鼻咽癌中与已知基因同源的差异表达cDNA序列①
作者：湛凤凰 曹 利 胡成平 李桂源②
单位：肿瘤研究所 长沙 410078
关键词：鼻咽肿瘤；癌；cDNA代表性差异分析法*；抑瘤基因
湖南医科大学学报990203 提 要 采用新近发展的cDNA代表性差异分析法筛选鼻咽癌中不表达的或表达降低的cDNA序列。结果显示：有9个与已知基因高度同源的cDNA序列。通过对这些已知基因的结构和功能分析，发现有与细胞骨架成分相关的基因：α-actinin,ezrin和细胞角蛋白13；直接与瘤基因和抑瘤基因相互作用的基因：鲨烯合成酶和TRIP-1基因；直接参与DNA合成以及调控基因转录和翻译的基因：TAFⅡ68和组蛋白H10；另外还有人类补体因子B及类转运RNA合成酶的基因。这些基因大多具有相当于抑瘤基因的功能。从而进一步说明鼻咽癌的发生是多基因相互作用的结果。
, 百拇医药
Differentially expressed cDNA sequences homologous with known genesin human nasopharyngeal carcinoma
Zhan Fenghuang Cao Li Hu Chengping Li Guiyuan
(Cancer Research Institute, Hunan Medical University, Changsha 410078)
In order to search the tumor suppressor genes correlated with pathogenesis of human nasopharyngeal carcinoma(NPC), we applied the PCR-based subtractive hybridization technique of representational difference analysis(RDA) to the primary culture cells of normal human nasopharyngeal epithelial and HNE1, a poorly differentiated NPC cell line. Following four successive subtractions of HNE1 complementary DNA from normal human nasopharyngeal epithelial cells complementary DNA, difference products were cloned into pGEM-T easy vector and nucleotide sequences determined. Comparison of cDNA sequences against the databases indentified 9 known genes. Known genes included TRIP1(TGF β recepor interracting protein), TAF, ezrin, MHCⅡ, actinin, Histone H10, Cytokeratin 13, Squalene Synthetase and RNA Synthetase-like. Some of them have an effective suppressive ability on the tumor. In this study, we have demonstrated that cDNA RDA is an effective strategy for systematically isolating differences in gene expression between two related but functionally distinct cells. Our results also indicated that the NPC includes interaction of multigenes and this experiment offers a new route for NPC research.
, 百拇医药
Key words nasopharyngeal neoplasm; carcinoma; cDNA representational difference analysis*; tumor suppressor gene
鼻咽癌是我国南方一种常见的恶性肿瘤，但其病因尚未阐明。细胞遗传学表明，在染色体的3p,7q以及6p等部位的一些位点存在高频率的杂合性缺失。因此，本研究采用克隆基因方法——cDNA代表性差异分析法(cDNA RDA)[1]，寻找与鼻咽癌相关的抑瘤基因；探讨其在鼻咽癌中发生发展的可能作用，有助于从分子水平揭示鼻咽癌发病的分子机制。
1 材料与方法1.1 材料 低分化鳞状上皮鼻咽癌细胞系HNE1为本所建株。原代培养人胚鼻咽上皮10例，去除淋巴细胞和纤维组织，呈单一的上皮细胞形态。
1.2 方法
, http://www.100md.com
1.2.1 cDNA的合成 原代培养的人胚鼻咽上皮细胞及HNE1细胞，用TRIzolTM试剂盒(GIBCO BRL)抽提总RNA；采用磁性球珠PolyAT tractR mRNA纯化系统(Promega)，分离Poly A+RNA。按GIBRO BRL cDNA合成系统的步骤，分别合成cDNA第一、二链。
1.2.2 特定接头引物的合成及cDNA RDA 参照参考文献[2]。
