茶油对梗阻性黄疸肝脏保护作用的实验研究
作者：周斌 彭淑牖 牟一平
单位：周斌(温州医学院附属第二医院 普外科，浙江 温州 325027)；彭淑牖(浙江大学附属第二医院 普外科，浙江 杭州 310000)；牟一平(浙江大学附属邵逸夫医院 普外科，浙江 杭州 310000)
关键词：梗阻性黄疸；茶油；形态定量学；肝；不饱和脂肪酸
温州医学院学报000306 [摘要]目的:探讨茶油对梗阻性黄疸大鼠的肝脏保护作用。 方法:将大鼠分为假性手术组、胆总管结扎组和胆总管结扎并喂饲茶油组。于术后2周分别检测血清总胆红素(TB)、直接胆红素(DB)、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)的水平以及肝脏组织中琥珀酸脱氢酶(SDH)的活性，并在光镜和电镜下观察肝脏组织的病理改变。结果:茶油能明显改善梗阻性黄疸大鼠营养状况；明显降低TB、DB、GPT和GOT的水平；增强肝细胞线粒体内SDH的活性；在一定程度上能保持肝细胞线粒体膜、内质网膜和核膜结构的完整性。结论:无论在形态上或功能上茶油对梗阻性黄疸大鼠的肝脏均有保护作用。
, 百拇医药
[中图分类号]R975+.5 [文献标识码]A
[文章编号]1000-2138(2000)03-0193-03
Experimental study on the protective effect of tea oil on the liver with obstructive jaundice
ZHOU Bin PENG Shu-you MOU Yi-ping
(Department of Surgery,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,Wenzhou 325027)
Abstract：Objective：To study the protective effect of tea oil which is rich in monounsaturated fatty acid on the liver in the common bile duct ligated rats.Methods：The rats were randomly classified into sham-operation group, bile duct ligated group and bile duct ligated group fed by tea oil. Two weeks after operation,the level of total billirubin(TB),direct billirubin(DB),glutamate pyruvate transaminase(GPT),glutamate oxaloacetale transaminase(GOT) in serum and the activity of succinic dehydrogenase(SDH) in liver were respectively detected. Also,the pathologic changes were observed by light and transmission electronic microscopy.Results：The treatment of tea oil significantly improved nutritional condition of obstructive jaundice in rats,significantly lower the level of TB,DB,GPT and GOT in serum,significantly increased the activity of SDH in mitochondria of hepatocytes and kept intact the membranous structure of mitochondria,nuclear and endoplasmic reticulum in hepatocytes.Conclusion：Tea oil has a significant protective effect on bile duct ligated rats by decreasing the hepatic damage in morphology and function.
