固定剂和蛋白激酶C活性对蛙骨骼肌纤维三联体超微结构的影响*
作者：吴光明 朱培闳
单位：中国科学院上海生理研究所，上海 200031
关键词：Ryanodine受体；蛋白激酶C；接头足；三联体；骨骼肌纤维；蛙
解剖学报980115
摘 要 用透射电镜研究了不同固定方法和蛋白激酶C(PKC)活性对蛙骨骼肌纤维三
联体超微结构，特别是对接头足(以下简称为足)形态和数量的影响。结果表明，常规戊
二醛固定和含苦味酸的多聚甲醛固定对三联体的超微结构无明显影响，足可以分为柱、不完整足、空心柱、桥和非典型足等5类，各类足的比例及数量也相似。肌纤维用PKC
, 百拇医药 激动剂和抑制剂作用后，三联体的横小管和肌浆网形态无改变，而各种形态足的比例有
变化。但是，这些变化与已知的PKC活性变化无关。上述结果提示，作为Ryanodine受
体/钙释放通道蛋白分子一部分的足在形态上是一种多变的结构。如果过去观察到的
PKC激动剂引起的兴奋收缩去耦联是由肌纤维的结构变化引起的，则这一变化不在三联
体或不能用透射电镜显示。
骨骼肌纤维三联体由横小管和位于其两侧的肌浆网终池(胞内钙库)组成，它是肌纤
维兴奋收缩耦联的结构基础。对三联体的电镜研究表明，横小管膜和肌浆网膜之间有
12nm左右的间隙，其中存在接头足(junction foot，以下简称为足)的结构。但是，不同作
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者所报告的足的形态不尽相同[1～3]。近年来的许多研究结果证实，足是位于肌浆网膜
上的Ryanodine受体(一种在调节胞浆自由钙离子浓度中起重要作用的钙释放通道)向间隙
突出的部分形成的[4～5]。
本工作主要目的是探讨作为Ryanodine受体一部分的足结构为什么呈现不同的形态?
为此，本实验研究了样品制备，主要是固定剂对足形态和数量的影响。此外，新近的
工作表明，12，13-二丁酸佛波酯(phorbol 12,13-dibutyrate, PDBu)作为蛋白激酶C(PKC)
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激动剂能引起蛙骨骼肌纤维兴奋收缩去耦联[6]。三联体中的多种蛋白，包括Ryanodine
受体可能是PKC的作用底物[7]。为了阐明PDBu的去耦联作用机制，我们还观察了改变
PKC活性对三联体，主要是对足形态的影响。
材料和方法
1.样品制备和观察
黑斑蛙(Rananigromaculata)毁髓后，取出两侧缝匠肌。肌肉在生理长度下，用下述
两种固定液作预固定。一种为4%戊二醛(pH7.2, 以0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液配制)，简
, 百拇医药
称为GF；另一种为Somogyi和Takagi所报道的固定液[8]：其成分为0.2%苦味酸，4%多聚
甲醛，0.05%戊二醛，以pH7.2 0.2mol/L磷酸缓冲液配制，简称为SF。预固定均在4℃过
夜。预固定后，标本用Ringer液冲洗，修块。Ringer液组成为：120mmol/L NaCl,2mmol/L KCl, 1.8mmol/L CaCl2,4mmol/L HEPES。用NaOH调pH至7.2。然后在1%锇酸(以
0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液配制)中作后固定，(4℃，2h)。梯度丙酮脱水，其中除在含
饱和醋酸铀的70%丙酮中浸泡过夜外，其他各步均为10min。Epon 812浸透并包埋。用
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超薄切片机做纵切片，厚30～70nm，切片经4%醋酸铀和4.8%枸橼酸铅分别浸染10min
和5min，用Opton902透射电镜观察。
为研究PKC活性的作用，肌肉分为10组。其中4组为对照组，1组为取出后立即固
定，另外3组分别在正常Ringer液中15℃通氧孵育0.5h、2h和24h。其他6组为实验组，分
别在含1μmol/LPDBu Ringer液，以及同时含10μmol/L 多粘菌素B(polymyxin B, PMB;
蛋白激酶抑制剂)和1μmol/L PDBu Ringer液中孵育0.5h、2h和24h。经上述处理后的标
本，均用4%戍二醛固定，以后各步同前。
, 百拇医药
2. 图像选取
在电镜观察时，选用厚为50nm的切片。为了随机选取图像，参照Eisenberg等的定
点取样法[1]，如图1所示。即在100目铜网中，每目选定以下9个点：4个角，4条边的中
点，以及目的中心。拍摄三联体脂质双层膜清晰，不歪斜，无铅污染的图像，电镜放
大倍数为12 000倍。
3.形态测量
形态测量在光学放大4倍的照片上进行。足的形态在文献中已有描述，多把足分为
2～4类[1～3]。在反复观察的基础上，并结合文献描述，本工作把足分为以下5类：柱
, 百拇医药
(column)、不完整足(imperfect feet)、空心柱(pillar)、桥(bridge)、以及非典型足(atypical
feet)。图2为各类足的模式图。其中柱最为常见，其宽度约为30nm。不完整足又分为部
分足(partial feet)和线(line)两种，它们的宽度均与柱相当，只是前者不与横小管膜接触，而后者与肌浆网膜和横小管膜都不接触。空心柱的宽度也与柱相当，但其中心存在低密
度区。桥与空心柱相似，所不同的是前者宽度只有后者的一半。不能归入上述各类形态
的足，统称为非典型足。为了确切鉴别足的形态，仅选取横小管呈完全正切的三联体，其横小管脂质双层膜不仅清晰，而且宽度均匀一致。
(图1) (图2)
, 百拇医药
图1 定点取样示意图
Fig.1 Schematicdiagram of points sampling.
