3种硬组织替代材料骨细胞相容性研究
作者：唐昭 陈治清
单位：唐 昭 510632 广州暨南大学医学院口腔系,；陈治清 华西医科大学口腔医学院
关键词：硬组织替代材料；成骨细胞；生物相容性
华西口腔医学杂志990301 摘要 目的:研究羟基磷灰石(HA)、生物玻璃陶瓷(BGC)和钛合金(Ti-6Al-4V)3种骨替代材料的细胞相容性,探讨体外评价骨替代材料细胞相容性的简捷快速的实验方法。方法:选用SD乳鼠颅顶骨成骨细胞,采用体外细胞培养方法,将细胞接种于HA、BGC和Ti-6Al-4V 3种材料表面后,分别观察1、3、5、7 d时细胞形态及生长增殖率,评价3种材料的骨细胞相容性。结果:在3种材料的表面,成骨细胞以锚状结构牢固地粘附,并具有良好的细胞形态和增殖率。其中以HA和BGC的骨细胞相容性较好,Ti-6Al-4V相对较差。结论:体外成骨细胞培养法从细胞形态及生长增殖率方面能客观反映3种硬组织替代材料和细胞之间的相互作用,可作为体外研究骨替代材料细胞相容性的简捷快速的实验方法。
, 百拇医药
Cytocompatibility of Three Substituted Materials of Human Beings' Hard Tissue
Tang Zhao
Depantment of Stomatology, Medical College of Jinan University
Chen Zhiqing
College of Stomatology, West China University of Medical Sciences
Abstract Objective: To evaluate the osteocompatibility of three substituted materials of human beings' hard tissue (hydroxyapatite, bioglass ceramic and Ti-6Al-4V) and a new experimental method for evaluating the osteocompatibility of replaced materials of hard tissues in vitro. Methods: The isolated osteoblasts from parietal and frontal bones of Sparague Dawley rats from 1 day to 3 days were used to estimate osteocompatibility of three substituted materials in vitro. The cells were inoculated onto specimens of HA, BGC and Ti-6Al-4V for 1 day, 3, 5 and 7 days, then the morphology and proliferating rates of cells on different materials were tested. Results: Rat osteoblasts could attach, spread and proliferate on three materials as normal cells, and proliferating rates of cells on HA and BGC surface were as the same as normal, but that on Ti-6Al-4V was lower than the normal cells. Conclusion: The osteocompatibility of HA and BGC are better than that of Ti-6Al-4V and rat osteoblast culture system can be used to evaluate the osteocompatibility of substituted materials in vitro.
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Key words: biomaterial osteoblast biocompatibility
