放射事故受照者血型糖蛋白A突变分析
作者：桂红星 程文英 史剑慧 顾乃谷 许小平 章卫平 刘本 傅宝华
单位：200032 上海医科大学放射医学研究所(桂红星、程文英、史剑慧、顾乃谷)；上海第二军医大学长海医院(许小平、章卫平、刘本)；河南省职业病防治所(傅宝华)
关键词：血型糖蛋白A(GPA)；单合子NO；纯合子NN；变异率Vf
中华放射医学与防护杂志/990421 【摘要】 目的 研究血型糖蛋白A(GPA, glycophorin A locus)突变分析用作新的辐射生物剂量计。方法 结合流式细胞分析和单克隆抗体标记技术，检测红细胞糖蛋白的变异。结果 随访全国10例放射源事故受照者，4人为MN杂合体，生物剂量在1.46～2.9 Gy，1人MN弱阳性。GPA NO变异率与剂量线性回归曲线有显著意义，曲线斜率41.53×10-6/Gy，而NN没有显著意义。结论 GPA变异率剂量效应曲线二次线性拟合比一次线性好。二次线性重建远期辐射剂量高于一次模型，用原爆、切尔诺贝利、戈亚尼亚事故参数回顾剂量多偏高。
, http://www.100md.com
Assay of glycophorin A locus mutation in radiation accident victims
GUI Hongxing, CHENG Wenying, SHI Jianhui, et al.
Shanghai Institute of Radiation Medicine, Shanghai 200032, China.
【Abstract】 Objective Application of glycophorin A locus mutation assay as a new biodosimeter. Methods Using flow cytometry and immunolabeling to detect erythrocytes with variant glycoproteins on the surface membrane. Results Among 10 victims of radiation accidents 4 persons were determined as having MN heterozygotes with estimated dose of 1.46—2.9 Gy, and one suspected of having MN. Hemizygote NO variant frequency showed significant dose-response linear regression with slope of 41.53×10-6/Gy, while NN showed no significant regression. Conclusion Dose-response data are more fitted to the linear-quadratic model than to the linear model. Dose reconstructed with the linear-quadratic model is higher than that estimated with the latter. And doses estimated with standard curve of Hiroshima and Chernoby1 are higher than those assessed by assay of dicentrics plus rings after the accidents.
, 百拇医药
【Key words】 Glycophorin A locus Hemizygote NO Homozygote NN Variant frequency
染色体畸变是检测放射损伤的传统方法，由于畸变不稳定、计数复杂，因而多用于急性放射事故的测定。近年来荧光原位杂交(FISH)、染色体早熟凝集反应(PCC)以及人类红细胞表面血型糖蛋白A(GPA)和次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)等被用作回顾性放射生物剂量计，方法虽多，但重建生物剂量仍缺乏实践与经验。
GPA是人类次要血型MN的血型抗原，两种类型M、N由共显性等位基因编码表达，人群中50%为杂合子MN。造血干细胞不同机制的基因突变，产生不同的变异细胞，如单合子NO、纯合子NN。GPA突变分析结合单克隆抗体标记和流式细胞技术，鉴别体内罕见的表型变异细胞，以反映体细胞突变水平。
GPA突变分析不同于染色体畸变等方法，其糖蛋白变异不影响红细胞寿命，位于干细胞的突变稳定终生不变，且方法简便快速，已用于原爆幸存者[1]、反应堆[2]及放射源事故[3]受照者的剂量回顾，本文作者随访了10例国内放射事故受照者，为GPA作为放射生物剂量计积累更多的经验。