图2 骨骼肌纤维三联体及各类足的模式图
Fig.2 Schematicdiagram of the triad and various types ofjunctional feet inskeletal
muscle fibres.
用上述常规电镜技术，对足形态的确认仍有一定的困难。在经过反复多次辨认后，可以达到每次所得到的各类形态足的比例结果差别不大。为减少误差，每张照片上足
的辩认一般要进行两次，两次时间间隔至少两个月，各类足比例的结果为两次观察的
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平均。然后，根据Eisenberg等的方法[1]测定足的数量。在这一方法中，先计算每张照
片上正切三联体的足数，从而计算出总的足数；再测定每张照片上横小管膜周长，最
后得到每μm横小管膜周长的足数。
各实验组统计的照片数7～30张不等，每张照片一般含有3个三联体，每个三联体
多呈现4个足。足形态构成，采用χ2检验进行数理统计。在统计PKC活性影响的结果
时，非典型足的理论数不够大，故未列入统计。足数量的比较，采用Student t检验。
, http://www.100md.com 图4 固定方法对各类足比例的影响。GF.常规戊二醛固定液SF.含苦味酸多聚甲醛固定
液。χ2检验，两组间无差别(P>0.05)。n.检测的足数
Fig.4 Effect offixation method on the proportion of various feet.GF:conventional glutarald-
ehyde fixative; SF:Paraformaldehydefixative containing picricacid. χ2 test, no
difference between two groups (P>0.05).N:the number of the examined feet.
, 百拇医药
图5 PKC活性对各类足比例的影响。PDBu.1μmol/L; PMB.10μmol/L。作用时间：
0.5h、2h和24hn:检测的足数。*与孵育相同时间的对照组比较(χ2检验)，P<0.05
Fig.5 Effect of PKC activity on the proportion of various feet.PDBu: 1μmol/L;
PMB:10μmol/L. Incubation time:0.5, 2 and24h. n:the number of the examined
feet. * P<0.05, compared with the controlincubated for the same time.
, 百拇医药
结 果
1.固定方法对三联体及足形态的影响
两种固定方法对三联体的超微结构没有产生明显的差别。与GF固定的结果比较(图
3B)，SF固定法可使脂质双层膜更清晰(图3A)。在立即固定的肌纤维中，横小管通常呈
扁圆形或哑铃形。在其管腔内有时可见Dulhunty[3]所描述的宽度为10nm横跨管腔的索
(tether)(图3A)。肌浆网膜略有皱缩，有时形成突起(图3A)。突起部分的肌浆网膜有时
不完整，其原因尚不清楚。肌浆网腔内颗粒常呈团块分布(图3B)。
, 百拇医药 图3还显示了柱等几类足。在用两种不同方法固定的肌纤维中，5类足都能见到，各
类足所占比例略有差别。与GF组相比，SF组的空心柱和桥有所减少，而其他3类足稍有
增加，但是经χ2检验，两组间的差别无显著意义(P>0.05)(图4)。此外，固定方法对足
的数量也没有明显的影响。
2.PKC活性对三联体及足形态的影响
图3C、D示PDBu作用0.5和2h的三联体形态。由图可见肌浆网膜变得平滑，突起消
失。肌浆网腔变大，颗粒分散分布乃至消失。但是，这些形态变化在正常Ringer液中
, 百拇医药
浸浴相同时间的样品中也能见到。因此，本工作未见PDBu或PDBu+PMB本身对横小管
和肌浆网形态有明显的影响。有趣的是，无论是对照组还是实验组，在溶液中浸浴本
身会使单位面积肌纤维的横小管膜周长增加。例如，在Ringer液中浸浴0.5h、2h和24h，单位面积肌纤维横小管膜周长分别为立即固定组的1.8、2.7和1.6倍(附表)。此外还可看
到，PDBu作用0.5h后，含完整索结构的三联体所占比例由对照的30%增加到60%(未示)。
附表 浸浴对横小管膜周长的影响
Table Effect ofincubation on perimeter of T-tubule membrane
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浸浴时间(小时)incubation time(h)
0
0.5
2
24
单位肌纤维面积的横小管膜周长(μm-1)
perimeter of T-tubule membrane in unit area of muscle fibre (μm-1)
0.11
0.19
0.27
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0.17
图6 PKC活性对足数量的影响。用每μm横小管膜周长的足数表示。图中的柱表示从
7～24张照片中得到的足数量±s。PDBu.1μmol/L; PMB.10μmol/L。作用时间：
0.5h、2h和24h。**与孵育相同时间的对照组比较，P<0.01
Fig.6 Effect of PKC activity on the feet number. The feet numberis normalized for the perim-
eter of the transverse-tubule membrane.The column with bar represents ±s. measured
, 百拇医药
from 7-24 pictures. PDBu: 1μmol/L;PMB:10μmol/L. Incubation time: 0.5, 2 and 24h.