, 百拇医药
Key words：obstructive jaundice; tea oil; morphometry; liver; unsaturated fatty acid
梗阻性黄疸是肝胆外科的常见病症，有较高的手术并发症和死亡率，其原因与肝脏、心脏和肾脏等脏器损害有密切关系。线粒体等细胞膜性结构受损，可能是脏器功能衰竭的病理学基础。本研究运用形态定量学方法对梗阻性黄疸时肝脏细胞膜性结构的损害进行定量研究，在此基础上探讨富含单不饱和脂肪酸的茶油对梗阻性黄疸大鼠的细胞膜性结构的保护作用。
1 材料和方法
1.1 实验动物及分组 取健康成年SD大鼠34只，雌雄不拘，体重170～250g，随机分为3组：①假性手术组(SO组)10只，戊巴比妥钠30mg/kg腹腔内注射麻醉，剖腹单纯游离胆总管后关腹，从术前1周至术后2周每日生理盐水2ml/kg灌胃；②胆总管结扎组(BDL组)9只，麻醉同SO组，剖腹游离胆总管，用丝线结扎后切断，复制梗阻性黄疸模型，从术前1周至术后2周每日生理盐水2ml/kg灌胃；③胆总管结扎并喂饲茶油组(TO组)15只，手术处理同BDL组，从术前1周至术后2周每日茶油2ml/kg灌胃。每组大鼠均自由摄食，实验动物及基础饲料由浙江医科大学实验动物中心提供，茶油由浙江泰顺县土产公司提供，茶油成分鉴定结果：单不饱和脂肪酸59.3%(其中含油酸56.2%)，多不饱和脂肪酸29.5%，饱和脂肪酸11.2%。
, 百拇医药
1.2 检测及观察指标
1.2.1 大鼠营养状况观察：每只大鼠于术前及处死时各测一次体重，取差值反映营养状况。
1.2.2 肝功能测定：三组大鼠均于术后2周处死取心血测血清总胆红素(TB)、直接胆红素(DB)、谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)。
1.2.3 形态学观察：大鼠处死后取肝脏作以下观察：①光镜标本以10%福尔马林溶液固定，石蜡切片，HE染色，光镜下观察；②电镜标本以锇酸-戊二醛双固定，醋酸铀染色，环氧树脂包埋，Epikite-812超薄切片机切片，Philips EM412型透射电镜下观察。
1.2.4 形态定量学测定
1.2.4.1 标本制作：大鼠处死后取新鲜肝脏组织，Leitz冰冻切片机于-20℃作恒冷箱切片，厚度为7μm。
, 百拇医药
1.2.4.2 琥珀酸脱氢酶(SDH)组织化学染色[1]：①步骤：将新鲜肝脏组织切片放入作用液中在恒温水浴25℃下作用30分钟，生理盐水洗后用10%福尔马林溶液固定10分钟，放入80%酒精中脱水5分钟，中性树胶封片。作为对照的新鲜肝脏组织切片先放入沸水中浸泡10分钟，再同上步骤处理。②结果判断：阳性反应产物呈细小的蓝紫色颗粒，见于线粒体，定位于胞质，二甲潜阳性反应与细胞内线粒体SDH活性成正相关。阴性对照不显色。
1.2.4.3 SDH活性检测：取SDH组织化学染色切片，在MIPS-I型多功能图像分析仪上，经 CCD摄像系统扫描显示于计算机屏幕上，于图中肝小叶中随机选取大小为13220点像素面积(0.06微米2/像素)，测定波长为550nm单色光下此面积光密度值(OD550)。OD值与该面积内SDH活性成正相关。每组测4张切片，每片测10～11块面积。
1.3 统计学处理 所有数据经SPSS/PC+统计软件包处理，采用t检验作差异显著性分析。
, 百拇医药
2 结果
2.1 大鼠营养状况 大鼠体重变化情况如表1所示。实验期内，3组大鼠体重均呈增长趋势，但SO组和TO组体重增长较BDL组更显著。
表1 实验期大鼠体重变化 组别
n
体重增加量(g)
SO
10
44.50±18.33
BDL
9
26.67±11.99*
, http://www.100md.com
TO
15
40.00±14.52△
与SO组比较：*P<0.05；与BDL组比较：△P<0.052.2 肝功能测定 大鼠肝功能测定结果如表2所示。BDL组与SO组比较，各项指标均明显升高。TO组与SO组比较，仅GOT明显升高。BDL组与TO组比较，TB、GPT和GOT均明显升高。
2.3 形态学观察 大鼠肝脏组织显微及超微结构
