NDV对体外培养的肿瘤细胞杀伤性研究
作者：李小军 赵铁军 田伏洲 尹致良
单位：成都军区成都总医院普外科
关键词：肿瘤治疗学；新城疫病毒；细胞培养
西北国防医学杂志MEDICAL JOURANL OF NATIONAL DEFENDING FORCES IN NORTHWEST CHINA1999年 第20卷 第2期 Vol 摘要：目的：探讨NDV病毒体外对肿瘤细胞的杀伤性。方法：人的SGC-9701和SMMC-7721肿瘤细胞为靶细胞，观察了NDV对其直接杀伤作用。结果：NDV病毒能作用于瘤细胞，并最终使肿瘤细胞死亡。结论：NDV病毒是一种有效的肿瘤细胞溶解剂，在体外具有明显的直接杀伤瘤细胞作用。
中图分类号：R 730.5
文献标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1007-8622(1999)02-0103-04
Study on the killing function of NDV to cultured tumor cells in vitro
LI Xiaojun,ZHAO Tiejun,TIAN Fuzhou,et al.
Center of General Surgery of CPLA,Chendu General Hospital,Chendu Command,PLA,610083
Abstract:Purpose:To probe into the killing function of Newcastle disease virus(NDV) to cultured tumor cells in vitro.Methods:Human SGC-9701 and SMMC-7721 tumor cells were regarded as target cells to observe the direct killing effect of NDV on them.Results:NDV had an effect on tumor cells and finally made them dead.Conclusion:NDV might be an effective dissolvent to tumor cells.It has obvious direct killing effect on tumor cells in vitro.
, 百拇医药
Key words:Neoplasfic therapy; Newcastle disease virus; Cell culture
Lindennan提出某些病毒修饰或提高抗原性的设想以来，病毒治疗肿瘤引起广大研究者的兴趣。Gsatary等用NDV-b8/N治疗颈部肿瘤病人，得到很好的疗效，55%的病人肿瘤消退[1]。Cassel等证明新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)能直接杀伤肿瘤细胞产生细胞溶解作用，而对病人无毒性。我们在此研究和本中心研究的基础上[1，2]，利用体外培养的肿瘤细胞观察研究了NDV病毒直接杀伤作用，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 新城疫病毒：四川省农科院引进本中心接种于SPF-9 d鸡胚传代、增殖、超速离心，纯化病毒液经血球凝集检测效价为1∶1 280。
, 百拇医药
肿瘤细胞株：人胃癌细胞株SGC-9701，人肝癌细胞株SMMC-7721均培养于含10%小牛血清，1 000 U/L青霉素，80 mg/L链霉素，pH 7.4的RPMI 1640液中，培养条件为37℃，5%CO2；二株细胞均为上皮细胞型贴壁生长。
1.2 将生长良好的肿瘤细胞用0.25%胰蛋白酶和0.02%的EDTA混合液消化后收集，制备成1×103/ml的细胞悬液，接种于96孔板上，尽量吹打均匀，平行接种5孔，并做对照，再加NDV病毒50 μl，放于37℃、5%CO2培养箱中，分别于6 h、12 h、24 h、48 h进行形态观察和指标检测。
1.3 光学显微镜观察肿瘤细胞的伸展性和计算贴壁率变化，留取上清液作NDV血凝效价检测；MTT检测肿瘤细胞存活率，酶联免疫仪570 nm测OD值，用下列公式计算。
, 百拇医药
2 结果