**P<0.01, compared with the controlincubated for the same time.
在PDBu或PDBu+PMB作用后，足形态仍可以分为5类。与孵育相同时间的对照组相
比，根据χ2检验仅以下3个实验组的各类足比例的变化有统计学意义(P<0.05)：0.5h
PDBu, 2h和24h PDBu+PMB(图5)。从图5可知，0.5h PDBu组的主要变化是，空心柱的比
例减少，柱的比例增加。如果比较处理相同时间的PDBu组和PDBu+PMB组，可知两组
, 百拇医药
在0.5h和2h时的差别均无统计学意义，仅24h时两组的差别有显著性(P<0.05)。PKC活
性对足数量的影响示于图6。由图6可见，与对照组相比，除24h PDBu+PMB组足数量有
明显减少外(P<0.01)，其他各组均无显著变化。这里需要指出的是，在Ringer液中浸浴
本身也会明显减少足数量。立即固定组的足数量为29.4±6.0/μm横小管膜周长(±s,n=
8)。由示于图6的对照组数据可知，在Ringer液中浸浴0.5h～24h后，足数量几乎降低到
直接固定组的一半。
讨 论
在文献中，电镜所见三联体足结构已有不少描述。Somlyo[9]用鞣酸固定肌纤维曾见
, 百拇医药
到桥这种形态，并认为桥是连接胞浆侧横小管膜和胞浆侧肌浆网膜的膜结构。Eisenberg
等[1]根据高钾刺激引起空心柱增加而咖啡因无此作用的结果认为，空心柱是在兴奋收缩
耦联中装配起来的一种结构。Dulhunty[3]则提出，柱、空心柱和桥是跨越三联体间隙的
同一种结构的不同表现形式。在本工作中，我们发现足的形态不止上述3种，而可以分
为5类。近年来运用三维重组等技术，已得到分离的Ryanodine受体结构的较详尽的资
料[10]。Ryanodine受体形状似蘑菇，蘑菇的伞面为该受体的胞浆部(26nm2，7nm高)，蘑
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菇的柄则为跨膜部(7nm2，5nm高)。胞浆部结构松散，中央有低密度筒状区；此外，还
存在两两对称的4个外周孔。因此，足在透射电镜下所呈现的不同形态可能与Ryanodine
受体胞浆部结构松散有关，因为松散的结构易受外界因素、包括固定剂的影响。在本工
作中，SF固定时空心柱比例下降，可能与SF固定剂中的颗粒沉淀，使空心柱中心低密
度区消失有关。
我们的结果表明，在Ringer液中浸浴会明显减少单位横小管膜周长的足数量。造成
足数量降低的原因不外乎是横小管膜周长增加和/或足绝对数量减少。经过计算，单位
, 百拇医药
面积肌纤维的足数除2h组略有增加外，其余时间组基本不变。因此，浸浴使足数减少主
要是由于横小管膜周长增加所引起的。但是，横小管膜周长增加的原因目前尚不清楚。
图5的结果表明，0.5h PDBu会改变各类足的比例。并且PDBu的这一作用能被PMB
所颉颃。但是在2h和24h两个时间点，PDBu对各类足的比例都没有影响。更没有预料到
的是，PDBu+PMB的作用反而有显著意义。PKC的活力测定表明，在PDBu作用0.5h内，PKC被显著激活，在12h后出现下调。PDBu对PKC的上述作用能被PMB部分颉颃(待发
表)。因此，上述各类足比例的变化可能与PKC活性变化无关。在PDBu作用下，无论是
, 百拇医药
横小管和肌浆网形态，还是足的数量，也都未见到与兴奋收缩去耦联有关的结构变化。
因此，如果过去观察到的PKC激动剂PDBu引起的兴奋收缩去耦联[6]是由肌纤维结构变
化引起的，则这一结构变化不在三联体，或不能用常规透射电镜所显示。
收稿1997-01 修回 1997-05
本文图3见下图
* 国家自然科学基金资助课题(No.39670242)和博士后基金资助课题
图 版 说 明
图3蛙骨骼肌纤维电镜照片，A.含苦味酸的多聚甲醛固定液(SF)固定。除了几类足外，还示横小管管腔中的索(↑)以及肌浆网膜的突起(▲)；B.常规戊二醛固定液(GF)固
, 百拇医药
定，示几类足；C.和D.用1μmol/L PDBu分别作用0.5h(C).和2h(D).后，常规戊二醛
固定液固定。足仍可见，但是肌浆网膜变得平滑，肌浆网腔增大。标尺示1μm
▲.柱；△.空心柱；|.线；↑.桥
Explanationof figures
Fig.3 Electronmicrograph of frog skeletal muscle fibres. A: Fixation withparaformaldehyde
fixative containing picric acid. Showingtethers in the lumen of a transverse tubule (↑)
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and a small projection from thesarcoplasmic reticulum(▲), besides some types of the
feet. B:Fixation with conventionalglutaraldehyde fixative. Showing some types of the
feet. After treatment with 1μmol/LPDBu for 0.5h C and 2h D, fixation with conventional
glutaraldehyde fixative. The feet stillexisted, but there were some changes in the
sarcoplasmic reticulum:smoother membraneand expanded lumen. Bar=1μm
, 百拇医药
▲:column; △:pillar; |:line; ↑:bridge
参 考 文 献