成骨细胞作为骨组织的主要功能细胞,承担着骨的修复和改建功能。因而成骨细胞接种在生物材料,尤其是硬组织替代材料表面的形态及功能变化,可客观反映该替代材料的细胞相容性,较之其它细胞如成纤维细胞更灵敏可靠[1]。体外成骨细胞培养法可从细胞水平、分子水平探讨材料和骨细胞之间的相互作用关系,为综合评价材料的骨细胞相容性提供了有价值的实验模型。由于成骨细胞株在传代中细胞某些生物学特性会迅速减弱,原代分离培养的细胞其生物学特性虽未发生很大变化,但分离培养较为困难,因而迄今为止,国内有关这方面的报道不多。本实验选用体外分离培养的SD乳鼠颅顶骨成骨细胞,将其接种于羟基磷灰石(HA)、生物玻璃陶瓷(BGC)、钛合金(Ti-6Al-4V)材料的表面,观察细胞在材料表面生长及增殖情况,从细胞学的角度综合评价3种材料的骨细胞相容性,为临床使用提供实验依据,同时建立一种简便易行、灵敏可靠的实验方法。
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1 材料和方法
1.1 材料
HA(华西医科大学口腔医学院口腔材料室提供),BGC(华西医科大学口腔生物医学重点实验室提供),Ti-6Al-4V(宝鸡有色金属研究所提供)。
1.1.1 圆片型材料制备 HA、BGC材料制备成直径7 mm、厚1 mm的圆片状,Ti-6Al-4V则用金刚砂磨制成直径5 mm、厚1 mm的圆片型。上述材料均用75%乙醇超声震荡清洗后,再换用双蒸水超声震荡清洗数遍,烘干,高压灭菌后备用。
1.1.2 材料浸提液的制备 粒度为200目以下的HA、BGC经高温烧结处理,钛粉经多次清洗后烘干。高温灭菌后加入199培养液(日本株式会社提供,含20%小牛血清、青霉素、链霉素、Vit C等)配制成20 mg/ml于37℃静置浸提120 h,4℃保存备用。
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1.1.3 细胞 选用来源于SD乳鼠的颅顶骨成骨细胞第3代用于实验,同一只乳鼠下颌牙龈成纤维细胞第3代做对照实验[2]。
1.2 方法
1.2.1 附着于材料表面的细胞形态学观察 在4只25 ml培养瓶中分别放入HA、BGC、Ti-6Al-4V圆片型材料各4片,将细胞浓度为3×105/ml的鼠成骨细胞分别接种于材料的表面,静置片刻,缓慢从材料边缘加入199培养液,密闭后置于37℃恒温箱中密闭培养。逐日在Nikon倒置相差显微镜(日本)下观察,分别于1、3、5、7 d摄像记录。同时将培养1 d和5 d的材料标本取出,3%戊二醛固定,梯度酒精逐级脱水,CO2干燥后表面喷金,AMRAY-1000 B扫描电镜(美国)25 kV条件下观察材料表面附着细胞形态。
1.2.2 材料浸提液影响细胞增殖的比色法观察 将成骨细胞、成纤维细胞分别接种于96孔培养板中,每一孔细胞量为2×104个。加入199培养液250 μl,于37℃恒温密闭培养24 h,在Nikon倒置相差显微镜下观察细胞已贴壁成活后,分别于每孔中加入材料浸提液100 μl,199培养液150 μl,空白对照组加培养液250 μl。每种材料重复5孔,37℃恒温密闭培养,分别于1、3、5、7 d取样。PBS缓冲液反复清洗,0.05%结晶紫染色20 min,弃去染料,PBS反复清洗后烘干,抽提液(含0.1 mol/L柠檬酸钠6.1 ml、0.1 mol/L HCl 3.9 ml、95%乙醇15 ml)抽提,EL312e酶标仪(美国)比色,波长490 nm,参考波长630 nm,测定每孔光吸收值(OD),取其均值,绘制增殖曲线。
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2 结果
2.1 材料表面细胞形态学观察
光镜下显示,接种24 h后,材料边缘细胞附着较少,培养瓶上有散在的单个或多个细胞群,随着培养时间的延长,材料边缘细胞密度逐渐增多,培养瓶上细胞聚集成团。附着细胞呈三角形或短梭形,未见细胞变性或死亡(图1,2)。
图 1 BGC与成骨细胞共同培养Id 材料边缘细胞附着较少，未见细胞变性或死亡 ×100
图 2 BGC与成骨细胞共同培养3d 材料边缘细胞附着增多，瓶壁细胞密度增大 ×100
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SEM观察表明,接种24 h后,成骨细胞以多个细长突起伸入各材料颗粒间,形成一种锚状结构,牢固地粘附于材料表面,并具有良好的伸展状态(图3)。随着培养时间的延长,材料表面细胞密度增加,在材料表面附着细胞分裂增殖,并分泌大量的细胞外基质包裹材料颗粒(图4)。各种材料表面细胞附着形态未见明显的差异。
图 3 HA与成骨细胞共同培养1d 细胞在材料表面伸展，并以细长突起伸入颗粒间，形成锚状结构 ×5000
图 4 HA成骨细胞共同培养5d 细胞分泌外基质包裹材料颗粒 ×3000
2.2 材料浸提液对细胞增殖的影响
