丙型肝炎病毒E2及preS融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达
作者：谢尧 陶其敏
单位：100044 北京医科大学人民医院肝病研究所
关键词：
中华医学杂志990223 丙型肝炎病毒(HCV)C基因与preS2基因嵌合，嵌合基因免疫小鼠能产生抗HCV C蛋白的抗体，而单独接种HCV C基因则不能诱导小鼠产生抗 C蛋白的抗体[1]。为研究preS能否增加HCV E2蛋白的免疫原性提供物质基础，我们在哺乳动物细胞稳定表达了E2-preS融合蛋白。
一、材料与方法
1.真核表达载体的构建和DNA测序：根据甘人宝报道的中国HBV-adr亚型的DNA序列设计引物，用PCR方法扩增全长preS基因，下游引入终止密码子,上、下游分别引入EcoRI和 XbalⅠ 酶切位点。以本所克隆的中国基因ⅢHCV E2基因为模板[2]， 扩增E2包膜蛋白基因，上游引入起始密码子，上、下游分别引入Hind Ⅲ及 EcoRI酶切位点。以pcDNA3质粒为真核表达载体，将载体和扩增的preS基因分别用EcoRI和XbalⅠ 进行双酶切，用T4 DNA连接酶将二者连接，产物转化大肠杆菌(JM109)。培养后，经对提取的质粒进行酶切鉴定获得含有preS基因的阳性克隆。同样，将E2基因克隆于含有preS基因的质粒中，经酶切鉴定获得含有E2-preS嵌合基因的克隆，命名为pcDNAE2-preS。DNA测序由赛百盛公司完成。
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2.E2-preS融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达及检测: 以NIH3T3细胞为宿主细胞。用脂质体转染试剂将pcDNAE2-preS转染细胞6小时。换新鲜培养液继续培养48小时后，用G418(700μg/ml)进行筛选培养。转染pcDNAE2-preS的细胞长成克隆后，用含G418(300 μg/ml)的培养液进行维持培养，并逐步扩大培养，传代于培养瓶中。细胞长至90%时，用细胞裂解液裂解。裂解产物经SDS-PAGE电泳后，转于硝酸纤维素膜上，分别用preS2单抗和含有E2抗体的HCV血清(无HBV感染)为一抗作 Western blot检测。
二、结果
扩增的preS基因约为520 bp，HCV E2基因约为1.1 kb。融合蛋白表达载体 pcDNAE2-preS的结构见图1。用Hind Ⅲ和Xbal Ⅰ内切酶可切下长度约为1.6 kb的E2-preS基因片段。用Hind Ⅲ 、EcoR I 和Xbal Ⅰ三个内切酶可切下preS、E2基因和空载体见图2。DNA测序证实融合蛋白基因含有1620个核苷酸(preS 为522 bp 、E2为1092 bp，两基因片段之间有6 bp的内切酶位点)，preS的核苷酸序列与报道的相同，E2的核苷酸序列与模板相比，在克隆的E2基因第939位核苷酸有变异(G→C),但编码的氨基酸不变。融合蛋白基因读码框架正确。
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图1 E2-preS融合蛋白真核表达载体的结构
1.1.6kb的E2-preS的片段；2.1.1kb的E2和520bp的preS基因
图2 pcDNAE2-preS质粒酶切鉴定的电泳图谱
用E2抗体阳性血清对表达的融合蛋白进行Western blot检测，阳性细胞克隆裂解产物泳道可见一条边缘整齐的特异性显色条带，相对分子质量约60 000，而阴性对照(转染pcDNA3空载体和正常的NIH3T3细胞)在相应位置未见条带。用preS2单克隆抗体为一抗对裂解产物行Western blot检测，结果显示，阳性细胞及对照细胞在同一位置均可见一显色带，条带相对分子质量与用抗E2阳性血清检测的显色条带一致。
三、讨论
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本文的融合蛋白基因包括了全长的HBV preS和HCV E2基因，测序结果显示，融合蛋白基因读码框架正确，无氨基酸突变，从而保证了表达产物的正确性。
本实验结果显示，E2蛋白位于preS的上游，融合蛋白基因中间又无终止密码子，E2蛋白就相当于报告基因，有E2蛋白的表达就表明有preS蛋白表达。虽然天然的E2糖蛋白为70 000，但不同作者表达的E2蛋白相对分子质量有很大的差异，可能因表达所用的宿主细胞不同和E2基因的差异而造成糖基化位点数目的不同所致。E2蛋白的糖基化需要位于E1蛋白基因C端的一段信号[3]，而我们克隆的E2基因不含此信号。融合蛋白的相对分子质量约为60 000。
本实验构建的E2-preS融合蛋白真核表达载体在哺乳动物细胞中稳定表达出了融合蛋白，为进一步研究preS能否增强E2蛋白的免疫原性及用融合蛋白治疗慢性混合性HBV和HCV感染的研究奠定了基础。
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参考文献
1 Major M, Vitvitshi L, Mink M. DNA-based immunization with chimeric vector for the induction of immune responses against the hepatitis C virus nucleocapsid. J Virol，1995,69：5797-5805.
2 吴朝栋，陶其敏. Ⅲ型中国丙型肝炎病毒E2/NS1基因的克隆与序列分析.中华医学杂志，1998,78:115-117.
3 Choo QL, Richman KH, Han JH, et al. Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus. Proc Natl Acad Sci USA，1991,88:2451-2455.