表2 大鼠肝功能测定结果 组别
n
TB(mg/dl)
DB(mg/dl)
, http://www.100md.com
GPT(U/L)
GOT(U/L)
SO
10
0.22±0.06
0.08±0.02
50.10±6.28
158.40±27.68
BDL
9
4.13±3.74*
3.48±3.54*
, 百拇医药
200.78±129.75*
1146.00±819.72*
TO
15
1.36±2.48△
0.93±2.02
93.47±86.78△
384.47±340.13*△
与SO组比较：*P<0.05；与BDL组比较：△P<0.05观察如表3所示。表3 大鼠肝脏组织显微和超微结构改变 组别
, http://www.100md.com
显微结构改变
超微结构改变
SO
无异常
无异常
BDL
肝细胞变性坏死，小叶结构紊乱，叶间胆管和结缔组织增生，严重淤胆，汇管区大量炎症细胞浸润
线粒体外膜破裂，嵴减少或消失，部分线粒体溶解，核明显皱缩变形，内质网肿胀和空泡样变
TO
肝细胞浊肿，小叶结构稍紊乱，尚完整，炎症细胞浸润、胆管增生和淤胆程度均较BDL组为轻
, 百拇医药
线粒体外膜尚完整，嵴存在，核膜完整，核无明显变形，内质网轻度肿胀，改变程度轻于BDL组
2.4 形态定量学测定 大鼠肝脏组织内的SDH活性测定结果如表4所示。BDL组和TO组与SO组比较，OD550值均明显降低；但TO组与BDL组比较，OD550值明显升高。表4 大鼠肝脏组织SDH组化染色OD测定值 (λ=550nm) 组别
n
OD550
SO
40
0.4598±0.0515
BDL
, http://www.100md.com
43
0.3464±0.0487*
TO
41
0.4127±0.0536*△
与SO组比较：*P<0.05；与BDL组比较：△P<0.053 讨论
本实验通过形态学观察证实，在胆道梗阻二周时，大鼠肝细胞内线粒体外膜部分破裂，嵴减少或消失，部分线粒体溶解，核明显皱缩变形，内质网肿胀和空泡样变，说明肝细胞在形态结构上受到严重损害；同时血清内TB、DB、GPT和GOT均明显上升，而SDH活性明显下降(P<0.05)，说明肝细胞功能明显受损。以上结果提示梗阻性黄疸时肝细胞功能损害有其形态学基础，功能和形态学改变相一致。
, 百拇医药
细胞膜流动性是指细胞中各种膜系统(包括细胞质膜、内质网膜、线粒体膜和核膜)具有类似于液体易流动的一种物理性质。生物膜的各种重要功能，如物质转运、信息传递和能量转换等都与膜的流动状态密切相关，因此生物膜合适的流动性是细胞完成正常生理功能的必备条件[2]。唐茂云等研究发现，给大鼠喂饲茶油后，红细胞膜、肝微粒体膜和心肌线粒体膜的荧光偏振度较对照组显著降低(即膜流动性增强)[3]。另有研究表明，茶油能明显降低血浆中过氧化物(LPO)代谢终产物丙二醛(MDA)浓度；明显升高全血过氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶的活性，从而降低LPO的生成[4]。
本实验发现，茶油能显著增加梗阻性黄疸大鼠体重，改善营养状况；明显降低血清TB、DB、GPT和GOT水平，改善肝功能；明显增强肝细胞线粒体SDH活性；在一定程度上保持梗阻性黄疸大鼠肝细胞线粒体、内质网和核膜结构的完整性。其机理可能是由于不饱和脂肪酸是生物膜磷脂的主要成分，外源性不饱和脂肪酸能迅速掺入膜磷脂，改变膜脂组成，改善膜流动性，修复已损伤的膜结构；或作为自由基攻击的标靶，外源性不饱和脂肪酸可减轻脂质过氧化反应对原细胞膜不饱和脂肪酸的损伤。因此茶油对梗阻性黄疸大鼠肝脏有保护作用。
, 百拇医药
作者简介：周斌(1972-)，男，浙江温州人，医学硕士，住院医师。
参考文献
[1] 贲长恩,李叔庚主编.实用酶组织化学[M].长沙：湖南科学技术出版社,1996.201-206.
[2] 林克椿,聂松青.细胞膜的流动性[J].生理科学进展,1985,16(1):83-89.
[3] 唐茂云,张文敏,胡曼玲，等.食用油对血脂、膜质过氧化、膜磷脂脂肪酸及血小板功能的影响[J].营养学报,1994,16(3):239-245.
[4] 陈梅芳，顾景范，孙明堂，等.茶油延缓动脉粥样硬化形成及其机理的探讨 [J].营养学报,1996,18(1):13-18.