对同一种材料,成骨细胞和成纤维细胞的生长曲线之间有显著性差异(P<0.05),成纤维细胞的生长速度快于成骨细胞;HA、BGC两种材料与对照组相比无显著性差异(P>0.05),成骨细胞能正常地分裂增殖,保持着良好的增殖速度;而钛合金组成骨细胞生长受影响(P<0.05),增殖速度减慢,同组的成纤维细胞生长不受材料的影响(图5,6)。
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图5 成骨细胞增殖曲线
- 对照组 *HA □BGC *Ti-6Al-4V(下同)
图6 成纤维细胞增殖曲线
3 讨论
对生物医学材料进行细胞相容性研究是检测材料生物相容性的一项基本内容。体外细胞培养法以其简捷、快速、灵敏、重复性好等优点,目前已被国内外学者用于对材料细胞相容性、界面结合机制研究以及新材料的筛选等[3]。
材料的细胞相容性有别于细胞毒性。选用非植入部位的细胞如成纤维细胞、肿瘤上皮细胞等能反映出细胞对材料可能存在的毒性物质的反应,充分体现材料的毒性;而材料的细胞相容性反映的是材料与细胞之间的双向反应,即材料对细胞的影响,细胞对材料的影响,因而选用植入部位的主要功能细胞——成骨细胞,不仅能反映材料的细胞毒性,而且有助于考察材料与细胞之间的相互作用,从更深层次探讨材料-细胞界面结合机制,其结果与体内实验更为吻合。但由于体外成骨细胞分离培养较为困难,细胞株又存在着传代过程中细胞某些生物学特性迅速下降的弱点,使结果存在一定的局限性。本实验在成功地建立了SD乳鼠体外原代分离培养成骨细胞实验模型的基础上,选用第三代细胞用于实验,结果表明在HA、BGC表面,细胞能正常粘附、伸展、增殖,分泌细胞外基质包裹颗粒,与骨组织能形成早期的骨性结合,具有良好的骨细胞相容性。HA和BGC的主要成分与骨组织相似,其中HA在生理环境中化学性能稳定,能参与体内的钙磷代谢,吸附聚集钙离子,提供新骨形成的物质基础,是目前较为理想的人体硬组织替代材料。本实验的结果与国内外学者[4,5]报道一致,再次证实了HA、BGC良好的骨细胞相容性。
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本实验还表明,3种材料中金属材料钛合金的骨细胞相容性相对较差。目前对钛合金的评价并不统一。一般认为在体内环境中,钛及其合金表面的金属离子的缓慢释放,导致周围环境pH下降,细胞生活环境偏酸,不利于成骨细胞的生长,影响新骨的形成[6]。因而对钛合金的生物学特性还需进一步探讨。成纤维细胞对材料释放的金属离子耐受性较成骨细胞强,因而成纤维细胞的生长未受影响。这也表明,成骨细胞评价硬组织替代材料细胞性较成纤维细胞更为灵敏准确。
参考文献
1 Itakura Y, Kosugi A, Sudo H, et al. Development of a new system for evaluating biocompatibility of implant materials using an osteogenic cell line (Mc3T3-E1). J Biome Mat Res, 1988, 22:613～622
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2 唐 昭,陈治清.大鼠成骨细胞体外培养的研究.华西口腔医学杂志,1997,15(1):70～72
3 Knabec, Gildenhaar R, Berger G, et al. Morphological evaluation of osteoblasts cultured on different calcium phosphate ceramics. Biomaterials, 1997, 18(20):1339～1347
4 方 玉,王建平,母瑞虹.氟磷灰石和含碳酸磷灰石对细胞增殖和细胞周期的影响.北京口腔医学,1993,1(1):36～38
5 Bagambisa FB, Kappert HF, Schilli W. Interfacial reaction of osteoblasts to dental and implant materials. J Oral Maxi-llofac Surg, 1994, 52:52～56
6 Ducheyne P, Willems G, Martens M, et al. In vivo metal ion release from porous titanium-fiber materials. J Biomed Mater Res, 1984, 18:293～308
(1998-10-23收稿,1999-05-25修回), 百拇医药