1.2.3 克隆和测序 选择pGEM-T Easy载体，分别将回收的第四轮产物即四个片段进行连接。反应体系如下：T4 DNA连接缓冲液(10X)1.2μl，pGEM T-easy载体1μl(50ng)，PCR产物9μl(与载体比例为3∶1)，T4DNA连接酶1μl(400U New England)，混匀后14℃过夜，取6μl连接反应物于50μl感受态细胞中，冰上20min，42℃ 60s，冰上2min，加入900μl无氨苄青霉素LB培养，37℃震摇90min，短暂离心，弃上清800μl，将细菌轻轻混匀，涂于10cm含有100μg*ml-1氨苄青霉素的LB琼脂培养皿上(预先涂有IPTG 100μl及x-Gal 20μl)，37℃过夜。
, 百拇医药
每个平皿挑取白色菌落，分别加入Amp+的LB培基中，37℃震摇过夜，采用碱裂解法抽提质粒DNA，选择EcoR I酶切及PCR扩增鉴定阳性克隆。质粒经PEG纯化后用全自动测序仪377型(美国PE公司)测序，并用BLASTN等程序在基因库中进行匹配分析。
2 结果
2.1 cDNA RDA差异性产物 经过四轮杂交及扩增后，在第四轮差异性产物中，可见到4条明显的差异性条带，将这些条带回收进行连接及测序反应；同时也将其制备探针，分别进行Northern和Southern杂交。Southern杂交结果显示差异性片段在驱赶扩增子中无杂交信号，在检测扩增子及第一轮到第四轮差异性产物中均有杂交信号；Northern杂交结果表明回收的cDNA片段在鼻咽癌细胞株不表达或表达下调(参照参考文献[2])。
2.2 与已知基因同源的cDNA序及其匹配分析 将PCR和EcoR I酶切双重鉴定为阳性重组克隆的质粒扩增，纯化后自动测序，共得到20个不同的cDNA序列列。其中9个序列与已知基因同源，11个序列未找到同源基因，为新基因序列。9个与已知基因同源的cDNA序列匹配情况见附表。
, 百拇医药
附表 鼻咽癌中与已知基因同源的表达下调的cDNA序列匹配分析 克隆号
Sau3A1酶切
片段大小(bp)
基因库的
匹配号
同源部位
(bp)
同源度①
(%)
同源基因名称
LZ1
207
, http://www.100md.com
emb
HSU51334
1589-1796
99
TATA盒结合蛋白相关因子(TAF)Ⅱ68
LZ2
156
emb
X03473
1659-1815
98
人类组蛋白H10
, http://www.100md.com
LZ3
125
emb
X52429
880-1005
98
细胞角蛋白13
LZ4
189
emb
X51521
1786-1975
97
, http://www.100md.com
ezrin
LZ5
101
gb
K01566
489-580
99
转移生长因子β受体相互作用蛋白(TRIP1)
LZ6
198
gb
01566
1476-1674
, http://www.100md.com
97
组织相容性抗原Ⅱ(MHCⅡ)
LZ7
248
emb
X15804
786-1034
98
α-actinin
LZ8
161
gb
L06070
, 百拇医药
1092-1253
99
人类鲨烯合成酶
LZ9
191
gb
U07424
1147-1338
97
类tRNA合成酶
①同源度指匹配序列与同源基因相同碱基百分比
3 讨论
, 百拇医药
采用cDNA RDA获得的在鼻咽癌中不表达或表达降低的已知基因中，从结构和功能上分为：①与细胞骨架成分相关的基因：α-actinin、ezrin和细胞角蛋白13；②直接与瘤基因和抑瘤基因相互作用的基因：鲨烯合成酶(squalence synthetase)和TRIP-1基因；③直接参与DNA合成及调控基因转录和翻译的基因：TAFⅡ68以及组蛋白H10基因；④其它：人类补体因子B基因和类转运RNA合成酶基因。
α-actinin是一种丰富的交叉连接肌动蛋白的细胞骨架蛋白。其氨基酸序列由位于氨基端的肌动蛋白结合结构域、维持α-actinin同聚体反向平行的中间重复区以及包含2个钙离子结合结构域的羧基端组成[3]。在非肌细胞中，α-actinin结合肌动蛋白是钙敏感的，而肌细胞是钙不敏感的。在维持细胞形态、参与细胞粘附和迁移以及在细胞增殖和分化的信号转导过程中发挥调节功能。由于该基因能有效地抑制肿瘤细胞的表型转换、迁移和转移，其功能缺失相当于抑瘤基因的功能丧失。ezrin为另一个与细胞骨架相关的基因，位于6q25，广泛分布在包含肌动蛋白的细胞微绒毛与微皱襞中，通过氨基端与细胞膜相连，羧基端与细胞骨架相连成为膜-细胞骨架的连接子。该基因作为一些蛋白激酶的作用底物，在跨膜信号中，发挥调节信号转导和调节细胞对信号的反应功能[4]。由于ezrin蛋白与整合素(interin)、钙粘蛋白(carderin)、MARCKS(一种依赖钙离子的丝氨酸、苏氨酸作用底物)等结合调节肌动蛋白-细胞膜对细胞与细胞之间，细胞与细胞外基质之间的相互作用。在正常细胞和肿瘤细胞中表现出对细胞形态、运动、肿瘤细胞转移方面与α-actinin相似的功能。另外，ezrin的基因序列与抑瘤基因NF2高度同源，推测NF2基因的信号转导通过ezrin发挥抑瘤功能。细胞角蛋白作为细胞骨架中间丝的成分，与维持细胞形态、运动等基本功能密切相关。细胞角蛋白13是一种分子量为51kDa的酸性蛋白质，分布于未角化复层鳞状上皮，如舌上皮、气管上皮等部位。目前，在肿瘤研究中，细胞角蛋白13的表达常作为判断肿瘤细胞分化程度、转移能力和预后的指标[5]。即分化程度越低，肿瘤转移能力越强；预后越差的肿瘤，表达越低。鼻咽癌的临床病理特点主要为早期转移以及低分化型为主，极有可能与上述三个与细胞骨架相关的基因不表达或表达下调相关。