2.1 肿瘤细胞伸展性和贴壁率：利用光镜直接选择三个视野观察了肿瘤细胞的伸展性和贴壁率，随着NDV作用时间的延长，肿瘤细胞萎缩、脱落、最后悬浮，贴壁率显著下降；伴随着NDV在瘤细胞存活和复制，培养上清液中的血凝效价上升(表1)。
2.2 肿瘤细胞存活率：按理讲肿瘤细胞存活率应与贴壁率无差别，但表1中显示，存活率却高于贴壁率，可能原因一是肿瘤细胞NDV杀伤后呈不良生长而脱落，但却仍存活着；另一原因与光镜下计算误差有关；虽有这两方面的影响，实验组与对照组仍存在相差显著性(P<0.01)。
表1 NDV对SGC-7701及SMMC-7721的杀伤作用
共同培养时间(h)及分组
6 h
, 百拇医药
12 h
24 h
48 h
对照组
实验组
对照组
实验组
对照组
实验组
对照组
实验组
贴壁率(%)
94
, 百拇医药
76
93
58
89
22
90
19
9701血凝效价
0
1∶80
0
1∶480
0
, 百拇医药 1∶1 640
0
1∶1 200
存活率(%)
95
89
91
71
92
31
91
23
贴壁率(%)
, http://www.100md.com
92
79
92
56
91
21
86
15
7721血凝效价
0
1∶80
0
1∶420
, 百拇医药 0
1∶1 260
0
1∶1 260
存活率(%)
98
83
95
61
93
29
92
20
, http://www.100md.com 3 讨论
Flangan Cassel多次证明新城疫病毒NDV具有治疗多种肿瘤的潜力后，NDV病毒研究得到发展。Lorence等局部注射NDV病毒液到成纤维瘤裸鼠移植瘤中，能使8/10的裸鼠肿瘤消退，且不复发[3]。我们利用NDV攻击H22荷瘤小鼠，取得较好疗效基础上，又着重探讨了对体外培养的肿瘤细胞杀伤作用，观察了其在体外对肿瘤细胞引起的变化和死亡，结果发现NDV使肿瘤细胞SGC-9701、SMMC-7721贴壁率和存活率显著下降，且NDV对肿瘤细胞表现出最强的活性是在12 h～24 h之间(表1)。
NDV病毒诱导肿瘤细胞死亡或瘤体消退的机制国内外解释很多，集中到3点解释有[4，5]：①NDV病毒促进宿主产生细胞因子，如干扰素、白细胞介素等；②NDV病毒直接作用于瘤细胞产生细胞毒作用，而且病毒选择性作用于肿瘤细胞而对正常细胞不起反应，这和我们在用人的成纤维细胞与NDV作用的结果一致(将另文报道)；③NDV病毒蛋白与肿瘤细胞膜结合，促进肿瘤抗原的免疫原性，从而加强宿主细胞及体液免疫杀伤肿瘤细胞。NDV病毒作用于肿瘤细胞可能是肿瘤细胞存在对NDV病毒特异的膜受体，另一个是NDV能在活的肿瘤细胞中存活复制，致使肿瘤细胞脱落、死亡。
, 百拇医药
另外我们在预实验用MTT检测细胞存活分析时发现，NDV病毒能与MTT产生颜色反应，而且干扰不小，本实验全部都单独设立了NDV孔，用以减少测量误差。但又发现煮沸致死的NDV病毒与MTT也起反应，这多少都影响实验结果，具体NDV病毒与MTT怎样产生颜色反应,我们将进一步研究。作者简介：李小军，男，26岁，本科，技师，成都军区成都总医院普外科，成都，610083
参考文献:
[1]Csatary LK,Eckhardt S, Bukosza I,et al.Attenuated veterinary vaccine for the treatment of camer.Cancer Detect Prev,1993,17:617-627.
[2]尹致良，李小军，田伏洲,等.NDV不同剂量与时间治疗小鼠腹水瘤的生存期结果比较，西南国防医药,1998，8(2)：83-84.
, http://www.100md.com
[3]Lorence RM,Rcichard KW,Katubig BB,et al. Complete regression of human neuroblastoma xenografts in athymic mice after local Newcasstle disease virus therapy.J Natl Cancer Inst,1994，86：1228-1233.
[4]Reichard KW,lorence RM,Cascino CJ,et al.Newcastle disease virus selectively kills human tumor cells,J Surg Res,1992，52：448-453.
