鲎试验法检查乳酸环丙沙星注射液的细菌内毒素限量

http://www.100md.com 《广西中医学院学报》 2000年第1期

     作者：陈铭军

    单位：广西南宁市第一人民医院 南宁 530022

    关键词：细菌内毒素；乳酸环丙沙星；鲎试验法

    广西中医学院学报000133

    中图分类号 R944.1

    乳酸环丙沙星注射液是我院最近开始生产的制剂，本文根据细菌内毒素检查的实验设计^[1]里的方法，对乳酸环丙沙星注射液的细菌内毒素检验进行了实验研究。

    1 材料

    鲎试剂(福建省福州东方鲎试剂厂，批号990308，标示灵敏度0.5Eu^.ml^-1，0.1ml/支；湛江安度斯生物有限公司，批号980729，标示灵敏度0.5Eu^.ml^-1，0.1ml/支)；细菌内毒素工作标准品(湛江安度斯生物有限公司，批号981124，0.5Eu/支，10Eu/支)；细菌内毒素检查用水(湛江安度斯生物有限公司，批号980730，2ml/支)，乳酸环丙沙星注射液(本院制剂室，批号990504，990702，990719，规格100ml:0.2g)。

    2 方法与结果

    2.1 细菌内毒素限值(L)的确定 乳酸环丙沙星注射液热原检查剂量按家兔体重每1kg注谢3ml^[2]。静脉给药时无任何不良反应的内毒素阈剂量K=5Eu^.kg^-1[1]。本品细菌内毒素理论限值L=5/3=1.6Eu^.ml^-1。

    2.2 鲎试剂灵敏度的复核 按中国药典1995年版“细菌内毒素检查法”操作，根据鲎试剂灵敏度的标示值(0.5Eu^.ml^-1)，将细菌内毒素工作标准品(10Eu/支)用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成合适的2倍稀释浓度，即1.0Eu^.ml^-1，0.5Eu^.ml^-1，0.25Eu^.ml^-1，0.125Eu^.ml^-1，每稀释一步均置旋涡混合器上混合30秒钟。每一浓度平行做4管。结果两批鲎试剂反应结果相同，如表1所示。

    2.3 样品无抑制浓度的确定 以灵敏度λ=0.5Eu^.ml^-1的鲎试剂为基准，计算出样品的基准稀释倍数D=L/λ=1.6/0.5=3.2倍。用细菌内毒素检查用水将环丙沙星注射液样品稀释3.2倍，再按等比稀释将样品稀释为6.4，12.8，25.6，51.2倍，记为D系列样品溶液。取D系列样品溶液分别稀释内毒素工作标准品(0.5Eu^.ml^-1)，并得到一系列含有2λ(1Eu^.ml^-1)内毒素的样品溶液，记为E系列阳性样品溶液。用E系列阳性样品溶液分别对两批鲎试剂做试验，每一样品浓度做2管阳性样品对照，并用相同浓度的D系列样品溶液做一支阴性对照。结果两批鲎试剂的反应结果相同，如表2所示。试验结果表明，在1∶3.2倍时样品溶液已无抑制作用，所以样品可按1∶3.2倍或更高倍数稀释做鲎试验检查。

    表1 两批鲎试剂灵敏度复核情况 内毒素浓度

    (Eu^.ml^-1)

    1.0

    0.5

    0.25

    0.125

    阴性对照

    1

    (+)

    (+)

    (-)

    (-)

    (-)

    2

    (+)

    (+)

    (-)

    (-)

    (-)

    3

    (+)

    (+)

    (-)

    (-)

    (-)

    4

    (+)

    (+)

    (-)

    (-)

    (-)

    表2 不同浓度样品溶液鲎试验结果 样品稀释系列

    1∶3.2

    1∶6.4

    1∶12.8

    1∶25.6

    1∶51.2

    阳性样品对照

    (+)

    (+)

    (+)

    (+)

    (+)

    (含2λ内毒素)

    (+)

    (+)

    (+)

    (+)

    (+)

    阴性样品对照

    (不含内毒素)

    (-)

    (-)

    (-)

    (-)

    (-)

    2.4 抑制增强试验 当样品按1∶3.2倍稀释时，根据公式D=L/λ，计算得出做抑制增强试验的鲎试剂灵敏度λ=L/D=1.6/3.2=0.5Eu^.ml^-1,所以，我们采用灵敏度λ=0.5Eu^.ml^-1的鲎试剂做抑制增强试验。用细菌内毒素检查用水将乳酸环丙沙星注射液稀释3.2倍，此样品溶液记为D_3.2。将内毒素工作标准品(10Eu/支)用D_3.2样品溶液溶解，在旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成合适的2倍稀释浓度，即1.0Eu^.ml^-1，0.5Eu^.ml^-1，0.25Eu^.ml^-1，0.125Eu^.ml^-1，每稀释一步均置旋涡混合器上混合30秒钟，以此系列的样品分别对2批鲎试剂做抑制增强试验，以D_3.2代替水做为阴性对照，测得了批样品的反应结果一致，如表3，表4所示。表3 抑制增强试验结果(鲎试剂批号990308) 内毒素浓度

    (Eu^.ml^-1)

    1.0

    0.5

    0.25

    0.125

    阴性对照

    1

    (+)

    (-)

    (-)

    (-)

    (-)

    2

    (+)

    (-)

    (-)

    (-)

    (-)

    3

    (+)

    (-)

    (-)

    (-)

    (-)

    4

    (+)

    (-)

    (-)

    (-)

    (-)

    表4 抑制增强试验结果(鲎试剂批号980729) 内毒素浓度

    (Eu^.ml^-1)

    1.0

    0.5

    0.25

    0.125

    阴性对照

    1

    (+)

    (-)

    (-)

    (-)

    (-)

    2

    (+)

    (-)

    (-)

    (-)

    (-)

    3

    (+)

    (-)

    (-)

    (-)

    (-)

    4

    (+)

    (-)

    (-)

    (-)

    (-)

    2.5 样品的细菌内毒素检测结果 将样品1∶3.2稀释后，分别用2批鲎试剂进行检测每一个批号的样品作2管，阴性对照1管，阳性对照1管，样品阳性对照1管(以1∶3.2倍样品溶液代替水稀释内毒素工作品)，最后的检测结果一致，如表5所示。表5 样品的细菌内毒素检测结果 样品批号

    管号

    阴性

    对照

    阳性

    对照

    样品

    阳性对照

    1

    2

    990504

    (-)

    (-)

    (-)

    (+)

    (+)

    990702

    (-)

    (-)

    (-)

    (+)

    (+)

    990719

    (-)

    (-)

    (-)

    (+)

    (+)

    2.6 家兔法热原检查 按中国药典1995年版操作，结果3批样品热原检查均符合规定。3 讨论

    试验结果表明，将样品1∶3.2稀释溶液对标示灵敏度为0.5Eu^.ml^-12批不同厂家生产的鲎试剂均无抑制增强作用。样品的细菌内毒素试验表明，将样品1∶3.2稀释以标示灵敏度为0.5Eu^.ml^-1的鲎试剂可用于样品的细菌内毒素检测，与家兔法热原检查结果一致。

    参考文献

    [1] 黄清泉，夏振民.细菌内毒素检查的实验设计.中国药学杂志.1997，32(2)：72

    [2] 中国卫生部标准WS-095(×-077)-95

    收稿日期：1999-11-15

    百拇医药网 http://www.100md.com/html/analecta/2003/09/01/85/004.htm