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材料和方法
1.标本采集
共随访全国放射性事故受照者10人，受照时年龄20～53岁，现年28～61岁。取静脉血1 ml，肝素抗凝，暂不处理可放4℃冰箱保存1周以上。用兔分型血清(上海血液中心)鉴别MN杂合子个体。
2.细胞处理
参照Langlois的BR6方法，对红细胞固定和荧光抗体的标记。固定时防止细胞溶血，加福尔马林 0.8 ml(6.8%)。MN单克隆抗体购自英国血型参比实验室(Bristol)，标记在4℃暗处进行。
3.流式技术与变异细胞确定流式测定仪器为Becton Dickinson公司的FACS Calibur，采用氩离子激光器，激发波长 488 nm。
实验中测定变异的红细胞NO、NN，其不能结合红色荧光抗体而只结合绿色荧光抗体，变异率
，采样细胞3×106个，采样率5 000～6 000个/秒。
, 百拇医药
按照Langlois的BR6方法[4]，用标准MN、NN、MM和小鼠红细胞样品确定仪器的补偿增益、单抗的敏感性、特异性以及变异细胞的定位。根据标准样品中NO、NN的位置，并视待测样品MN的荧光强度范围的偏移作适当调整，以MN绿色荧光强度范围的80%作为NO出现区域，红色荧光强度范围由标准样品确定。NN和NO相邻，范围相同。
数据经SPSS 6.0作统计处理，包括一次、二次等曲线拟合，曲线相关、回归显著性检验等。
结果
以22例相似年龄正常成人[(37.5±9.3)岁，中位数37.0岁]为对照，NO变异率：(8.0±4.37)×10-6，NN 变异率:(4.8±3.47)×10-6。
随访10例事故病人，4人为MN血型，1例为MN弱阳性，且有溶血现象，未得到结果。具体资料见表1。
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表1 4例放射事故受照者资料
患者
年龄(岁)
受照后时间(年)
GPA变异率(×10-6)
全身剂量(Gy)
剂量率(Gy.min-1)
NO
NN
物理
生物
杰[5]
, http://www.100md.com
36
11
32.5
14.3
1.4
1.5*
8.02～10.18
燕[6]
32
12
78.3
40.3
2.6
, http://www.100md.com
2.0～2.2
17.60
武[7]
28
8
112.3
45.7
2.5
2.5
0.30～1.30
给[7]
61
, 百拇医药 8
120.7
8.3
2.4
2.9
0.75～0.90
注：生物剂量均为事故后8小时和8天所测染色体畸变“双着丝粒+环”的结果。上海“6.25”事故中的“龙”血型为MN弱阳性，且标本溶血未得到结果
GPA NO、NN变异率与生物剂量相关回归曲线拟合。NO与剂量相关系数0.9524，P=0.012，二次方拟合度比线性一次曲线好，分别为0.9583和0.9072。上海“6.25事故”中“给”的NN测定明显异常，去除此值，相关系数：0.9206，P=0.079，二次线性回归拟合度也比线性好(0.9211/0.8471)。回归方程如下：
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YNO=-3.22+41.53D
(1)
YNO=6.03+9.57D+11.39D2
(2)
YNN=1.12+16.88D
(3)
YNN=2.02-0.20D+7.22D2
(4)
NO线性回归曲线斜率(41.5±7.7)×10-6/Gy，高于原爆〔(27.0±5.9)×10-6/Gy〕、切尔诺贝利事故〔(21.0±3.7)×10-6/Gy〕的参数。
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讨论
GPA突变分析被应用于广岛原爆幸存者、巴西戈亚尼亚事故和切尔诺贝利事故受照者，建立了剂量效应标准曲线，以重建远期所受照射的剂量。本研究中的放射源事故其性质、辐射品质与原爆和切尔诺贝利事故较相似。
本文中各病例回顾剂量均大于1 Gy，当时都有急性放射病(ARS)的表现。GPA变异率与以往所得生物剂量作线性回归，NO有显著意义，而NN不能得出显著意义的线性回归曲线。切尔诺贝利事故ARS病人早期测定NO、NN均升高，而如本研究中放射事故病人8～12年后仅有NO的显著变化，广岛幸存者40年后测定也仅有NO的显著增高。两种变异细胞不同变化，可能的原因：①在照后一段时间内细胞突变被修复；②非稳定性突变的NN细胞被清除；③突变细胞为自我更新能力较差的造血祖细胞。