单位：唐 昭 510632 广州暨南大学医学院口腔系,；陈治清 华西医科大学口腔医学院
关键词：硬组织替代材料；成骨细胞；生物相容性
华西口腔医学杂志990301 摘要 目的:研究羟基磷灰石(HA)、生物玻璃陶瓷(BGC)和钛合金(Ti-6Al-4V)3种骨替代材料的细胞相容性,探讨体外评价骨替代材料细胞相容性的简捷快速的实验方法。方法:选用SD乳鼠颅顶骨成骨细胞,采用体外细胞培养方法,将细胞接种于HA、BGC和Ti-6Al-4V 3种材料表面后,分别观察1、3、5、7 d时细胞形态及生长增殖率,评价3种材料的骨细胞相容性。结果:在3种材料的表面,成骨细胞以锚状结构牢固地粘附,并具有良好的细胞形态和增殖率。其中以HA和BGC的骨细胞相容性较好,Ti-6Al-4V相对较差。结论:体外成骨细胞培养法从细胞形态及生长增殖率方面能客观反映3种硬组织替代材料和细胞之间的相互作用,可作为体外研究骨替代材料细胞相容性的简捷快速的实验方法。
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Cytocompatibility of Three Substituted Materials of Human Beings' Hard Tissue
Tang Zhao
Depantment of Stomatology, Medical College of Jinan University
Chen Zhiqing
College of Stomatology, West China University of Medical Sciences
Abstract Objective: To evaluate the osteocompatibility of three substituted materials of human beings' hard tissue (hydroxyapatite, bioglass ceramic and Ti-6Al-4V) and a new experimental method for evaluating the osteocompatibility of replaced materials of hard tissues in vitro. Methods: The isolated osteoblasts from parietal and frontal bones of Sparague Dawley rats from 1 day to 3 days were used to estimate osteocompatibility of three substituted materials in vitro. The cells were inoculated onto specimens of HA, BGC and Ti-6Al-4V for 1 day, 3, 5 and 7 days, then the morphology and proliferating rates of cells on different materials were tested. Results: Rat osteoblasts could attach, spread and proliferate on three materials as normal cells, and proliferating rates of cells on HA and BGC surface were as the same as normal, but that on Ti-6Al-4V was lower than the normal cells. Conclusion: The osteocompatibility of HA and BGC are better than that of Ti-6Al-4V and rat osteoblast culture system can be used to evaluate the osteocompatibility of substituted materials in vitro.
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Key words: biomaterial osteoblast biocompatibility