[1] Eisenberg BR,Eisenberg RS. The T-SR junction in contracting single skeletalmuscle
fibers.J Gen Physiol, 1982, 79(1):1
[2] Franzini-Armstrong C, Nunzi G. Junctional feet and particlesin the triads of a fast-twitch
muscle fibre.J Muscle Res Cell Motil,1983, 4(2):233
, 百拇医药
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possible relationship to calcium buffersin terminal cisternae and T-tubules and to
excitation-contraction coupling. J MembrBiol, 1989, 109(1):73
[4] Block BA, Imagawa T, Campbell KP, et al. Structural evidencefor direct interaction
between the molecular components of thetransverse tubule/sarcoplasmic reticulum
, 百拇医药
junction in skeletal muscle.J Cell Biol,1988, 107(6):2587
[5] Wagenknecht T, Grassucci R, Frank J, et al. Three-dimentionalarchitecture of the calcium
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coupling in frog twitch muscle fibres. EurJ Physiol,1994,428(3-4):224
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[7] Mayrleitner M, Chandler R, Schindler H, et al.Phosphorylation with protein kinases
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fixative for correlated light and electronmicroscopic immunocytochemistry.Neuroscience,1982,7(7):1779
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ryanodine receptor. FEBS Letter, 1995,369(1):43
EFFECTSOF FIXATIVE AND PROTEIN KINASE C ACTIVITY
, 百拇医药 ON ULTRASTRUCTURE OF TRIAD OF FROG
SKELETAL MUSCLE FIBRES
WuGuangming, Zhu Peihong△(ShanghaiInstitute of Physiology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai)
The effects of fixative and protein kinaseC (PKC) activity on the ultrastructure of the triad
of frog skeletal muscle fibres, especially on the morphology andnumber of the junction feet,were investigated with transmission electron microscopy. It isshown that fixation with convent-
, http://www.100md.com
ional glutaraldehyde fixative or paraformaldehyde fixativecontaining picric acid produced no
difference in the triad ultrastructure. Using these twofixatives, the feet could be categorized
morphologically into column, imperfect feet, pillar, bridge andatypical feet. In addition, there
was no variance in the proportion of the various feet and thefeet number.
, http://www.100md.com After the fibres were treated with PKCactivator or/and inhibitor for between 0.5 and 24h,no change was observed in the morphology of the transverse tubuleand sarcoplasmic reticulum.
Although some changes in the proportion of various feet wereseen, these changes are unrelated
to the known change of PKC activity.