, 百拇医药
鲨烯合成酶是真核生物中异戊二醇和甾体合成的关键酶，其表达水平受HMG-CoA还原酶的调节而与之呈平行关系。氨基酸序列显示其羧基端为一50kDa的跨膜蛋白。在Ras蛋白由其前体变成熟的过程中，鲨烯合成酶是其中的关键酶之一。该酶催化Ras前体蛋白与15个碳原子的结合形成成熟的Ras蛋白。目前，在肿瘤治疗中已有采用鲨烯合成酶的抑制剂来控制Ras成熟蛋白形成的方法[6]。在鼻咽癌细胞中，该基因的表达降低导致Ras成熟蛋白表达的降低。因此，在实验中观察到的表达增高的Ras蛋白可能并非成熟的Ras蛋白，其中的相互关系有待进一步澄清。TRIP-1是新近克隆的一个基因，已分离到1.3kb的mRNA序列，编码325个氨基酸，包含5个WD结构域[7]。该蛋白特异性的和转化生长因子βⅡ型受体结合，并发挥信号传导功能。因此，TRIP-1的不表达，必定引起抑瘤基因TGF-β受体的信号传导中断，而不能发挥有效的抑瘤功能。
我们筛选到的这些基因在鼻咽癌中表达降低，其机理尚不清楚。有意义的是，TAFⅡ68作为连接RNA聚合酶Ⅱ并结合到包含TATA盒的结合蛋白(TBP)上，也在鼻咽癌细胞中不表达。该因子在结构上与原瘤蛋白TLS/FUS和EWS具有广泛的序列同源性，能与RNA以及单链DNA结合，这些序列即为转录的起动子区。因此，该蛋白与其它TFⅡD因子一样，调节转录的起始发生[8]。H10基因属于另一个转录前调控的基因，与其它组蛋白H1共同构成核小体之间的连接子。该蛋白富含赖氨酸，包含三个结构域区，其球状结构区与H5同源[9]。该基因参与染色质的高级结构的形成以及发育基因的转录活性。在鼻咽癌中出现这两个基因不表达或表达下调，是否导致与之相关基因的作用异常，有待更深入的研究。
, 百拇医药
人类补体因子B基因在鼻咽癌中不表达，更证实了6p上存在与HLA紧密连锁的鼻咽癌抑瘤基因的研究，即该基因的不表达是由于存在该区的染色体缺失所致。因为该基因位于6p，其催化亚单位包含259个氨基酸，是三羧酸循环旁路途径上的关键激活因子，主要参与免疫反应。其在群体中有一定的分布特点，遗传传递完全符合单基因遗传传递律，常作为遗传的分子标志。出现不表达，只是鼻咽癌发生过程中的伴随事件，而非起动原因[10]。但是，其缺失可能是肿瘤细胞逃避免疫监视的一个重要原因。类转运RNA合成酶是一种新近才克隆的基因，它是一种细胞周期依赖性的蛋白质，其具体功能尚不清楚。该基因在髓性白血病中表达降低，而在鼻咽癌中表达也降低，原因还有待进一步分析。
从上述在鼻咽癌中表达下调基因的分析不难看出，鼻咽癌中存在多个基因的表达障碍，且与之相关的基因涉及到细胞功能的多个方面，从而说明鼻咽癌的发生是多基因协同作用的结果。这些同源的已知基因大都具有相当于抑瘤基因的功能，表明采用正常人作“检测子”，鼻咽癌细胞株作“驱赶子”来源的cDNA RDA方法，确实可获得候选的抑瘤基因。后续的工作将把这些初步确定的差异性表达基因分别标记并制备探针，在鼻咽癌活检组织和鼻咽癌细胞株中进一步明确其表达关系。通过对这些已知基因的进一步研究及对新基因序列的克隆，将可能在鼻咽癌抑瘤基因研究方面有所突破。
, 百拇医药
①国家高技术计划资助(102-1001-05)，湖南省科委资助项目(98-B5086)
②项目负责人
中国图书分类号 R739.63
参考文献
[1]Hubank M, Schatz DG. Identifying differences in mRNA expression by representational difference analysis of cDNA. Nucleic Acids Res, 1994,22(10):5640-5648
[2]湛凤凰，江宁，曹利，等.cDNA代表性差异分析法分离鼻咽癌中表达差异cDNA序列的初步研究.中华医学遗传学杂志，1998，15(6)：341-344
, http://www.100md.com
[3]Ben Ze'ev A. The use of two-dimensional gel electrophoresis in studies on the role of cytoskeletal plaque proteins as tumor suppressors. Electrophoresis, 1996,17(11):1715-1763
[4]Jiang WG, Hiscox S. Cytokine regulation of ezrin expression in the human colon cancer cell line HT2a. Anticancer Res, 1996,16(2):861-865
[5]Frank WW, Schiller DL, Moll R, et al. Diversity of cytokeratins: differentiation apecific expression of cytokerotin polypeptides in epithelial cells and tissues. J Mol Biol, 1981,153(4):933-959
, 百拇医药
[6]Gibbs JB, Pompliano DL, Mosser SD, et al. Selective inhibition of farnesyl-protein transferase blocks ras processing in vivo. J Biol Chem, 1993,268(11):7617-7620