(收稿：1998-05-07 修回：1998-10-26), 百拇医药
单位：100044 北京医科大学人民医院肝病研究所
关键词：
中华医学杂志990223 丙型肝炎病毒(HCV)C基因与preS2基因嵌合，嵌合基因免疫小鼠能产生抗HCV C蛋白的抗体，而单独接种HCV C基因则不能诱导小鼠产生抗 C蛋白的抗体[1]。为研究preS能否增加HCV E2蛋白的免疫原性提供物质基础，我们在哺乳动物细胞稳定表达了E2-preS融合蛋白。
一、材料与方法
1.真核表达载体的构建和DNA测序：根据甘人宝报道的中国HBV-adr亚型的DNA序列设计引物，用PCR方法扩增全长preS基因，下游引入终止密码子,上、下游分别引入EcoRI和 XbalⅠ 酶切位点。以本所克隆的中国基因ⅢHCV E2基因为模板[2]， 扩增E2包膜蛋白基因，上游引入起始密码子，上、下游分别引入Hind Ⅲ及 EcoRI酶切位点。以pcDNA3质粒为真核表达载体，将载体和扩增的preS基因分别用EcoRI和XbalⅠ 进行双酶切，用T4 DNA连接酶将二者连接，产物转化大肠杆菌(JM109)。培养后，经对提取的质粒进行酶切鉴定获得含有preS基因的阳性克隆。同样，将E2基因克隆于含有preS基因的质粒中，经酶切鉴定获得含有E2-preS嵌合基因的克隆，命名为pcDNAE2-preS。DNA测序由赛百盛公司完成。
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2.E2-preS融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达及检测: 以NIH3T3细胞为宿主细胞。用脂质体转染试剂将pcDNAE2-preS转染细胞6小时。换新鲜培养液继续培养48小时后，用G418(700μg/ml)进行筛选培养。转染pcDNAE2-preS的细胞长成克隆后，用含G418(300 μg/ml)的培养液进行维持培养，并逐步扩大培养，传代于培养瓶中。细胞长至90%时，用细胞裂解液裂解。裂解产物经SDS-PAGE电泳后，转于硝酸纤维素膜上，分别用preS2单抗和含有E2抗体的HCV血清(无HBV感染)为一抗作 Western blot检测。
二、结果
扩增的preS基因约为520 bp，HCV E2基因约为1.1 kb。融合蛋白表达载体 pcDNAE2-preS的结构见图1。用Hind Ⅲ和Xbal Ⅰ内切酶可切下长度约为1.6 kb的E2-preS基因片段。用Hind Ⅲ 、EcoR I 和Xbal Ⅰ三个内切酶可切下preS、E2基因和空载体见图2。DNA测序证实融合蛋白基因含有1620个核苷酸(preS 为522 bp 、E2为1092 bp，两基因片段之间有6 bp的内切酶位点)，preS的核苷酸序列与报道的相同，E2的核苷酸序列与模板相比，在克隆的E2基因第939位核苷酸有变异(G→C),但编码的氨基酸不变。融合蛋白基因读码框架正确。
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图1 E2-preS融合蛋白真核表达载体的结构
1.1.6kb的E2-preS的片段；2.1.1kb的E2和520bp的preS基因
图2 pcDNAE2-preS质粒酶切鉴定的电泳图谱
用E2抗体阳性血清对表达的融合蛋白进行Western blot检测，阳性细胞克隆裂解产物泳道可见一条边缘整齐的特异性显色条带，相对分子质量约60 000，而阴性对照(转染pcDNA3空载体和正常的NIH3T3细胞)在相应位置未见条带。用preS2单克隆抗体为一抗对裂解产物行Western blot检测，结果显示，阳性细胞及对照细胞在同一位置均可见一显色带，条带相对分子质量与用抗E2阳性血清检测的显色条带一致。
三、讨论
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本文的融合蛋白基因包括了全长的HBV preS和HCV E2基因，测序结果显示，融合蛋白基因读码框架正确，无氨基酸突变，从而保证了表达产物的正确性。
本实验结果显示，E2蛋白位于preS的上游，融合蛋白基因中间又无终止密码子，E2蛋白就相当于报告基因，有E2蛋白的表达就表明有preS蛋白表达。虽然天然的E2糖蛋白为70 000，但不同作者表达的E2蛋白相对分子质量有很大的差异，可能因表达所用的宿主细胞不同和E2基因的差异而造成糖基化位点数目的不同所致。E2蛋白的糖基化需要位于E1蛋白基因C端的一段信号[3]，而我们克隆的E2基因不含此信号。融合蛋白的相对分子质量约为60 000。
本实验构建的E2-preS融合蛋白真核表达载体在哺乳动物细胞中稳定表达出了融合蛋白，为进一步研究preS能否增强E2蛋白的免疫原性及用融合蛋白治疗慢性混合性HBV和HCV感染的研究奠定了基础。
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参考文献
1 Major M, Vitvitshi L, Mink M. DNA-based immunization with chimeric vector for the induction of immune responses against the hepatitis C virus nucleocapsid. J Virol，1995,69：5797-5805.
2 吴朝栋，陶其敏. Ⅲ型中国丙型肝炎病毒E2/NS1基因的克隆与序列分析.中华医学杂志，1998,78:115-117.
3 Choo QL, Richman KH, Han JH, et al. Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus. Proc Natl Acad Sci USA，1991,88:2451-2455.
(收稿：1998-05-07 修回：1998-10-26), 百拇医药