本研究中NO线性回归曲线斜率较高，切尔诺贝利事故中高剂量(>1Gy)、高剂量率者斜率为25×10-6/Gy，而低剂量(<1Gy)、低剂量率者斜率为4.1×10-6/Gy，在Jensen的研究中，主要是高剂量及高剂量率产生GPA突变效应，在低剂量(<0.1 Gy)、低剂量率的清扫工人中很少引起GPA位点的突变，同时也未观察到此人群中甲状腺结节性疾病危险性的增高，虽然其中还有成人甲状腺不敏感等因素[8]。除剂量率外，个体敏感性也影响斜率大小。病人“杰”即对射线较为敏感，照射前就有白细胞降低的记录[5]。
, 百拇医药
研究中发现NO变异率与剂量关系用二次线性拟合更佳，NN也是如此。Straume研究戈亚尼亚事故受照者，GPA NO变异率与双着丝粒成很好的线性关系，而后者的剂量效应为二次线性曲线，用二次曲线回顾剂量与“双+环”所得一致，而一次线性估计中、低剂量则偏低。切尔诺贝利事故去除2个异常者后，剂量效应关系也更符合二次线性模型。由此推断GPA突变机制是射线二次击中染色体DNA而产生，结合其他方法分析突变细胞的基因型，如发现片段缺失、倒位、插入易位等畸变多于点突变、末端丢失即证实上述推论。
根据原爆和放射源事故线性、二次线性参数，用YNO=a+b D和YNO=a+α D+β D2计算生物剂量，正常22人对照值作为GPA变异率本底水平a，生物剂量期望值由方程(1)得出。由表2看出，二次线性模型重建剂量大于一次线性模型。GPA变异率重建剂量除“杰”外，其余均偏高，说明不同人群、不同实验室建立的标准曲线不能随意引用，因为不同剂量、剂量率和射线品质因素影响剂量效应曲线外，还有个体间、实验条件等的差异。
, 百拇医药
表2 4例事故受照者的剂量回顾(Gy)
患者
本研究生物剂量期望值
“双+环”回顾剂量
用原爆斜率估算剂量
用切尔诺贝利事故曲线估算剂量
一次线性模型
二次线性模型＃
杰
0.86
1.46
0.91
, 百拇医药
1.11
1.92
燕
1.96
2.0～2.2
2.6
3.20
3.86
武
2.78
2.5
3.86
4.74
, 百拇医药
4.92
给
2.98
2.9
4.17
5.12
5.78
注：用YNO=a+b D,*b=27.0×10-6/Gy，**b=22.0×10-6/Gy；＃用YNO=a+α D+β D2计算，a为正常对照值，α=7.39，β=2.80
本课题受国家教委博士点资助(项目号：9740)
参考文献
, 百拇医药
1 Langlois RG,Akiyama M, Kusunoki Y, et al. Analysis of somatic cell mutations at the glycophorin A locus in atomic bomb survivors: a comparative study of assay methods. Radiat Res,1993,136:111-117.
2 Jensen RH, Bigbee WL, Langlois RG, et al. Elevated frequency of GPA mutations in erythrocytes from Chernoby1 accident victims. Radiat Res,1995,14：129-135.
3 Straume T, Langlois RG, Lucas J, et al. Novel biodosimetry methods applied to victims of the Goiania accident. Health Phys,1991,60:71-76.
, http://www.100md.com
4 Langlois RG, Nisbet BA, Ridinger DN, et al. An improved flow cytometric assay for somatic mutations at the glycophorin A locus in humans. Cytometry,1990,11:513-521.
5 傅宝华，邵志良，李殿祥，等.急性放射病一例临床报告.中华放射医学与防护杂志，1992，12：48-50.
6 王桂林，蒋本荣，黄士敏，等.两例中度骨髓型急性放射病人的临床报告.中华放射医学与防护杂志，1988，8：396-399.
7 刘本NFDA1，叶根耀，主编.上海“6.25”60Co源辐射事故病人诊断与救治文集，北京：科学技术出版社，1994.15-31.
8 Inskip PD, Hartshorne MF, Tekkel MT, et al. Thyroid nodularity and cancer among Chernoby1 clean-up workers from Estonia. Radiat Res,1997，147：225-235.