[7]Chen RH, Mlettlnen PJ, Maruoka EM, et al. A WD-domain protein that is associated with and phospharylated by the type Ⅱ TGF-β receptor. Nature, 1995,377(6549):548-552
[8]Verrijzer CP, Tjian R. TAFs mediate transcriptional activation and promoter selectivity. Trends Biochem Sci, 1996,21(9):338-342
, 百拇医药
[9]Cheng G, Koultch AI. Rapid induction of polyadenylated H1 histone mRNA in mouse erythroleukemia cells is regulated by c-myc. Mol Cell Biol, 1989,9(6):2332-2340
[10]Lim M, Cham SH. C4 and 21-hydroxylase gene deletions in nasopharyngeal carcinoma among the Chinese. Ann Acad Med Singapore, 1996,25(1):42-44
收稿日期：1998-08-31, 百拇医药(湛凤凰 曹 利 胡成平 李桂源②)
单位：肿瘤研究所 长沙 410078
关键词：鼻咽肿瘤；癌；cDNA代表性差异分析法*；抑瘤基因
湖南医科大学学报990203 提 要 采用新近发展的cDNA代表性差异分析法筛选鼻咽癌中不表达的或表达降低的cDNA序列。结果显示：有9个与已知基因高度同源的cDNA序列。通过对这些已知基因的结构和功能分析，发现有与细胞骨架成分相关的基因：α-actinin,ezrin和细胞角蛋白13；直接与瘤基因和抑瘤基因相互作用的基因：鲨烯合成酶和TRIP-1基因；直接参与DNA合成以及调控基因转录和翻译的基因：TAFⅡ68和组蛋白H10；另外还有人类补体因子B及类转运RNA合成酶的基因。这些基因大多具有相当于抑瘤基因的功能。从而进一步说明鼻咽癌的发生是多基因相互作用的结果。
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Differentially expressed cDNA sequences homologous with known genesin human nasopharyngeal carcinoma
Zhan Fenghuang Cao Li Hu Chengping Li Guiyuan
(Cancer Research Institute, Hunan Medical University, Changsha 410078)
In order to search the tumor suppressor genes correlated with pathogenesis of human nasopharyngeal carcinoma(NPC), we applied the PCR-based subtractive hybridization technique of representational difference analysis(RDA) to the primary culture cells of normal human nasopharyngeal epithelial and HNE1, a poorly differentiated NPC cell line. Following four successive subtractions of HNE1 complementary DNA from normal human nasopharyngeal epithelial cells complementary DNA, difference products were cloned into pGEM-T easy vector and nucleotide sequences determined. Comparison of cDNA sequences against the databases indentified 9 known genes. Known genes included TRIP1(TGF β recepor interracting protein), TAF, ezrin, MHCⅡ, actinin, Histone H10, Cytokeratin 13, Squalene Synthetase and RNA Synthetase-like. Some of them have an effective suppressive ability on the tumor. In this study, we have demonstrated that cDNA RDA is an effective strategy for systematically isolating differences in gene expression between two related but functionally distinct cells. Our results also indicated that the NPC includes interaction of multigenes and this experiment offers a new route for NPC research.