收稿日期：1999-10-18
修回日期：2000-06-16, 百拇医药
单位：周斌(温州医学院附属第二医院 普外科，浙江 温州 325027)；彭淑牖(浙江大学附属第二医院 普外科，浙江 杭州 310000)；牟一平(浙江大学附属邵逸夫医院 普外科，浙江 杭州 310000)
关键词：梗阻性黄疸；茶油；形态定量学；肝；不饱和脂肪酸
温州医学院学报000306 [摘要]目的:探讨茶油对梗阻性黄疸大鼠的肝脏保护作用。 方法:将大鼠分为假性手术组、胆总管结扎组和胆总管结扎并喂饲茶油组。于术后2周分别检测血清总胆红素(TB)、直接胆红素(DB)、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)的水平以及肝脏组织中琥珀酸脱氢酶(SDH)的活性，并在光镜和电镜下观察肝脏组织的病理改变。结果:茶油能明显改善梗阻性黄疸大鼠营养状况；明显降低TB、DB、GPT和GOT的水平；增强肝细胞线粒体内SDH的活性；在一定程度上能保持肝细胞线粒体膜、内质网膜和核膜结构的完整性。结论:无论在形态上或功能上茶油对梗阻性黄疸大鼠的肝脏均有保护作用。
, 百拇医药
[中图分类号]R975+.5 [文献标识码]A
[文章编号]1000-2138(2000)03-0193-03
Experimental study on the protective effect of tea oil on the liver with obstructive jaundice
ZHOU Bin PENG Shu-you MOU Yi-ping
(Department of Surgery,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,Wenzhou 325027)
Abstract：Objective：To study the protective effect of tea oil which is rich in monounsaturated fatty acid on the liver in the common bile duct ligated rats.Methods：The rats were randomly classified into sham-operation group, bile duct ligated group and bile duct ligated group fed by tea oil. Two weeks after operation,the level of total billirubin(TB),direct billirubin(DB),glutamate pyruvate transaminase(GPT),glutamate oxaloacetale transaminase(GOT) in serum and the activity of succinic dehydrogenase(SDH) in liver were respectively detected. Also,the pathologic changes were observed by light and transmission electronic microscopy.Results：The treatment of tea oil significantly improved nutritional condition of obstructive jaundice in rats,significantly lower the level of TB,DB,GPT and GOT in serum,significantly increased the activity of SDH in mitochondria of hepatocytes and kept intact the membranous structure of mitochondria,nuclear and endoplasmic reticulum in hepatocytes.Conclusion：Tea oil has a significant protective effect on bile duct ligated rats by decreasing the hepatic damage in morphology and function.
, 百拇医药
Key words：obstructive jaundice; tea oil; morphometry; liver; unsaturated fatty acid