It is suggested that the feet, as a partof ryanodine receptor/calcium release channel, may
, 百拇医药
be labile morphologically. Moreover, if phorbol 12,13-dibutyrate(PKC activator) induced
excitation-contraction uncoupling seen previously results fromsome morphological changes
of muscle fibres, these changes might not be located at the triador could not be revealed by
the method uesd in this study. KEY WORDS Ryanodinereceptor;Protein kinase C; Junction feet; Triad; Skeletal
, 百拇医药
muscle fibres;Frog
_______________________
△Shanghai Institute of Physiology, ChineseAcademy of Sciences, Shanghai 200031, China
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《解剖学报》编辑部
1997年1月, 百拇医药
单位：中国科学院上海生理研究所，上海 200031
关键词：Ryanodine受体；蛋白激酶C；接头足；三联体；骨骼肌纤维；蛙
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摘 要 用透射电镜研究了不同固定方法和蛋白激酶C(PKC)活性对蛙骨骼肌纤维三
联体超微结构，特别是对接头足(以下简称为足)形态和数量的影响。结果表明，常规戊
二醛固定和含苦味酸的多聚甲醛固定对三联体的超微结构无明显影响，足可以分为柱、不完整足、空心柱、桥和非典型足等5类，各类足的比例及数量也相似。肌纤维用PKC
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变化。但是，这些变化与已知的PKC活性变化无关。上述结果提示，作为Ryanodine受
体/钙释放通道蛋白分子一部分的足在形态上是一种多变的结构。如果过去观察到的
PKC激动剂引起的兴奋收缩去耦联是由肌纤维的结构变化引起的，则这一变化不在三联
体或不能用透射电镜显示。
骨骼肌纤维三联体由横小管和位于其两侧的肌浆网终池(胞内钙库)组成，它是肌纤
维兴奋收缩耦联的结构基础。对三联体的电镜研究表明，横小管膜和肌浆网膜之间有
12nm左右的间隙，其中存在接头足(junction foot，以下简称为足)的结构。但是，不同作
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上的Ryanodine受体(一种在调节胞浆自由钙离子浓度中起重要作用的钙释放通道)向间隙
突出的部分形成的[4～5]。
本工作主要目的是探讨作为Ryanodine受体一部分的足结构为什么呈现不同的形态?
为此，本实验研究了样品制备，主要是固定剂对足形态和数量的影响。此外，新近的
工作表明，12，13-二丁酸佛波酯(phorbol 12,13-dibutyrate, PDBu)作为蛋白激酶C(PKC)
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激动剂能引起蛙骨骼肌纤维兴奋收缩去耦联[6]。三联体中的多种蛋白，包括Ryanodine
受体可能是PKC的作用底物[7]。为了阐明PDBu的去耦联作用机制，我们还观察了改变
PKC活性对三联体，主要是对足形态的影响。
材料和方法
1.样品制备和观察
黑斑蛙(Rananigromaculata)毁髓后，取出两侧缝匠肌。肌肉在生理长度下，用下述
两种固定液作预固定。一种为4%戊二醛(pH7.2, 以0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液配制)，简
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称为GF；另一种为Somogyi和Takagi所报道的固定液[8]：其成分为0.2%苦味酸，4%多聚
甲醛，0.05%戊二醛，以pH7.2 0.2mol/L磷酸缓冲液配制，简称为SF。预固定均在4℃过
夜。预固定后，标本用Ringer液冲洗，修块。Ringer液组成为：120mmol/L NaCl,2mmol/L KCl, 1.8mmol/L CaCl2,4mmol/L HEPES。用NaOH调pH至7.2。然后在1%锇酸(以
0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液配制)中作后固定，(4℃，2h)。梯度丙酮脱水，其中除在含
饱和醋酸铀的70%丙酮中浸泡过夜外，其他各步均为10min。Epon 812浸透并包埋。用
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超薄切片机做纵切片，厚30～70nm，切片经4%醋酸铀和4.8%枸橼酸铅分别浸染10min
和5min，用Opton902透射电镜观察。
为研究PKC活性的作用，肌肉分为10组。其中4组为对照组，1组为取出后立即固
定，另外3组分别在正常Ringer液中15℃通氧孵育0.5h、2h和24h。其他6组为实验组，分
别在含1μmol/LPDBu Ringer液，以及同时含10μmol/L 多粘菌素B(polymyxin B, PMB;
蛋白激酶抑制剂)和1μmol/L PDBu Ringer液中孵育0.5h、2h和24h。经上述处理后的标
本，均用4%戍二醛固定，以后各步同前。
, 百拇医药
2. 图像选取
在电镜观察时，选用厚为50nm的切片。为了随机选取图像，参照Eisenberg等的定
点取样法[1]，如图1所示。即在100目铜网中，每目选定以下9个点：4个角，4条边的中
点，以及目的中心。拍摄三联体脂质双层膜清晰，不歪斜，无铅污染的图像，电镜放
大倍数为12 000倍。
3.形态测量
形态测量在光学放大4倍的照片上进行。足的形态在文献中已有描述，多把足分为
2～4类[1～3]。在反复观察的基础上，并结合文献描述，本工作把足分为以下5类：柱
, 百拇医药
(column)、不完整足(imperfect feet)、空心柱(pillar)、桥(bridge)、以及非典型足(atypical
feet)。图2为各类足的模式图。其中柱最为常见，其宽度约为30nm。不完整足又分为部
分足(partial feet)和线(line)两种，它们的宽度均与柱相当，只是前者不与横小管膜接触，而后者与肌浆网膜和横小管膜都不接触。空心柱的宽度也与柱相当，但其中心存在低密
度区。桥与空心柱相似，所不同的是前者宽度只有后者的一半。不能归入上述各类形态
的足，统称为非典型足。为了确切鉴别足的形态，仅选取横小管呈完全正切的三联体，其横小管脂质双层膜不仅清晰，而且宽度均匀一致。
(图1) , 百拇医药
图1 定点取样示意图
Fig.1 Schematicdiagram of points sampling.
