补肾活血法是防治DM性视路损害的一种有效治法，其确切机理有待进一步研究。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助课题(39600190)
参考文献
1，谢学军，李瑞荃，廖品正，等.滋养肝肾、活血化瘀中药对实验性糖尿病大鼠视神经组织形态的影响[J].中国中医眼科杂志，1996，6(3)：131.
2，谢学军，李瑞荃，廖品正，等.糖尿病大鼠视神经病理学研究——光镜与电镜观察[J].眼科研究，1997，15(3)：23.
3，汪 谦，主编.现代医学实验方法[M].北京：人民卫生出版社，1997.115-116.
4，管怀进，龚启荣，主编.现代基础眼科学[M].北京：人民军医出版社，1998.232—233.
5，李瑞荃，谢学军，廖品正，等.滋养肝肾、活血化瘀药对实验性糖尿病大鼠视网膜超微结构的影响[J].中国中医眼科杂志，1996，6(2)：67.
收稿日期：2000-05-10, http://www.100md.com
单位：谢学军 李翔(成都中医药大学眼科，成都 610075)；肖丹(成都中医药大学制剂教研室)；王毅(成都中医药大学附属医院病理科)；杨红(四川省人民医院病理科)；谢春光(成都中医药大学内科)
关键词：糖尿病；视网膜神经节细胞；Nissl小体；补肾活血
中国中医眼科杂志000403 [摘 要]目的 探讨补肾活血中药对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞的影响。方法 以链脲佐菌素造成大鼠糖尿病模型。利用微机图像分析技术对视网膜神经细胞胞体中Nissl小体进行定量测定和分析。结果 中药治疗组的糖尿病大鼠视网膜神经节细胞胞体中Nissl小体减少程度明显低于阴性对照组和阳性对照Ⅰ组。结论 补肾活血中药有减轻实验性糖尿病大鼠视网膜神经节细胞病理损害的作用。
中图分类号：R289.5；R774.1 文献标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1002-4379(2000)04-0195-04
An observation of influence of traditional Chinese medicine for bushenhuoxue(补肾活血)therapy on retinal ganglion cells in experimental diabetic rats
XIE Xuejun,LI Xiang,XIAO Dan,et al.
(Department of Ophthalmology,Chengdu Traditional Chinese Medicine University,Chengdu 610075,China)
[Abstract]OBJECTIVE To investigate the effect of traditional Chinese medicine for bushenhuoxue(补肾活血) therapy on the pathological damages of the diabetic rats retinal ganglion cells.METHODS The animal model of diabetes was introduced by streptozotocin.The Nissl bodies in the retinal ganglion cells were measured and analyzed quantitatively using computer image analysis system.RESULTS The lost degrees of the Nissl bodies in the diabetic rats retinal ganglion cells in the treated groups were significantly lower than those in both negative and positive control groups.CONCLUSION Traditional Chinese medicine for bushenhuoxue could alleviate the pathological damages of retinal ganglion cells in experimental diabetic rats.