[5]Cassel WA,Garrett RE.Newcastle disease virus as an antineoplastic agent.Cancer,1965，18：863-868.
收稿日期：1998-10-19 修回：1998-11-30, 百拇医药
单位：成都军区成都总医院普外科
关键词：肿瘤治疗学；新城疫病毒；细胞培养
西北国防医学杂志MEDICAL JOURANL OF NATIONAL DEFENDING FORCES IN NORTHWEST CHINA1999年 第20卷 第2期 Vol 摘要：目的：探讨NDV病毒体外对肿瘤细胞的杀伤性。方法：人的SGC-9701和SMMC-7721肿瘤细胞为靶细胞，观察了NDV对其直接杀伤作用。结果：NDV病毒能作用于瘤细胞，并最终使肿瘤细胞死亡。结论：NDV病毒是一种有效的肿瘤细胞溶解剂，在体外具有明显的直接杀伤瘤细胞作用。
中图分类号：R 730.5
文献标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1007-8622(1999)02-0103-04
Study on the killing function of NDV to cultured tumor cells in vitro
LI Xiaojun,ZHAO Tiejun,TIAN Fuzhou,et al.
Center of General Surgery of CPLA,Chendu General Hospital,Chendu Command,PLA,610083
Abstract:Purpose:To probe into the killing function of Newcastle disease virus(NDV) to cultured tumor cells in vitro.Methods:Human SGC-9701 and SMMC-7721 tumor cells were regarded as target cells to observe the direct killing effect of NDV on them.Results:NDV had an effect on tumor cells and finally made them dead.Conclusion:NDV might be an effective dissolvent to tumor cells.It has obvious direct killing effect on tumor cells in vitro.
, 百拇医药
Key words:Neoplasfic therapy; Newcastle disease virus; Cell culture
Lindennan提出某些病毒修饰或提高抗原性的设想以来，病毒治疗肿瘤引起广大研究者的兴趣。Gsatary等用NDV-b8/N治疗颈部肿瘤病人，得到很好的疗效，55%的病人肿瘤消退[1]。Cassel等证明新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)能直接杀伤肿瘤细胞产生细胞溶解作用，而对病人无毒性。我们在此研究和本中心研究的基础上[1，2]，利用体外培养的肿瘤细胞观察研究了NDV病毒直接杀伤作用，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 新城疫病毒：四川省农科院引进本中心接种于SPF-9 d鸡胚传代、增殖、超速离心，纯化病毒液经血球凝集检测效价为1∶1 280。
, 百拇医药
肿瘤细胞株：人胃癌细胞株SGC-9701，人肝癌细胞株SMMC-7721均培养于含10%小牛血清，1 000 U/L青霉素，80 mg/L链霉素，pH 7.4的RPMI 1640液中，培养条件为37℃，5%CO2；二株细胞均为上皮细胞型贴壁生长。
1.2 将生长良好的肿瘤细胞用0.25%胰蛋白酶和0.02%的EDTA混合液消化后收集，制备成1×103/ml的细胞悬液，接种于96孔板上，尽量吹打均匀，平行接种5孔，并做对照，再加NDV病毒50 μl，放于37℃、5%CO2培养箱中，分别于6 h、12 h、24 h、48 h进行形态观察和指标检测。
1.3 光学显微镜观察肿瘤细胞的伸展性和计算贴壁率变化，留取上清液作NDV血凝效价检测；MTT检测肿瘤细胞存活率，酶联免疫仪570 nm测OD值，用下列公式计算。
, 百拇医药
2 结果
2.1 肿瘤细胞伸展性和贴壁率：利用光镜直接选择三个视野观察了肿瘤细胞的伸展性和贴壁率，随着NDV作用时间的延长，肿瘤细胞萎缩、脱落、最后悬浮，贴壁率显著下降；伴随着NDV在瘤细胞存活和复制，培养上清液中的血凝效价上升(表1)。
2.2 肿瘤细胞存活率：按理讲肿瘤细胞存活率应与贴壁率无差别，但表1中显示，存活率却高于贴壁率，可能原因一是肿瘤细胞NDV杀伤后呈不良生长而脱落，但却仍存活着；另一原因与光镜下计算误差有关；虽有这两方面的影响，实验组与对照组仍存在相差显著性(P<0.01)。