成骨细胞作为骨组织的主要功能细胞,承担着骨的修复和改建功能。因而成骨细胞接种在生物材料,尤其是硬组织替代材料表面的形态及功能变化,可客观反映该替代材料的细胞相容性,较之其它细胞如成纤维细胞更灵敏可靠[1]。体外成骨细胞培养法可从细胞水平、分子水平探讨材料和骨细胞之间的相互作用关系,为综合评价材料的骨细胞相容性提供了有价值的实验模型。由于成骨细胞株在传代中细胞某些生物学特性会迅速减弱,原代分离培养的细胞其生物学特性虽未发生很大变化,但分离培养较为困难,因而迄今为止,国内有关这方面的报道不多。本实验选用体外分离培养的SD乳鼠颅顶骨成骨细胞,将其接种于羟基磷灰石(HA)、生物玻璃陶瓷(BGC)、钛合金(Ti-6Al-4V)材料的表面,观察细胞在材料表面生长及增殖情况,从细胞学的角度综合评价3种材料的骨细胞相容性,为临床使用提供实验依据,同时建立一种简便易行、灵敏可靠的实验方法。
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1 材料和方法
1.1 材料
HA(华西医科大学口腔医学院口腔材料室提供),BGC(华西医科大学口腔生物医学重点实验室提供),Ti-6Al-4V(宝鸡有色金属研究所提供)。
1.1.1 圆片型材料制备 HA、BGC材料制备成直径7 mm、厚1 mm的圆片状,Ti-6Al-4V则用金刚砂磨制成直径5 mm、厚1 mm的圆片型。上述材料均用75%乙醇超声震荡清洗后,再换用双蒸水超声震荡清洗数遍,烘干,高压灭菌后备用。
1.1.2 材料浸提液的制备 粒度为200目以下的HA、BGC经高温烧结处理,钛粉经多次清洗后烘干。高温灭菌后加入199培养液(日本株式会社提供,含20%小牛血清、青霉素、链霉素、Vit C等)配制成20 mg/ml于37℃静置浸提120 h,4℃保存备用。
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1.1.3 细胞 选用来源于SD乳鼠的颅顶骨成骨细胞第3代用于实验,同一只乳鼠下颌牙龈成纤维细胞第3代做对照实验[2]。
1.2 方法
1.2.1 附着于材料表面的细胞形态学观察 在4只25 ml培养瓶中分别放入HA、BGC、Ti-6Al-4V圆片型材料各4片,将细胞浓度为3×105/ml的鼠成骨细胞分别接种于材料的表面,静置片刻,缓慢从材料边缘加入199培养液,密闭后置于37℃恒温箱中密闭培养。逐日在Nikon倒置相差显微镜(日本)下观察,分别于1、3、5、7 d摄像记录。同时将培养1 d和5 d的材料标本取出,3%戊二醛固定,梯度酒精逐级脱水,CO2干燥后表面喷金,AMRAY-1000 B扫描电镜(美国)25 kV条件下观察材料表面附着细胞形态。
1.2.2 材料浸提液影响细胞增殖的比色法观察 将成骨细胞、成纤维细胞分别接种于96孔培养板中,每一孔细胞量为2×104个。加入199培养液250 μl,于37℃恒温密闭培养24 h,在Nikon倒置相差显微镜下观察细胞已贴壁成活后,分别于每孔中加入材料浸提液100 μl,199培养液150 μl,空白对照组加培养液250 μl。每种材料重复5孔,37℃恒温密闭培养,分别于1、3、5、7 d取样。PBS缓冲液反复清洗,0.05%结晶紫染色20 min,弃去染料,PBS反复清洗后烘干,抽提液(含0.1 mol/L柠檬酸钠6.1 ml、0.1 mol/L HCl 3.9 ml、95%乙醇15 ml)抽提,EL312e酶标仪(美国)比色,波长490 nm,参考波长630 nm,测定每孔光吸收值(OD),取其均值,绘制增殖曲线。
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2 结果
2.1 材料表面细胞形态学观察
光镜下显示,接种24 h后,材料边缘细胞附着较少,培养瓶上有散在的单个或多个细胞群,随着培养时间的延长,材料边缘细胞密度逐渐增多,培养瓶上细胞聚集成团。附着细胞呈三角形或短梭形,未见细胞变性或死亡(图1,2)。
图 1 BGC与成骨细胞共同培养Id 材料边缘细胞附着较少，未见细胞变性或死亡 ×100
图 2 BGC与成骨细胞共同培养3d 材料边缘细胞附着增多，瓶壁细胞密度增大 ×100
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SEM观察表明,接种24 h后,成骨细胞以多个细长突起伸入各材料颗粒间,形成一种锚状结构,牢固地粘附于材料表面,并具有良好的伸展状态(图3)。随着培养时间的延长,材料表面细胞密度增加,在材料表面附着细胞分裂增殖,并分泌大量的细胞外基质包裹材料颗粒(图4)。各种材料表面细胞附着形态未见明显的差异。
图 3 HA与成骨细胞共同培养1d 细胞在材料表面伸展，并以细长突起伸入颗粒间，形成锚状结构 ×5000
图 4 HA成骨细胞共同培养5d 细胞分泌外基质包裹材料颗粒 ×3000
2.2 材料浸提液对细胞增殖的影响