, 百拇医药
Key words nasopharyngeal neoplasm; carcinoma; cDNA representational difference analysis*; tumor suppressor gene
鼻咽癌是我国南方一种常见的恶性肿瘤，但其病因尚未阐明。细胞遗传学表明，在染色体的3p,7q以及6p等部位的一些位点存在高频率的杂合性缺失。因此，本研究采用克隆基因方法——cDNA代表性差异分析法(cDNA RDA)[1]，寻找与鼻咽癌相关的抑瘤基因；探讨其在鼻咽癌中发生发展的可能作用，有助于从分子水平揭示鼻咽癌发病的分子机制。
1 材料与方法1.1 材料 低分化鳞状上皮鼻咽癌细胞系HNE1为本所建株。原代培养人胚鼻咽上皮10例，去除淋巴细胞和纤维组织，呈单一的上皮细胞形态。
1.2 方法
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1.2.1 cDNA的合成 原代培养的人胚鼻咽上皮细胞及HNE1细胞，用TRIzolTM试剂盒(GIBCO BRL)抽提总RNA；采用磁性球珠PolyAT tractR mRNA纯化系统(Promega)，分离Poly A+RNA。按GIBRO BRL cDNA合成系统的步骤，分别合成cDNA第一、二链。
1.2.2 特定接头引物的合成及cDNA RDA 参照参考文献[2]。
1.2.3 克隆和测序 选择pGEM-T Easy载体，分别将回收的第四轮产物即四个片段进行连接。反应体系如下：T4 DNA连接缓冲液(10X)1.2μl，pGEM T-easy载体1μl(50ng)，PCR产物9μl(与载体比例为3∶1)，T4DNA连接酶1μl(400U New England)，混匀后14℃过夜，取6μl连接反应物于50μl感受态细胞中，冰上20min，42℃ 60s，冰上2min，加入900μl无氨苄青霉素LB培养，37℃震摇90min，短暂离心，弃上清800μl，将细菌轻轻混匀，涂于10cm含有100μg*ml-1氨苄青霉素的LB琼脂培养皿上(预先涂有IPTG 100μl及x-Gal 20μl)，37℃过夜。
, 百拇医药
每个平皿挑取白色菌落，分别加入Amp+的LB培基中，37℃震摇过夜，采用碱裂解法抽提质粒DNA，选择EcoR I酶切及PCR扩增鉴定阳性克隆。质粒经PEG纯化后用全自动测序仪377型(美国PE公司)测序，并用BLASTN等程序在基因库中进行匹配分析。
2 结果
2.1 cDNA RDA差异性产物 经过四轮杂交及扩增后，在第四轮差异性产物中，可见到4条明显的差异性条带，将这些条带回收进行连接及测序反应；同时也将其制备探针，分别进行Northern和Southern杂交。Southern杂交结果显示差异性片段在驱赶扩增子中无杂交信号，在检测扩增子及第一轮到第四轮差异性产物中均有杂交信号；Northern杂交结果表明回收的cDNA片段在鼻咽癌细胞株不表达或表达下调(参照参考文献[2])。
2.2 与已知基因同源的cDNA序及其匹配分析 将PCR和EcoR I酶切双重鉴定为阳性重组克隆的质粒扩增，纯化后自动测序，共得到20个不同的cDNA序列列。其中9个序列与已知基因同源，11个序列未找到同源基因，为新基因序列。9个与已知基因同源的cDNA序列匹配情况见附表。
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附表 鼻咽癌中与已知基因同源的表达下调的cDNA序列匹配分析 克隆号
Sau3A1酶切
片段大小(bp)
基因库的
匹配号
同源部位
(bp)
同源度①
(%)
同源基因名称
LZ1
207
, http://www.100md.com
emb
HSU51334
1589-1796
99
TATA盒结合蛋白相关因子(TAF)Ⅱ68
LZ2
156
emb
X03473
1659-1815
98
人类组蛋白H10