表1 NDV对SGC-7701及SMMC-7721的杀伤作用
共同培养时间(h)及分组
6 h
, 百拇医药
12 h
24 h
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对照组
实验组
对照组
实验组
对照组
实验组
对照组
实验组
贴壁率(%)
94
, 百拇医药
76
93
58
89
22
90
19
9701血凝效价
0
1∶80
0
1∶480
0
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0
1∶1 200
存活率(%)
95
89
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贴壁率(%)
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7721血凝效价
0
1∶80
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1∶420
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1∶1 260
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1∶1 260
存活率(%)
98
83
95
61
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29
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20
, http://www.100md.com 3 讨论
Flangan Cassel多次证明新城疫病毒NDV具有治疗多种肿瘤的潜力后，NDV病毒研究得到发展。Lorence等局部注射NDV病毒液到成纤维瘤裸鼠移植瘤中，能使8/10的裸鼠肿瘤消退，且不复发[3]。我们利用NDV攻击H22荷瘤小鼠，取得较好疗效基础上，又着重探讨了对体外培养的肿瘤细胞杀伤作用，观察了其在体外对肿瘤细胞引起的变化和死亡，结果发现NDV使肿瘤细胞SGC-9701、SMMC-7721贴壁率和存活率显著下降，且NDV对肿瘤细胞表现出最强的活性是在12 h～24 h之间(表1)。
NDV病毒诱导肿瘤细胞死亡或瘤体消退的机制国内外解释很多，集中到3点解释有[4，5]：①NDV病毒促进宿主产生细胞因子，如干扰素、白细胞介素等；②NDV病毒直接作用于瘤细胞产生细胞毒作用，而且病毒选择性作用于肿瘤细胞而对正常细胞不起反应，这和我们在用人的成纤维细胞与NDV作用的结果一致(将另文报道)；③NDV病毒蛋白与肿瘤细胞膜结合，促进肿瘤抗原的免疫原性，从而加强宿主细胞及体液免疫杀伤肿瘤细胞。NDV病毒作用于肿瘤细胞可能是肿瘤细胞存在对NDV病毒特异的膜受体，另一个是NDV能在活的肿瘤细胞中存活复制，致使肿瘤细胞脱落、死亡。
, 百拇医药
另外我们在预实验用MTT检测细胞存活分析时发现，NDV病毒能与MTT产生颜色反应，而且干扰不小，本实验全部都单独设立了NDV孔，用以减少测量误差。但又发现煮沸致死的NDV病毒与MTT也起反应，这多少都影响实验结果，具体NDV病毒与MTT怎样产生颜色反应,我们将进一步研究。作者简介：李小军，男，26岁，本科，技师，成都军区成都总医院普外科，成都，610083
参考文献:
[1]Csatary LK,Eckhardt S, Bukosza I,et al.Attenuated veterinary vaccine for the treatment of camer.Cancer Detect Prev,1993,17:617-627.
[2]尹致良，李小军，田伏洲,等.NDV不同剂量与时间治疗小鼠腹水瘤的生存期结果比较，西南国防医药,1998，8(2)：83-84.
, http://www.100md.com
[3]Lorence RM,Rcichard KW,Katubig BB,et al. Complete regression of human neuroblastoma xenografts in athymic mice after local Newcasstle disease virus therapy.J Natl Cancer Inst,1994，86：1228-1233.
[4]Reichard KW,lorence RM,Cascino CJ,et al.Newcastle disease virus selectively kills human tumor cells,J Surg Res,1992，52：448-453.
[5]Cassel WA,Garrett RE.Newcastle disease virus as an antineoplastic agent.Cancer,1965，18：863-868.
收稿日期：1998-10-19 修回：1998-11-30, 百拇医药