对同一种材料,成骨细胞和成纤维细胞的生长曲线之间有显著性差异(P<0.05),成纤维细胞的生长速度快于成骨细胞;HA、BGC两种材料与对照组相比无显著性差异(P>0.05),成骨细胞能正常地分裂增殖,保持着良好的增殖速度;而钛合金组成骨细胞生长受影响(P<0.05),增殖速度减慢,同组的成纤维细胞生长不受材料的影响(图5,6)。
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图5 成骨细胞增殖曲线
- 对照组 *HA □BGC *Ti-6Al-4V(下同)
图6 成纤维细胞增殖曲线
3 讨论
对生物医学材料进行细胞相容性研究是检测材料生物相容性的一项基本内容。体外细胞培养法以其简捷、快速、灵敏、重复性好等优点,目前已被国内外学者用于对材料细胞相容性、界面结合机制研究以及新材料的筛选等[3]。
材料的细胞相容性有别于细胞毒性。选用非植入部位的细胞如成纤维细胞、肿瘤上皮细胞等能反映出细胞对材料可能存在的毒性物质的反应,充分体现材料的毒性;而材料的细胞相容性反映的是材料与细胞之间的双向反应,即材料对细胞的影响,细胞对材料的影响,因而选用植入部位的主要功能细胞——成骨细胞,不仅能反映材料的细胞毒性,而且有助于考察材料与细胞之间的相互作用,从更深层次探讨材料-细胞界面结合机制,其结果与体内实验更为吻合。但由于体外成骨细胞分离培养较为困难,细胞株又存在着传代过程中细胞某些生物学特性迅速下降的弱点,使结果存在一定的局限性。本实验在成功地建立了SD乳鼠体外原代分离培养成骨细胞实验模型的基础上,选用第三代细胞用于实验,结果表明在HA、BGC表面,细胞能正常粘附、伸展、增殖,分泌细胞外基质包裹颗粒,与骨组织能形成早期的骨性结合,具有良好的骨细胞相容性。HA和BGC的主要成分与骨组织相似,其中HA在生理环境中化学性能稳定,能参与体内的钙磷代谢,吸附聚集钙离子,提供新骨形成的物质基础,是目前较为理想的人体硬组织替代材料。本实验的结果与国内外学者[4,5]报道一致,再次证实了HA、BGC良好的骨细胞相容性。
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本实验还表明,3种材料中金属材料钛合金的骨细胞相容性相对较差。目前对钛合金的评价并不统一。一般认为在体内环境中,钛及其合金表面的金属离子的缓慢释放,导致周围环境pH下降,细胞生活环境偏酸,不利于成骨细胞的生长,影响新骨的形成[6]。因而对钛合金的生物学特性还需进一步探讨。成纤维细胞对材料释放的金属离子耐受性较成骨细胞强,因而成纤维细胞的生长未受影响。这也表明,成骨细胞评价硬组织替代材料细胞性较成纤维细胞更为灵敏准确。
参考文献
1 Itakura Y, Kosugi A, Sudo H, et al. Development of a new system for evaluating biocompatibility of implant materials using an osteogenic cell line (Mc3T3-E1). J Biome Mat Res, 1988, 22:613～622
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2 唐 昭,陈治清.大鼠成骨细胞体外培养的研究.华西口腔医学杂志,1997,15(1):70～72
3 Knabec, Gildenhaar R, Berger G, et al. Morphological evaluation of osteoblasts cultured on different calcium phosphate ceramics. Biomaterials, 1997, 18(20):1339～1347
4 方 玉,王建平,母瑞虹.氟磷灰石和含碳酸磷灰石对细胞增殖和细胞周期的影响.北京口腔医学,1993,1(1):36～38
5 Bagambisa FB, Kappert HF, Schilli W. Interfacial reaction of osteoblasts to dental and implant materials. J Oral Maxi-llofac Surg, 1994, 52:52～56
6 Ducheyne P, Willems G, Martens M, et al. In vivo metal ion release from porous titanium-fiber materials. J Biomed Mater Res, 1984, 18:293～308
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