图2 骨骼肌纤维三联体及各类足的模式图
Fig.2 Schematicdiagram of the triad and various types ofjunctional feet inskeletal
muscle fibres.
用上述常规电镜技术，对足形态的确认仍有一定的困难。在经过反复多次辨认后，可以达到每次所得到的各类形态足的比例结果差别不大。为减少误差，每张照片上足
的辩认一般要进行两次，两次时间间隔至少两个月，各类足比例的结果为两次观察的
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平均。然后，根据Eisenberg等的方法[1]测定足的数量。在这一方法中，先计算每张照
片上正切三联体的足数，从而计算出总的足数；再测定每张照片上横小管膜周长，最
后得到每μm横小管膜周长的足数。
各实验组统计的照片数7～30张不等，每张照片一般含有3个三联体，每个三联体
多呈现4个足。足形态构成，采用χ2检验进行数理统计。在统计PKC活性影响的结果
时，非典型足的理论数不够大，故未列入统计。足数量的比较，采用Student t检验。
, http://www.100md.com 图4 固定方法对各类足比例的影响。GF.常规戊二醛固定液SF.含苦味酸多聚甲醛固定
液。χ2检验，两组间无差别(P>0.05)。n.检测的足数
Fig.4 Effect offixation method on the proportion of various feet.GF:conventional glutarald-
ehyde fixative; SF:Paraformaldehydefixative containing picricacid. χ2 test, no
difference between two groups (P>0.05).N:the number of the examined feet.
, 百拇医药
图5 PKC活性对各类足比例的影响。PDBu.1μmol/L; PMB.10μmol/L。作用时间：
0.5h、2h和24hn:检测的足数。*与孵育相同时间的对照组比较(χ2检验)，P<0.05
Fig.5 Effect of PKC activity on the proportion of various feet.PDBu: 1μmol/L;
PMB:10μmol/L. Incubation time:0.5, 2 and24h. n:the number of the examined
feet. * P<0.05, compared with the controlincubated for the same time.
, 百拇医药
结 果
1.固定方法对三联体及足形态的影响
两种固定方法对三联体的超微结构没有产生明显的差别。与GF固定的结果比较(图
3B)，SF固定法可使脂质双层膜更清晰(图3A)。在立即固定的肌纤维中，横小管通常呈
扁圆形或哑铃形。在其管腔内有时可见Dulhunty[3]所描述的宽度为10nm横跨管腔的索
(tether)(图3A)。肌浆网膜略有皱缩，有时形成突起(图3A)。突起部分的肌浆网膜有时
不完整，其原因尚不清楚。肌浆网腔内颗粒常呈团块分布(图3B)。
, 百拇医药 图3还显示了柱等几类足。在用两种不同方法固定的肌纤维中，5类足都能见到，各
类足所占比例略有差别。与GF组相比，SF组的空心柱和桥有所减少，而其他3类足稍有
增加，但是经χ2检验，两组间的差别无显著意义(P>0.05)(图4)。此外，固定方法对足
的数量也没有明显的影响。
2.PKC活性对三联体及足形态的影响
图3C、D示PDBu作用0.5和2h的三联体形态。由图可见肌浆网膜变得平滑，突起消
失。肌浆网腔变大，颗粒分散分布乃至消失。但是，这些形态变化在正常Ringer液中
, 百拇医药
浸浴相同时间的样品中也能见到。因此，本工作未见PDBu或PDBu+PMB本身对横小管
和肌浆网形态有明显的影响。有趣的是，无论是对照组还是实验组，在溶液中浸浴本
身会使单位面积肌纤维的横小管膜周长增加。例如，在Ringer液中浸浴0.5h、2h和24h，单位面积肌纤维横小管膜周长分别为立即固定组的1.8、2.7和1.6倍(附表)。此外还可看
到，PDBu作用0.5h后，含完整索结构的三联体所占比例由对照的30%增加到60%(未示)。
附表 浸浴对横小管膜周长的影响
Table Effect ofincubation on perimeter of T-tubule membrane
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浸浴时间(小时)incubation time(h)
0
0.5
2
24
单位肌纤维面积的横小管膜周长(μm-1)
perimeter of T-tubule membrane in unit area of muscle fibre (μm-1)
0.11
0.19
0.27
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0.17
图6 PKC活性对足数量的影响。用每μm横小管膜周长的足数表示。图中的柱表示从
7～24张照片中得到的足数量±s。PDBu.1μmol/L; PMB.10μmol/L。作用时间：
0.5h、2h和24h。**与孵育相同时间的对照组比较，P<0.01
Fig.6 Effect of PKC activity on the feet number. The feet numberis normalized for the perim-
eter of the transverse-tubule membrane.The column with bar represents ±s. measured
, 百拇医药
from 7-24 pictures. PDBu: 1μmol/L;PMB:10μmol/L. Incubation time: 0.5, 2 and 24h.
