鲎试验法检查乳酸环丙沙星注射液的细菌内毒素限量
作者：陈铭军
单位：广西南宁市第一人民医院 南宁 530022
关键词：细菌内毒素；乳酸环丙沙星；鲎试验法
广西中医学院学报000133
中图分类号 R944.1
乳酸环丙沙星注射液是我院最近开始生产的制剂，本文根据细菌内毒素检查的实验设计[1]里的方法，对乳酸环丙沙星注射液的细菌内毒素检验进行了实验研究。
1 材料
鲎试剂(福建省福州东方鲎试剂厂，批号990308，标示灵敏度0.5Eu.ml-1，0.1ml/支；湛江安度斯生物有限公司，批号980729，标示灵敏度0.5Eu.ml-1，0.1ml/支)；细菌内毒素工作标准品(湛江安度斯生物有限公司，批号981124，0.5Eu/支，10Eu/支)；细菌内毒素检查用水(湛江安度斯生物有限公司，批号980730，2ml/支)，乳酸环丙沙星注射液(本院制剂室，批号990504，990702，990719，规格100ml:0.2g)。
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2 方法与结果
2.1 细菌内毒素限值(L)的确定 乳酸环丙沙星注射液热原检查剂量按家兔体重每1kg注谢3ml[2]。静脉给药时无任何不良反应的内毒素阈剂量K=5Eu.kg-1[1]。本品细菌内毒素理论限值L=5/3=1.6Eu.ml-1。
2.2 鲎试剂灵敏度的复核 按中国药典1995年版“细菌内毒素检查法”操作，根据鲎试剂灵敏度的标示值(0.5Eu.ml-1)，将细菌内毒素工作标准品(10Eu/支)用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成合适的2倍稀释浓度，即1.0Eu.ml-1，0.5Eu.ml-1，0.25Eu.ml-1，0.125Eu.ml-1，每稀释一步均置旋涡混合器上混合30秒钟。每一浓度平行做4管。结果两批鲎试剂反应结果相同，如表1所示。
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2.3 样品无抑制浓度的确定 以灵敏度λ=0.5Eu.ml-1的鲎试剂为基准，计算出样品的基准稀释倍数D=L/λ=1.6/0.5=3.2倍。用细菌内毒素检查用水将环丙沙星注射液样品稀释3.2倍，再按等比稀释将样品稀释为6.4，12.8，25.6，51.2倍，记为D系列样品溶液。取D系列样品溶液分别稀释内毒素工作标准品(0.5Eu.ml-1)，并得到一系列含有2λ(1Eu.ml-1)内毒素的样品溶液，记为E系列阳性样品溶液。用E系列阳性样品溶液分别对两批鲎试剂做试验，每一样品浓度做2管阳性样品对照，并用相同浓度的D系列样品溶液做一支阴性对照。结果两批鲎试剂的反应结果相同，如表2所示。试验结果表明，在1∶3.2倍时样品溶液已无抑制作用，所以样品可按1∶3.2倍或更高倍数稀释做鲎试验检查。
表1 两批鲎试剂灵敏度复核情况 内毒素浓度
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(Eu.ml-1)
1.0
0.5
0.25
0.125
阴性对照
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表2 不同浓度样品溶液鲎试验结果 样品稀释系列
1∶3.2
1∶6.4
1∶12.8
1∶25.6
1∶51.2
阳性样品对照
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(含2λ内毒素)
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阴性样品对照
(不含内毒素)
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2.4 抑制增强试验 当样品按1∶3.2倍稀释时，根据公式D=L/λ，计算得出做抑制增强试验的鲎试剂灵敏度λ=L/D=1.6/3.2=0.5Eu.ml-1,所以，我们采用灵敏度λ=0.5Eu.ml-1的鲎试剂做抑制增强试验。用细菌内毒素检查用水将乳酸环丙沙星注射液稀释3.2倍，此样品溶液记为D3.2。将内毒素工作标准品(10Eu/支)用D3.2样品溶液溶解，在旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成合适的2倍稀释浓度，即1.0Eu.ml-1，0.5Eu.ml-1，0.25Eu.ml-1，0.125Eu.ml-1，每稀释一步均置旋涡混合器上混合30秒钟，以此系列的样品分别对2批鲎试剂做抑制增强试验，以D3.2代替水做为阴性对照，测得了批样品的反应结果一致，如表3，表4所示。表3 抑制增强试验结果(鲎试剂批号990308) 内毒素浓度
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表4 抑制增强试验结果(鲎试剂批号980729) 内毒素浓度
(Eu.ml-1)
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阴性对照
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2.5 样品的细菌内毒素检测结果 将样品1∶3.2稀释后，分别用2批鲎试剂进行检测每一个批号的样品作2管，阴性对照1管，阳性对照1管，样品阳性对照1管(以1∶3.2倍样品溶液代替水稀释内毒素工作品)，最后的检测结果一致，如表5所示。表5 样品的细菌内毒素检测结果 样品批号
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管号
阴性
对照
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对照
样品
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990504
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990702