梗阻性黄疸是肝胆外科的常见病症，有较高的手术并发症和死亡率，其原因与肝脏、心脏和肾脏等脏器损害有密切关系。线粒体等细胞膜性结构受损，可能是脏器功能衰竭的病理学基础。本研究运用形态定量学方法对梗阻性黄疸时肝脏细胞膜性结构的损害进行定量研究，在此基础上探讨富含单不饱和脂肪酸的茶油对梗阻性黄疸大鼠的细胞膜性结构的保护作用。
1 材料和方法
1.1 实验动物及分组 取健康成年SD大鼠34只，雌雄不拘，体重170～250g，随机分为3组：①假性手术组(SO组)10只，戊巴比妥钠30mg/kg腹腔内注射麻醉，剖腹单纯游离胆总管后关腹，从术前1周至术后2周每日生理盐水2ml/kg灌胃；②胆总管结扎组(BDL组)9只，麻醉同SO组，剖腹游离胆总管，用丝线结扎后切断，复制梗阻性黄疸模型，从术前1周至术后2周每日生理盐水2ml/kg灌胃；③胆总管结扎并喂饲茶油组(TO组)15只，手术处理同BDL组，从术前1周至术后2周每日茶油2ml/kg灌胃。每组大鼠均自由摄食，实验动物及基础饲料由浙江医科大学实验动物中心提供，茶油由浙江泰顺县土产公司提供，茶油成分鉴定结果：单不饱和脂肪酸59.3%(其中含油酸56.2%)，多不饱和脂肪酸29.5%，饱和脂肪酸11.2%。
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1.2 检测及观察指标
1.2.1 大鼠营养状况观察：每只大鼠于术前及处死时各测一次体重，取差值反映营养状况。
1.2.2 肝功能测定：三组大鼠均于术后2周处死取心血测血清总胆红素(TB)、直接胆红素(DB)、谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)。
1.2.3 形态学观察：大鼠处死后取肝脏作以下观察：①光镜标本以10%福尔马林溶液固定，石蜡切片，HE染色，光镜下观察；②电镜标本以锇酸-戊二醛双固定，醋酸铀染色，环氧树脂包埋，Epikite-812超薄切片机切片，Philips EM412型透射电镜下观察。
1.2.4 形态定量学测定
1.2.4.1 标本制作：大鼠处死后取新鲜肝脏组织，Leitz冰冻切片机于-20℃作恒冷箱切片，厚度为7μm。
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1.2.4.2 琥珀酸脱氢酶(SDH)组织化学染色[1]：①步骤：将新鲜肝脏组织切片放入作用液中在恒温水浴25℃下作用30分钟，生理盐水洗后用10%福尔马林溶液固定10分钟，放入80%酒精中脱水5分钟，中性树胶封片。作为对照的新鲜肝脏组织切片先放入沸水中浸泡10分钟，再同上步骤处理。②结果判断：阳性反应产物呈细小的蓝紫色颗粒，见于线粒体，定位于胞质，二甲潜阳性反应与细胞内线粒体SDH活性成正相关。阴性对照不显色。
1.2.4.3 SDH活性检测：取SDH组织化学染色切片，在MIPS-I型多功能图像分析仪上，经 CCD摄像系统扫描显示于计算机屏幕上，于图中肝小叶中随机选取大小为13220点像素面积(0.06微米2/像素)，测定波长为550nm单色光下此面积光密度值(OD550)。OD值与该面积内SDH活性成正相关。每组测4张切片，每片测10～11块面积。
1.3 统计学处理 所有数据经SPSS/PC+统计软件包处理，采用t检验作差异显著性分析。
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2 结果
2.1 大鼠营养状况 大鼠体重变化情况如表1所示。实验期内，3组大鼠体重均呈增长趋势，但SO组和TO组体重增长较BDL组更显著。
表1 实验期大鼠体重变化 组别
n
体重增加量(g)
SO
10
44.50±18.33
BDL
9
26.67±11.99*
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TO
15
40.00±14.52△
与SO组比较：*P<0.05；与BDL组比较：△P<0.052.2 肝功能测定 大鼠肝功能测定结果如表2所示。BDL组与SO组比较，各项指标均明显升高。TO组与SO组比较，仅GOT明显升高。BDL组与TO组比较，TB、GPT和GOT均明显升高。
2.3 形态学观察 大鼠肝脏组织显微及超微结构
表2 大鼠肝功能测定结果 组别
n
TB(mg/dl)
DB(mg/dl)
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GPT(U/L)
GOT(U/L)
SO
10
0.22±0.06
0.08±0.02
50.10±6.28