**P<0.01, compared with the controlincubated for the same time.
在PDBu或PDBu+PMB作用后，足形态仍可以分为5类。与孵育相同时间的对照组相
比，根据χ2检验仅以下3个实验组的各类足比例的变化有统计学意义(P<0.05)：0.5h
PDBu, 2h和24h PDBu+PMB(图5)。从图5可知，0.5h PDBu组的主要变化是，空心柱的比
例减少，柱的比例增加。如果比较处理相同时间的PDBu组和PDBu+PMB组，可知两组
, 百拇医药
在0.5h和2h时的差别均无统计学意义，仅24h时两组的差别有显著性(P<0.05)。PKC活
性对足数量的影响示于图6。由图6可见，与对照组相比，除24h PDBu+PMB组足数量有
明显减少外(P<0.01)，其他各组均无显著变化。这里需要指出的是，在Ringer液中浸浴
本身也会明显减少足数量。立即固定组的足数量为29.4±6.0/μm横小管膜周长(±s,n=
8)。由示于图6的对照组数据可知，在Ringer液中浸浴0.5h～24h后，足数量几乎降低到
直接固定组的一半。
讨 论
在文献中，电镜所见三联体足结构已有不少描述。Somlyo[9]用鞣酸固定肌纤维曾见
, 百拇医药
到桥这种形态，并认为桥是连接胞浆侧横小管膜和胞浆侧肌浆网膜的膜结构。Eisenberg
等[1]根据高钾刺激引起空心柱增加而咖啡因无此作用的结果认为，空心柱是在兴奋收缩
耦联中装配起来的一种结构。Dulhunty[3]则提出，柱、空心柱和桥是跨越三联体间隙的
同一种结构的不同表现形式。在本工作中，我们发现足的形态不止上述3种，而可以分
为5类。近年来运用三维重组等技术，已得到分离的Ryanodine受体结构的较详尽的资
料[10]。Ryanodine受体形状似蘑菇，蘑菇的伞面为该受体的胞浆部(26nm2，7nm高)，蘑
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菇的柄则为跨膜部(7nm2，5nm高)。胞浆部结构松散，中央有低密度筒状区；此外，还
存在两两对称的4个外周孔。因此，足在透射电镜下所呈现的不同形态可能与Ryanodine
受体胞浆部结构松散有关，因为松散的结构易受外界因素、包括固定剂的影响。在本工
作中，SF固定时空心柱比例下降，可能与SF固定剂中的颗粒沉淀，使空心柱中心低密
度区消失有关。
我们的结果表明，在Ringer液中浸浴会明显减少单位横小管膜周长的足数量。造成
足数量降低的原因不外乎是横小管膜周长增加和/或足绝对数量减少。经过计算，单位
, 百拇医药
面积肌纤维的足数除2h组略有增加外，其余时间组基本不变。因此，浸浴使足数减少主
要是由于横小管膜周长增加所引起的。但是，横小管膜周长增加的原因目前尚不清楚。
图5的结果表明，0.5h PDBu会改变各类足的比例。并且PDBu的这一作用能被PMB
所颉颃。但是在2h和24h两个时间点，PDBu对各类足的比例都没有影响。更没有预料到
的是，PDBu+PMB的作用反而有显著意义。PKC的活力测定表明，在PDBu作用0.5h内，PKC被显著激活，在12h后出现下调。PDBu对PKC的上述作用能被PMB部分颉颃(待发
表)。因此，上述各类足比例的变化可能与PKC活性变化无关。在PDBu作用下，无论是
, 百拇医药
横小管和肌浆网形态，还是足的数量，也都未见到与兴奋收缩去耦联有关的结构变化。
因此，如果过去观察到的PKC激动剂PDBu引起的兴奋收缩去耦联[6]是由肌纤维结构变
化引起的，则这一结构变化不在三联体，或不能用常规透射电镜所显示。
收稿1997-01 修回 1997-05
本文图3见下图
* 国家自然科学基金资助课题(No.39670242)和博士后基金资助课题
图 版 说 明
图3蛙骨骼肌纤维电镜照片，A.含苦味酸的多聚甲醛固定液(SF)固定。除了几类足外，还示横小管管腔中的索(↑)以及肌浆网膜的突起(▲)；B.常规戊二醛固定液(GF)固
, 百拇医药
定，示几类足；C.和D.用1μmol/L PDBu分别作用0.5h(C).和2h(D).后，常规戊二醛
固定液固定。足仍可见，但是肌浆网膜变得平滑，肌浆网腔增大。标尺示1μm
▲.柱；△.空心柱；|.线；↑.桥
Explanationof figures
Fig.3 Electronmicrograph of frog skeletal muscle fibres. A: Fixation withparaformaldehyde
fixative containing picric acid. Showingtethers in the lumen of a transverse tubule (↑)
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and a small projection from thesarcoplasmic reticulum(▲), besides some types of the
feet. B:Fixation with conventionalglutaraldehyde fixative. Showing some types of the
feet. After treatment with 1μmol/LPDBu for 0.5h C and 2h D, fixation with conventional
glutaraldehyde fixative. The feet stillexisted, but there were some changes in the
sarcoplasmic reticulum:smoother membraneand expanded lumen. Bar=1μm
, 百拇医药
▲:column; △:pillar; |:line; ↑:bridge
参 考 文 献
[1] Eisenberg BR,Eisenberg RS. The T-SR junction in contracting single skeletalmuscle
fibers.J Gen Physiol, 1982, 79(1):1
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possible relationship to calcium buffersin terminal cisternae and T-tubules and to
excitation-contraction coupling. J MembrBiol, 1989, 109(1):73
[4] Block BA, Imagawa T, Campbell KP, et al. Structural evidencefor direct interaction