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990719
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2.6 家兔法热原检查 按中国药典1995年版操作，结果3批样品热原检查均符合规定。3 讨论
试验结果表明，将样品1∶3.2稀释溶液对标示灵敏度为0.5Eu.ml-12批不同厂家生产的鲎试剂均无抑制增强作用。样品的细菌内毒素试验表明，将样品1∶3.2稀释以标示灵敏度为0.5Eu.ml-1的鲎试剂可用于样品的细菌内毒素检测，与家兔法热原检查结果一致。
参考文献
[1] 黄清泉，夏振民.细菌内毒素检查的实验设计.中国药学杂志.1997，32(2)：72
[2] 中国卫生部标准WS-095(×-077)-95
收稿日期：1999-11-15, 百拇医药
单位：广西南宁市第一人民医院 南宁 530022
关键词：细菌内毒素；乳酸环丙沙星；鲎试验法
广西中医学院学报000133
中图分类号 R944.1
乳酸环丙沙星注射液是我院最近开始生产的制剂，本文根据细菌内毒素检查的实验设计[1]里的方法，对乳酸环丙沙星注射液的细菌内毒素检验进行了实验研究。
1 材料
鲎试剂(福建省福州东方鲎试剂厂，批号990308，标示灵敏度0.5Eu.ml-1，0.1ml/支；湛江安度斯生物有限公司，批号980729，标示灵敏度0.5Eu.ml-1，0.1ml/支)；细菌内毒素工作标准品(湛江安度斯生物有限公司，批号981124，0.5Eu/支，10Eu/支)；细菌内毒素检查用水(湛江安度斯生物有限公司，批号980730，2ml/支)，乳酸环丙沙星注射液(本院制剂室，批号990504，990702，990719，规格100ml:0.2g)。
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2 方法与结果
2.1 细菌内毒素限值(L)的确定 乳酸环丙沙星注射液热原检查剂量按家兔体重每1kg注谢3ml[2]。静脉给药时无任何不良反应的内毒素阈剂量K=5Eu.kg-1[1]。本品细菌内毒素理论限值L=5/3=1.6Eu.ml-1。
2.2 鲎试剂灵敏度的复核 按中国药典1995年版“细菌内毒素检查法”操作，根据鲎试剂灵敏度的标示值(0.5Eu.ml-1)，将细菌内毒素工作标准品(10Eu/支)用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成合适的2倍稀释浓度，即1.0Eu.ml-1，0.5Eu.ml-1，0.25Eu.ml-1，0.125Eu.ml-1，每稀释一步均置旋涡混合器上混合30秒钟。每一浓度平行做4管。结果两批鲎试剂反应结果相同，如表1所示。
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2.3 样品无抑制浓度的确定 以灵敏度λ=0.5Eu.ml-1的鲎试剂为基准，计算出样品的基准稀释倍数D=L/λ=1.6/0.5=3.2倍。用细菌内毒素检查用水将环丙沙星注射液样品稀释3.2倍，再按等比稀释将样品稀释为6.4，12.8，25.6，51.2倍，记为D系列样品溶液。取D系列样品溶液分别稀释内毒素工作标准品(0.5Eu.ml-1)，并得到一系列含有2λ(1Eu.ml-1)内毒素的样品溶液，记为E系列阳性样品溶液。用E系列阳性样品溶液分别对两批鲎试剂做试验，每一样品浓度做2管阳性样品对照，并用相同浓度的D系列样品溶液做一支阴性对照。结果两批鲎试剂的反应结果相同，如表2所示。试验结果表明，在1∶3.2倍时样品溶液已无抑制作用，所以样品可按1∶3.2倍或更高倍数稀释做鲎试验检查。
表1 两批鲎试剂灵敏度复核情况 内毒素浓度
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表2 不同浓度样品溶液鲎试验结果 样品稀释系列
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2.4 抑制增强试验 当样品按1∶3.2倍稀释时，根据公式D=L/λ，计算得出做抑制增强试验的鲎试剂灵敏度λ=L/D=1.6/3.2=0.5Eu.ml-1,所以，我们采用灵敏度λ=0.5Eu.ml-1的鲎试剂做抑制增强试验。用细菌内毒素检查用水将乳酸环丙沙星注射液稀释3.2倍，此样品溶液记为D3.2。将内毒素工作标准品(10Eu/支)用D3.2样品溶液溶解，在旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成合适的2倍稀释浓度，即1.0Eu.ml-1，0.5Eu.ml-1，0.25Eu.ml-1，0.125Eu.ml-1，每稀释一步均置旋涡混合器上混合30秒钟，以此系列的样品分别对2批鲎试剂做抑制增强试验，以D3.2代替水做为阴性对照，测得了批样品的反应结果一致，如表3，表4所示。表3 抑制增强试验结果(鲎试剂批号990308) 内毒素浓度
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2.5 样品的细菌内毒素检测结果 将样品1∶3.2稀释后，分别用2批鲎试剂进行检测每一个批号的样品作2管，阴性对照1管，阳性对照1管，样品阳性对照1管(以1∶3.2倍样品溶液代替水稀释内毒素工作品)，最后的检测结果一致，如表5所示。表5 样品的细菌内毒素检测结果 样品批号
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2.6 家兔法热原检查 按中国药典1995年版操作，结果3批样品热原检查均符合规定。3 讨论
试验结果表明，将样品1∶3.2稀释溶液对标示灵敏度为0.5Eu.ml-12批不同厂家生产的鲎试剂均无抑制增强作用。样品的细菌内毒素试验表明，将样品1∶3.2稀释以标示灵敏度为0.5Eu.ml-1的鲎试剂可用于样品的细菌内毒素检测，与家兔法热原检查结果一致。
参考文献
[1] 黄清泉，夏振民.细菌内毒素检查的实验设计.中国药学杂志.1997，32(2)：72
[2] 中国卫生部标准WS-095(×-077)-95
收稿日期：1999-11-15, 百拇医药