, 百拇医药
[Key words]diabetes mellitus(DM);retinal ganglion cells(RGC);Nissl bodies;bushenhuoxue(补肾活血)
1999年5月～9月我们通过计算机图像分析系统对糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGC)的Nissl小体进行测量和分析，旨在观察补肾活血中药对DM大鼠RGC的保护作用。
1 材料和方法
1.1 实验动物
选用SD大鼠，体重125～150g，雌雄各半。喂养训化两周后，将链脲佐菌素(美国Sigma公司产)溶于0.1mol/L、pH4.6的柠檬酸钠缓冲液中，浓度为1%，随配随用，按50mg/kg体重的剂量行大鼠左下腹皮下注射。造模48h后，于禁食12h后取尾静脉血测定血糖，将血糖浓度大于11.1mmol/L者纳入DM大鼠，并开始计算病程，病程6个月时处死实验动物，同时再测定血糖浓度。
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1.2 动物分组与给药
将DM大鼠按血糖浓度及性别不同，随机分为阴性对照组，阳性对照Ⅰ组，阳性对照Ⅱ组，中药高、中、低剂量组，未造模型的正常同龄鼠为正常对照组。每组动物20只。各实验组灌胃药物均用0.5%羧甲基纤维素溶解为混悬液。
正常对照组：自由摄食饮水，不加任何处理。阴性对照组：每只大鼠灌胃与中药组等容的0.5%羧甲基纤维素溶液。阳性对照Ⅰ组：每只大鼠灌胃相当于成人剂量10倍的降糖灵混悬液每日16.67mg/kg。阳性对照Ⅱ组：每只大鼠灌胃相当于成人剂量10倍的降糖灵和导升明混悬液。中药高、中、低剂量组分别给予相当于临床用药量15倍、10倍及5倍的补肾活血中药再加相当于成人剂量10倍的降糖灵混悬液。每日1次，连续6月。
1.3 实验用药
补肾活血复方制剂：选用干地黄、山茱萸、丹参、葛根等组方制成无糖颗粒制剂，由成都中医药大学制剂教研室和四川省人民医院制剂室共同制备。
, 百拇医药
导升明：由奥地利依比威大药厂生产。
1.4 实验方法
实验至第6个月后，每组随机取10只大鼠，以脊椎脱臼法处死，立即摘出双眼球迅速放入10%中性甲醛液中固定，同时将该固定液注入玻璃体腔内，24h后去除眼前节，放回固定液中再固定72h，石蜡包埋，连续切片，切片厚度4μm。采用甲苯胺蓝-伊红复染法进行Nissl小体的组化染色。
1.5 RGC胞体中Nissl小体灰度的测定
每张切片随机选5个视野，以RGC层为测量框，采用Mias—200型图形图像分析仪(四川大学图形图像研究所)对Nissl小体的灰度进行测量，求取均值代表该切片的测量值。所测数据使用Spss软件作单因素方差分析。
2 结果
, 百拇医药
2.1 正常大鼠与DM大鼠RGC的Nissl染色对比观察
正常大鼠RGC胞体中含有较多的呈紫蓝色、颗粒状及小块状的Nissl小体(见图1)。阴性对照组DM大鼠RGC胞体中的Nissl小体数量明显减少，呈不同程度的溶解状(见图2)。
图1 正常组 视网膜神经节细胞胞体中含有丰富的Nissl小体(N.N) Nissl染色 ×200
图2 阴性对照组(病理组) 视网膜神经节细胞胞体中的Nissl小体(N.N)明显减少，呈不同程度的溶解状 Nissl染色 ×200
2.2 补肾活血复方制剂对DM大鼠RGC胞体中Nissl小体的影响
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采用计算机自动图形图像分析系统对各实验组大鼠RGC胞体中Nissl小体进行定量测定，并对所测数据进行单因素方差分析(见表1)。
表1 各组大鼠RGC胞体中Nissl小体的检测结果
(
±s)n=10 组 别Nissl小体
t1值
P1值
t2值
P2值
正常对照组
, 百拇医药
115.80±9.40
5.189
<0.001
—
—
阴性对照组
98.53±6.94
—
—
5.189
<0.001
阳性对照Ⅰ组
105.10±4.40
, 百拇医药
2.178
<0.05
2.469
<0.05
阳性对照Ⅱ组
108.18±5.84
3.109
<0.01
2.113
>0.05
中药低剂量组
108.85±6.81
, http://www.100md.com
3.325
<0.01
1.404
>0.05
中药中剂量组
110.84±11.42
3.967
<0.01
1.678
>0.05
中药高剂量组
112.75±6.97
, 百拇医药
3.623
<0.01
0.704
>0.05
注：t1为各组分别与阴性对照组相比；t2为各组分别与正常对照组相比