158.40±27.68
BDL
9
4.13±3.74*
3.48±3.54*
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200.78±129.75*
1146.00±819.72*
TO
15
1.36±2.48△
0.93±2.02
93.47±86.78△
384.47±340.13*△
与SO组比较：*P<0.05；与BDL组比较：△P<0.05观察如表3所示。表3 大鼠肝脏组织显微和超微结构改变 组别
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显微结构改变
超微结构改变
SO
无异常
无异常
BDL
肝细胞变性坏死，小叶结构紊乱，叶间胆管和结缔组织增生，严重淤胆，汇管区大量炎症细胞浸润
线粒体外膜破裂，嵴减少或消失，部分线粒体溶解，核明显皱缩变形，内质网肿胀和空泡样变
TO
肝细胞浊肿，小叶结构稍紊乱，尚完整，炎症细胞浸润、胆管增生和淤胆程度均较BDL组为轻
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线粒体外膜尚完整，嵴存在，核膜完整，核无明显变形，内质网轻度肿胀，改变程度轻于BDL组
2.4 形态定量学测定 大鼠肝脏组织内的SDH活性测定结果如表4所示。BDL组和TO组与SO组比较，OD550值均明显降低；但TO组与BDL组比较，OD550值明显升高。表4 大鼠肝脏组织SDH组化染色OD测定值 (λ=550nm) 组别
n
OD550
SO
40
0.4598±0.0515
BDL
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43
0.3464±0.0487*
TO
41
0.4127±0.0536*△
与SO组比较：*P<0.05；与BDL组比较：△P<0.053 讨论
本实验通过形态学观察证实，在胆道梗阻二周时，大鼠肝细胞内线粒体外膜部分破裂，嵴减少或消失，部分线粒体溶解，核明显皱缩变形，内质网肿胀和空泡样变，说明肝细胞在形态结构上受到严重损害；同时血清内TB、DB、GPT和GOT均明显上升，而SDH活性明显下降(P<0.05)，说明肝细胞功能明显受损。以上结果提示梗阻性黄疸时肝细胞功能损害有其形态学基础，功能和形态学改变相一致。
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细胞膜流动性是指细胞中各种膜系统(包括细胞质膜、内质网膜、线粒体膜和核膜)具有类似于液体易流动的一种物理性质。生物膜的各种重要功能，如物质转运、信息传递和能量转换等都与膜的流动状态密切相关，因此生物膜合适的流动性是细胞完成正常生理功能的必备条件[2]。唐茂云等研究发现，给大鼠喂饲茶油后，红细胞膜、肝微粒体膜和心肌线粒体膜的荧光偏振度较对照组显著降低(即膜流动性增强)[3]。另有研究表明，茶油能明显降低血浆中过氧化物(LPO)代谢终产物丙二醛(MDA)浓度；明显升高全血过氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶的活性，从而降低LPO的生成[4]。
本实验发现，茶油能显著增加梗阻性黄疸大鼠体重，改善营养状况；明显降低血清TB、DB、GPT和GOT水平，改善肝功能；明显增强肝细胞线粒体SDH活性；在一定程度上保持梗阻性黄疸大鼠肝细胞线粒体、内质网和核膜结构的完整性。其机理可能是由于不饱和脂肪酸是生物膜磷脂的主要成分，外源性不饱和脂肪酸能迅速掺入膜磷脂，改变膜脂组成，改善膜流动性，修复已损伤的膜结构；或作为自由基攻击的标靶，外源性不饱和脂肪酸可减轻脂质过氧化反应对原细胞膜不饱和脂肪酸的损伤。因此茶油对梗阻性黄疸大鼠肝脏有保护作用。
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作者简介：周斌(1972-)，男，浙江温州人，医学硕士，住院医师。
参考文献
[1] 贲长恩,李叔庚主编.实用酶组织化学[M].长沙：湖南科学技术出版社,1996.201-206.
[2] 林克椿,聂松青.细胞膜的流动性[J].生理科学进展,1985,16(1):83-89.
[3] 唐茂云,张文敏,胡曼玲，等.食用油对血脂、膜质过氧化、膜磷脂脂肪酸及血小板功能的影响[J].营养学报,1994,16(3):239-245.
[4] 陈梅芳，顾景范，孙明堂，等.茶油延缓动脉粥样硬化形成及其机理的探讨 [J].营养学报,1996,18(1):13-18.
收稿日期：1999-10-18
修回日期：2000-06-16, 百拇医药