(收稿:1998-11-28 修回:1999-01-12), http://www.100md.com
单位：200032 上海医科大学放射医学研究所(桂红星、程文英、史剑慧、顾乃谷)；上海第二军医大学长海医院(许小平、章卫平、刘本)；河南省职业病防治所(傅宝华)
关键词：血型糖蛋白A(GPA)；单合子NO；纯合子NN；变异率Vf
中华放射医学与防护杂志/990421 【摘要】 目的 研究血型糖蛋白A(GPA, glycophorin A locus)突变分析用作新的辐射生物剂量计。方法 结合流式细胞分析和单克隆抗体标记技术，检测红细胞糖蛋白的变异。结果 随访全国10例放射源事故受照者，4人为MN杂合体，生物剂量在1.46～2.9 Gy，1人MN弱阳性。GPA NO变异率与剂量线性回归曲线有显著意义，曲线斜率41.53×10-6/Gy，而NN没有显著意义。结论 GPA变异率剂量效应曲线二次线性拟合比一次线性好。二次线性重建远期辐射剂量高于一次模型，用原爆、切尔诺贝利、戈亚尼亚事故参数回顾剂量多偏高。
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Assay of glycophorin A locus mutation in radiation accident victims
GUI Hongxing, CHENG Wenying, SHI Jianhui, et al.
Shanghai Institute of Radiation Medicine, Shanghai 200032, China.
【Abstract】 Objective Application of glycophorin A locus mutation assay as a new biodosimeter. Methods Using flow cytometry and immunolabeling to detect erythrocytes with variant glycoproteins on the surface membrane. Results Among 10 victims of radiation accidents 4 persons were determined as having MN heterozygotes with estimated dose of 1.46—2.9 Gy, and one suspected of having MN. Hemizygote NO variant frequency showed significant dose-response linear regression with slope of 41.53×10-6/Gy, while NN showed no significant regression. Conclusion Dose-response data are more fitted to the linear-quadratic model than to the linear model. Dose reconstructed with the linear-quadratic model is higher than that estimated with the latter. And doses estimated with standard curve of Hiroshima and Chernoby1 are higher than those assessed by assay of dicentrics plus rings after the accidents.
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【Key words】 Glycophorin A locus Hemizygote NO Homozygote NN Variant frequency
染色体畸变是检测放射损伤的传统方法，由于畸变不稳定、计数复杂，因而多用于急性放射事故的测定。近年来荧光原位杂交(FISH)、染色体早熟凝集反应(PCC)以及人类红细胞表面血型糖蛋白A(GPA)和次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)等被用作回顾性放射生物剂量计，方法虽多，但重建生物剂量仍缺乏实践与经验。
GPA是人类次要血型MN的血型抗原，两种类型M、N由共显性等位基因编码表达，人群中50%为杂合子MN。造血干细胞不同机制的基因突变，产生不同的变异细胞，如单合子NO、纯合子NN。GPA突变分析结合单克隆抗体标记和流式细胞技术，鉴别体内罕见的表型变异细胞，以反映体细胞突变水平。
GPA突变分析不同于染色体畸变等方法，其糖蛋白变异不影响红细胞寿命，位于干细胞的突变稳定终生不变，且方法简便快速，已用于原爆幸存者[1]、反应堆[2]及放射源事故[3]受照者的剂量回顾，本文作者随访了10例国内放射事故受照者，为GPA作为放射生物剂量计积累更多的经验。