, http://www.100md.com
LZ3
125
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98
细胞角蛋白13
LZ4
189
emb
X51521
1786-1975
97
, http://www.100md.com
ezrin
LZ5
101
gb
K01566
489-580
99
转移生长因子β受体相互作用蛋白(TRIP1)
LZ6
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1476-1674
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97
组织相容性抗原Ⅱ(MHCⅡ)
LZ7
248
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X15804
786-1034
98
α-actinin
LZ8
161
gb
L06070
, 百拇医药
1092-1253
99
人类鲨烯合成酶
LZ9
191
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U07424
1147-1338
97
类tRNA合成酶
①同源度指匹配序列与同源基因相同碱基百分比
3 讨论
, 百拇医药
采用cDNA RDA获得的在鼻咽癌中不表达或表达降低的已知基因中，从结构和功能上分为：①与细胞骨架成分相关的基因：α-actinin、ezrin和细胞角蛋白13；②直接与瘤基因和抑瘤基因相互作用的基因：鲨烯合成酶(squalence synthetase)和TRIP-1基因；③直接参与DNA合成及调控基因转录和翻译的基因：TAFⅡ68以及组蛋白H10基因；④其它：人类补体因子B基因和类转运RNA合成酶基因。
α-actinin是一种丰富的交叉连接肌动蛋白的细胞骨架蛋白。其氨基酸序列由位于氨基端的肌动蛋白结合结构域、维持α-actinin同聚体反向平行的中间重复区以及包含2个钙离子结合结构域的羧基端组成[3]。在非肌细胞中，α-actinin结合肌动蛋白是钙敏感的，而肌细胞是钙不敏感的。在维持细胞形态、参与细胞粘附和迁移以及在细胞增殖和分化的信号转导过程中发挥调节功能。由于该基因能有效地抑制肿瘤细胞的表型转换、迁移和转移，其功能缺失相当于抑瘤基因的功能丧失。ezrin为另一个与细胞骨架相关的基因，位于6q25，广泛分布在包含肌动蛋白的细胞微绒毛与微皱襞中，通过氨基端与细胞膜相连，羧基端与细胞骨架相连成为膜-细胞骨架的连接子。该基因作为一些蛋白激酶的作用底物，在跨膜信号中，发挥调节信号转导和调节细胞对信号的反应功能[4]。由于ezrin蛋白与整合素(interin)、钙粘蛋白(carderin)、MARCKS(一种依赖钙离子的丝氨酸、苏氨酸作用底物)等结合调节肌动蛋白-细胞膜对细胞与细胞之间，细胞与细胞外基质之间的相互作用。在正常细胞和肿瘤细胞中表现出对细胞形态、运动、肿瘤细胞转移方面与α-actinin相似的功能。另外，ezrin的基因序列与抑瘤基因NF2高度同源，推测NF2基因的信号转导通过ezrin发挥抑瘤功能。细胞角蛋白作为细胞骨架中间丝的成分，与维持细胞形态、运动等基本功能密切相关。细胞角蛋白13是一种分子量为51kDa的酸性蛋白质，分布于未角化复层鳞状上皮，如舌上皮、气管上皮等部位。目前，在肿瘤研究中，细胞角蛋白13的表达常作为判断肿瘤细胞分化程度、转移能力和预后的指标[5]。即分化程度越低，肿瘤转移能力越强；预后越差的肿瘤，表达越低。鼻咽癌的临床病理特点主要为早期转移以及低分化型为主，极有可能与上述三个与细胞骨架相关的基因不表达或表达下调相关。