between the molecular components of thetransverse tubule/sarcoplasmic reticulum
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junction in skeletal muscle.J Cell Biol,1988, 107(6):2587
[5] Wagenknecht T, Grassucci R, Frank J, et al. Three-dimentionalarchitecture of the calcium
channel/foot structure of sarcoplasmicreticulum. Nature, 1989, 338(6211):167
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coupling in frog twitch muscle fibres. EurJ Physiol,1994,428(3-4):224
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[7] Mayrleitner M, Chandler R, Schindler H, et al.Phosphorylation with protein kinases
modulates calcium loading of terminalcisternae of sarcoplasmic reticulum from skeletal
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fixative for correlated light and electronmicroscopic immunocytochemistry.Neuroscience,1982,7(7):1779
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J Cell Biol,1979, 80(3):743
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ryanodine receptor. FEBS Letter, 1995,369(1):43
EFFECTSOF FIXATIVE AND PROTEIN KINASE C ACTIVITY
, 百拇医药 ON ULTRASTRUCTURE OF TRIAD OF FROG
SKELETAL MUSCLE FIBRES
WuGuangming, Zhu Peihong△(ShanghaiInstitute of Physiology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai)
The effects of fixative and protein kinaseC (PKC) activity on the ultrastructure of the triad
of frog skeletal muscle fibres, especially on the morphology andnumber of the junction feet,were investigated with transmission electron microscopy. It isshown that fixation with convent-
, http://www.100md.com
ional glutaraldehyde fixative or paraformaldehyde fixativecontaining picric acid produced no
difference in the triad ultrastructure. Using these twofixatives, the feet could be categorized
morphologically into column, imperfect feet, pillar, bridge andatypical feet. In addition, there
was no variance in the proportion of the various feet and thefeet number.
, http://www.100md.com After the fibres were treated with PKCactivator or/and inhibitor for between 0.5 and 24h,no change was observed in the morphology of the transverse tubuleand sarcoplasmic reticulum.
Although some changes in the proportion of various feet wereseen, these changes are unrelated
to the known change of PKC activity.
It is suggested that the feet, as a partof ryanodine receptor/calcium release channel, may
, 百拇医药
be labile morphologically. Moreover, if phorbol 12,13-dibutyrate(PKC activator) induced
excitation-contraction uncoupling seen previously results fromsome morphological changes
of muscle fibres, these changes might not be located at the triador could not be revealed by
the method uesd in this study. KEY WORDS Ryanodinereceptor;Protein kinase C; Junction feet; Triad; Skeletal
, 百拇医药
muscle fibres;Frog
_______________________
△Shanghai Institute of Physiology, ChineseAcademy of Sciences, Shanghai 200031, China
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1997年1月, 百拇医药