从表1可见，与阴性对照组相比，阳性对照Ⅰ、Ⅱ组以及中药各治疗组DM大鼠RGC胞体中的Nissl小体灰度均明显高于阴性对照组，其差异均有显著意义；与正常对照组相比，仅阴性对照组以及阳性对照Ⅰ组的Nissl小体灰度明显低于正常对照组，其差异有显著意义。其余各组间比较，差异均无显著意义。说明阴性对照组DM大鼠在病程6个月时，其RGC的Nissl小体明显减少。阳性对照Ⅰ组DM大鼠RGC的Nissl小体减少的程度虽然较阴性对照组轻(P<0.05)，但与正常对照组相比仍然明显减少(P<0.05)；各中药治疗组和阳性对照Ⅱ组DM大鼠RGC的Nissl小体量不仅高于阴性对照组(P<0.05～0.001)，而且与正常对照组比较差异无显著意义(P>0.05)。
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2.3 实验各组大鼠的血糖变化情况
病程0月、6月各组实验动物血糖水平如表2所示。从表2可见，阴性对照组DM大鼠病程0月与6月时血糖相比，差异无显著意义，中药各治疗组以及阳性对照Ⅰ组、Ⅱ组DM大鼠的血糖浓度在治疗后均明显下降，与治疗前相比，差异均有显著意义。说明链脲佐菌素性DM大鼠经过6个月的时间，其高血糖状态仍未能自然改善。
表2 各组大鼠血糖浓度0月与6月时比较
(
±s)n=16 组 别血糖(mmol/L)
t值或
t′值
, 百拇医药
P值
0月
6月
正常对照组
4.70±2.01
4.81±1.97
0.217
>0.05
阴性对照组
26.80±7.00
23.64±6.71
1.014
, 百拇医药 >0.05
阳性对照Ⅰ组
27.60±7.88
12.95±5.84
8.231
<0.01
阳性对照Ⅱ组
27.16±7.14
10.89±4.94
9.274
<0.01
中药低剂量组
, 百拇医药
26.97±6.94
10.13±4.74
9.068
<0.001
中药中剂量组
25.93±6.01
9.14±3.71
10.231
<0.001
中药高剂量组
26.84±7.01
7.63±2.89
, 百拇医药
11.473
<0.001
3 讨论
糖尿病眼部并发症是一种重要的致盲原因，探讨其发病机理和寻求有效的治疗方法，是国内外眼科界研究的热点之一。我们过去的研究工作已显示，DM大鼠视神经纤维呈不同程度的退行性改变，补肾活血药物能减轻此种改变〔1，2〕。而RGC是视网膜的输出神经元，其轴突即为视神经纤维。因此，我们采用Nissl染色法、并结合计算机图像分析系统对各实验组RGC胞体中的Nissl小体进行定量分析，以进一步研DM性视路损害和补肾活血复方制剂对其防治作用。
Nissl染色法是德国病理组织学家Franz Nissl所创立，它为中枢神经的研究开辟了细胞构筑学的途径，被广泛用于中枢神经病理组织学的研究。Nissl小体是神经元的特征性结构，对缺血缺氧等损害因素十分敏感，实际上它是由许多平行排列的粗面内质网以及游离其间的核蛋白和多核蛋白体组成〔3〕。而RGC的粗面内质网颇为明显，同时它也是将氨基酸合成蛋白质的最为活跃的视网膜细胞〔4〕。我们的实验结果提示，在高血糖状态持续6个月后，DM大鼠RGC的Nissl小体明显减少或呈不同程度的溶解，说明DM大鼠的视网膜组织不仅存在微血管的病理损害〔5〕，而且其RGC也存在退行性改变，这一结果也支持了我们前期的研究工作〔2〕。本实验结果还显示，补肾活血复方制剂能减轻或阻止DM大鼠RGC Nissl小体的溶解或减少，从而说明补肾活血复方制剂具有保护DM大鼠RGC的作用，同时亦预示补肾活血法是防治DM性视路损害的一种有效治法，其确切机理有待进一步研究。
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基金项目：国家自然科学基金资助课题(39600190)
参考文献
1，谢学军，李瑞荃，廖品正，等.滋养肝肾、活血化瘀中药对实验性糖尿病大鼠视神经组织形态的影响[J].中国中医眼科杂志，1996，6(3)：131.
2，谢学军，李瑞荃，廖品正，等.糖尿病大鼠视神经病理学研究——光镜与电镜观察[J].眼科研究，1997，15(3)：23.
3，汪 谦，主编.现代医学实验方法[M].北京：人民卫生出版社，1997.115-116.
4，管怀进，龚启荣，主编.现代基础眼科学[M].北京：人民军医出版社，1998.232—233.
5，李瑞荃，谢学军，廖品正，等.滋养肝肾、活血化瘀药对实验性糖尿病大鼠视网膜超微结构的影响[J].中国中医眼科杂志，1996，6(2)：67.
收稿日期：2000-05-10, http://www.100md.com