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鲨烯合成酶是真核生物中异戊二醇和甾体合成的关键酶，其表达水平受HMG-CoA还原酶的调节而与之呈平行关系。氨基酸序列显示其羧基端为一50kDa的跨膜蛋白。在Ras蛋白由其前体变成熟的过程中，鲨烯合成酶是其中的关键酶之一。该酶催化Ras前体蛋白与15个碳原子的结合形成成熟的Ras蛋白。目前，在肿瘤治疗中已有采用鲨烯合成酶的抑制剂来控制Ras成熟蛋白形成的方法[6]。在鼻咽癌细胞中，该基因的表达降低导致Ras成熟蛋白表达的降低。因此，在实验中观察到的表达增高的Ras蛋白可能并非成熟的Ras蛋白，其中的相互关系有待进一步澄清。TRIP-1是新近克隆的一个基因，已分离到1.3kb的mRNA序列，编码325个氨基酸，包含5个WD结构域[7]。该蛋白特异性的和转化生长因子βⅡ型受体结合，并发挥信号传导功能。因此，TRIP-1的不表达，必定引起抑瘤基因TGF-β受体的信号传导中断，而不能发挥有效的抑瘤功能。
我们筛选到的这些基因在鼻咽癌中表达降低，其机理尚不清楚。有意义的是，TAFⅡ68作为连接RNA聚合酶Ⅱ并结合到包含TATA盒的结合蛋白(TBP)上，也在鼻咽癌细胞中不表达。该因子在结构上与原瘤蛋白TLS/FUS和EWS具有广泛的序列同源性，能与RNA以及单链DNA结合，这些序列即为转录的起动子区。因此，该蛋白与其它TFⅡD因子一样，调节转录的起始发生[8]。H10基因属于另一个转录前调控的基因，与其它组蛋白H1共同构成核小体之间的连接子。该蛋白富含赖氨酸，包含三个结构域区，其球状结构区与H5同源[9]。该基因参与染色质的高级结构的形成以及发育基因的转录活性。在鼻咽癌中出现这两个基因不表达或表达下调，是否导致与之相关基因的作用异常，有待更深入的研究。
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人类补体因子B基因在鼻咽癌中不表达，更证实了6p上存在与HLA紧密连锁的鼻咽癌抑瘤基因的研究，即该基因的不表达是由于存在该区的染色体缺失所致。因为该基因位于6p，其催化亚单位包含259个氨基酸，是三羧酸循环旁路途径上的关键激活因子，主要参与免疫反应。其在群体中有一定的分布特点，遗传传递完全符合单基因遗传传递律，常作为遗传的分子标志。出现不表达，只是鼻咽癌发生过程中的伴随事件，而非起动原因[10]。但是，其缺失可能是肿瘤细胞逃避免疫监视的一个重要原因。类转运RNA合成酶是一种新近才克隆的基因，它是一种细胞周期依赖性的蛋白质，其具体功能尚不清楚。该基因在髓性白血病中表达降低，而在鼻咽癌中表达也降低，原因还有待进一步分析。
从上述在鼻咽癌中表达下调基因的分析不难看出，鼻咽癌中存在多个基因的表达障碍，且与之相关的基因涉及到细胞功能的多个方面，从而说明鼻咽癌的发生是多基因协同作用的结果。这些同源的已知基因大都具有相当于抑瘤基因的功能，表明采用正常人作“检测子”，鼻咽癌细胞株作“驱赶子”来源的cDNA RDA方法，确实可获得候选的抑瘤基因。后续的工作将把这些初步确定的差异性表达基因分别标记并制备探针，在鼻咽癌活检组织和鼻咽癌细胞株中进一步明确其表达关系。通过对这些已知基因的进一步研究及对新基因序列的克隆，将可能在鼻咽癌抑瘤基因研究方面有所突破。
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①国家高技术计划资助(102-1001-05)，湖南省科委资助项目(98-B5086)
②项目负责人
中国图书分类号 R739.63
参考文献
[1]Hubank M, Schatz DG. Identifying differences in mRNA expression by representational difference analysis of cDNA. Nucleic Acids Res, 1994,22(10):5640-5648
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收稿日期：1998-08-31, 百拇医药(湛凤凰 曹 利 胡成平 李桂源②)