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材料和方法
1.标本采集
共随访全国放射性事故受照者10人，受照时年龄20～53岁，现年28～61岁。取静脉血1 ml，肝素抗凝，暂不处理可放4℃冰箱保存1周以上。用兔分型血清(上海血液中心)鉴别MN杂合子个体。
2.细胞处理
参照Langlois的BR6方法，对红细胞固定和荧光抗体的标记。固定时防止细胞溶血，加福尔马林 0.8 ml(6.8%)。MN单克隆抗体购自英国血型参比实验室(Bristol)，标记在4℃暗处进行。
3.流式技术与变异细胞确定流式测定仪器为Becton Dickinson公司的FACS Calibur，采用氩离子激光器，激发波长 488 nm。
实验中测定变异的红细胞NO、NN，其不能结合红色荧光抗体而只结合绿色荧光抗体，变异率
，采样细胞3×106个，采样率5 000～6 000个/秒。, 百拇医药
按照Langlois的BR6方法[4]，用标准MN、NN、MM和小鼠红细胞样品确定仪器的补偿增益、单抗的敏感性、特异性以及变异细胞的定位。根据标准样品中NO、NN的位置，并视待测样品MN的荧光强度范围的偏移作适当调整，以MN绿色荧光强度范围的80%作为NO出现区域，红色荧光强度范围由标准样品确定。NN和NO相邻，范围相同。
数据经SPSS 6.0作统计处理，包括一次、二次等曲线拟合，曲线相关、回归显著性检验等。
结果
以22例相似年龄正常成人[(37.5±9.3)岁，中位数37.0岁]为对照，NO变异率：(8.0±4.37)×10-6，NN 变异率:(4.8±3.47)×10-6。
随访10例事故病人，4人为MN血型，1例为MN弱阳性，且有溶血现象，未得到结果。具体资料见表1。
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表1 4例放射事故受照者资料
患者
年龄(岁)
受照后时间(年)
GPA变异率(×10-6)
全身剂量(Gy)
剂量率(Gy.min-1)
NO
NN
物理
生物
杰[5]
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36
11
32.5
14.3
1.4
1.5*
8.02～10.18
燕[6]
32
12
78.3
40.3
2.6
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2.0～2.2
17.60
武[7]
28
8
112.3
45.7
2.5
2.5
0.30～1.30
给[7]
61
, 百拇医药 8
120.7
8.3
2.4
2.9
0.75～0.90
注：生物剂量均为事故后8小时和8天所测染色体畸变“双着丝粒+环”的结果。上海“6.25”事故中的“龙”血型为MN弱阳性，且标本溶血未得到结果
GPA NO、NN变异率与生物剂量相关回归曲线拟合。NO与剂量相关系数0.9524，P=0.012，二次方拟合度比线性一次曲线好，分别为0.9583和0.9072。上海“6.25事故”中“给”的NN测定明显异常，去除此值，相关系数：0.9206，P=0.079，二次线性回归拟合度也比线性好(0.9211/0.8471)。回归方程如下：
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YNO=-3.22+41.53D
(1)
YNO=6.03+9.57D+11.39D2
(2)
YNN=1.12+16.88D
(3)
YNN=2.02-0.20D+7.22D2
(4)
NO线性回归曲线斜率(41.5±7.7)×10-6/Gy，高于原爆〔(27.0±5.9)×10-6/Gy〕、切尔诺贝利事故〔(21.0±3.7)×10-6/Gy〕的参数。
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讨论
GPA突变分析被应用于广岛原爆幸存者、巴西戈亚尼亚事故和切尔诺贝利事故受照者，建立了剂量效应标准曲线，以重建远期所受照射的剂量。本研究中的放射源事故其性质、辐射品质与原爆和切尔诺贝利事故较相似。
本文中各病例回顾剂量均大于1 Gy，当时都有急性放射病(ARS)的表现。GPA变异率与以往所得生物剂量作线性回归，NO有显著意义，而NN不能得出显著意义的线性回归曲线。切尔诺贝利事故ARS病人早期测定NO、NN均升高，而如本研究中放射事故病人8～12年后仅有NO的显著变化，广岛幸存者40年后测定也仅有NO的显著增高。两种变异细胞不同变化，可能的原因：①在照后一段时间内细胞突变被修复；②非稳定性突变的NN细胞被清除；③突变细胞为自我更新能力较差的造血祖细胞。
本研究中NO线性回归曲线斜率较高，切尔诺贝利事故中高剂量(>1Gy)、高剂量率者斜率为25×10-6/Gy，而低剂量(<1Gy)、低剂量率者斜率为4.1×10-6/Gy，在Jensen的研究中，主要是高剂量及高剂量率产生GPA突变效应，在低剂量(<0.1 Gy)、低剂量率的清扫工人中很少引起GPA位点的突变，同时也未观察到此人群中甲状腺结节性疾病危险性的增高，虽然其中还有成人甲状腺不敏感等因素[8]。除剂量率外，个体敏感性也影响斜率大小。病人“杰”即对射线较为敏感，照射前就有白细胞降低的记录[5]。
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研究中发现NO变异率与剂量关系用二次线性拟合更佳，NN也是如此。Straume研究戈亚尼亚事故受照者，GPA NO变异率与双着丝粒成很好的线性关系，而后者的剂量效应为二次线性曲线，用二次曲线回顾剂量与“双+环”所得一致，而一次线性估计中、低剂量则偏低。切尔诺贝利事故去除2个异常者后，剂量效应关系也更符合二次线性模型。由此推断GPA突变机制是射线二次击中染色体DNA而产生，结合其他方法分析突变细胞的基因型，如发现片段缺失、倒位、插入易位等畸变多于点突变、末端丢失即证实上述推论。
根据原爆和放射源事故线性、二次线性参数，用YNO=a+b D和YNO=a+α D+β D2计算生物剂量，正常22人对照值作为GPA变异率本底水平a，生物剂量期望值由方程(1)得出。由表2看出，二次线性模型重建剂量大于一次线性模型。GPA变异率重建剂量除“杰”外，其余均偏高，说明不同人群、不同实验室建立的标准曲线不能随意引用，因为不同剂量、剂量率和射线品质因素影响剂量效应曲线外，还有个体间、实验条件等的差异。
, 百拇医药
表2 4例事故受照者的剂量回顾(Gy)
患者
本研究生物剂量期望值
“双+环”回顾剂量
用原爆斜率估算剂量
用切尔诺贝利事故曲线估算剂量
一次线性模型
二次线性模型＃
杰
0.86
1.46
0.91
, 百拇医药
1.11
1.92
燕
1.96
2.0～2.2
2.6
3.20
3.86
武
2.78
2.5
3.86
4.74
, 百拇医药
4.92
给
2.98
2.9
4.17
5.12
5.78
注：用YNO=a+b D,*b=27.0×10-6/Gy，**b=22.0×10-6/Gy；＃用YNO=a+α D+β D2计算，a为正常对照值，α=7.39，β=2.80
本课题受国家教委博士点资助(项目号：9740)
参考文献
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1 Langlois RG,Akiyama M, Kusunoki Y, et al. Analysis of somatic cell mutations at the glycophorin A locus in atomic bomb survivors: a comparative study of assay methods. Radiat Res,1993,136:111-117.
2 Jensen RH, Bigbee WL, Langlois RG, et al. Elevated frequency of GPA mutations in erythrocytes from Chernoby1 accident victims. Radiat Res,1995,14：129-135.
3 Straume T, Langlois RG, Lucas J, et al. Novel biodosimetry methods applied to victims of the Goiania accident. Health Phys,1991,60:71-76.
, http://www.100md.com
4 Langlois RG, Nisbet BA, Ridinger DN, et al. An improved flow cytometric assay for somatic mutations at the glycophorin A locus in humans. Cytometry,1990,11:513-521.
5 傅宝华，邵志良，李殿祥，等.急性放射病一例临床报告.中华放射医学与防护杂志，1992，12：48-50.
6 王桂林，蒋本荣，黄士敏，等.两例中度骨髓型急性放射病人的临床报告.中华放射医学与防护杂志，1988，8：396-399.
7 刘本NFDA1，叶根耀，主编.上海“6.25”60Co源辐射事故病人诊断与救治文集，北京：科学技术出版社，1994.15-31.
8 Inskip PD, Hartshorne MF, Tekkel MT, et al. Thyroid nodularity and cancer among Chernoby1 clean-up workers from Estonia. Radiat Res,1997，147：225-235.
(收稿:1998-11-28 修回:1999-01-12), http://www.100md.com