鲎试验法检测清开灵注射液中的细菌内毒素
作者：周海燕 薄少英
单位：北京中医药大学药厂(100029)
关键词：鲎试剂；细菌内毒素；清开灵注射液
首都医药990230摘要 目的：研究鲎试验法测定清开灵注射液中细菌内毒素的可行性。方法：细菌内毒素检查法。结果：清开灵注射液稀释16倍后，使用灵敏度为0.06Eu/ml的鲎试剂，可检测出其中的细菌内毒素。结论：用细菌内毒素检测清开灵注射液中的热原是可行的。
六十年代美国的Levine和Bang发现革兰阴性菌内毒素可以迅速地引起鲎血细胞裂解液形成凝固，从而开发了灵敏度和特异性都非常高的检测细菌内毒素的方法——鲎试验法。我国95年版药典仅收载了12种药品进行细菌内毒素检查〔1〕，且全部为西药。对中药注射液的鲎试验法检查，目前尚处于摸索阶段。为此，我们对清开灵注射液中细菌内毒素检查进行了探索性研究，认为鲎试验法检测该样品中的细菌内毒素是可行的。
, 百拇医药
1 实验材料
鲎试剂 福建省福州东方鲎试剂厂 厂标灵敏度0.06Eu/ml 批号：971117。厂标灵敏度0.25Eu/ml 批号：970722
细菌内毒素工作标准品 中国药品生物制品检定所 规格60Eu/支 批号 9703
细菌内毒素检查用水 中国药品生物制品检定所 规格10×10ml 批号 97-1S
清开灵注射液 北京中医药大学药厂 规格10ml/支 批号97051502 97093105 97113911 97114110
其它 同细菌内毒素检查法所用材料
2 实验方法和结果
2.1 灵敏度复核 按中国药典95年版二部附录进行〔1〕，结果两种鲎试剂的实测灵敏度均在标示值的0.5λ～2.0λ之间，符合规定。
, http://www.100md.com
2.2 细菌内毒素限值及有效稀释倍数 根据药品内毒素限值L＝K/M〔2〕，K为细菌内毒素的致热阈，为5.0Eu/kg，M为致热原检查剂量，为5.0ml/kg(家兔体重)，计算出清开灵注射液的内毒素限值为1.0Eu/ml。
进行内毒素检查时，不能使用灵敏度高于限值的鲎试剂，故需要对供试品进行稀释，其稀释倍数D＝L/λ〔2〕，λ为鲎试剂的灵敏度标示值(Eu/ml)。
2.3 抑制性试验〔3〕及克服抑制性的稀释倍数〔4〕 将清开灵注射液按等比倍数稀释，照细菌内毒素检查法操作，同时作阳性、阴性对照，可知该样品对鲎试剂凝胶存在抑制性。结果见表1。
表1 清开灵注射液抑制性试验结果 灵敏度
合格
, http://www.100md.com
合格
合格
不合格
(Eu/ml)
稀释倍数
97051502
97093105
97113911
97114110
阳性
阴性
0.25
1----------------
, 百拇医药
++--
0.06----------------
++--
0.25
2----------------
++--
0.06----------------
++--
0.25
4----------------
++--
0.06----------------
, 百拇医药
++--
0.25
8----------------
++--
0.06----------------
++--
0.25
16
-+----------
++++
++--
0.06
, http://www.100md.com
+---
-+--
-+--
++++
++--
0.25
32------------
-+--
++--
0.06
-+----------
+-++
++--
, 百拇医药
由上表可见，克服抑制性的稀释倍数为16倍，根据D＝L/λ，λ＝L/D＝1.0Eu/ml/16＝0.0625Eu/ml，由计算可知必须使用灵敏度高于0.0625Eu/ml的鲎试剂，并将样品稀释16倍时，才可应用此法检出内毒素。
2.4 干扰试验〔1，3〕
由抑制性试验得知，样品液稀释16倍时试验有效，由以下干扰试验加以证实。
将细菌内毒素检查用水及样品的16倍稀释溶液作为稀释液，分别溶解细菌内毒素工作标准品，使成每1ml含细菌内毒素0.12、0.06、0.03、0.015Eu/ml的浓度，参照中国药典95版二部附录修订稿“供试品干扰试验”项下进行检查〔5〕，结果见表2。
表2 清开灵注射液干扰试验结果
, 百拇医药 内毒素浓度(Eu/ml)
样品批号
0.12
0.06
0.03
0.015
阴性
97051502
++++
++++------------
97093105
++++
, 百拇医药 ++++------------
97113911
++++
++++
+-+---------
LAL溶解水
++++
++++
+-+---------
由以上结果，用细菌内毒素检查用水稀释的内毒素反应终点浓度λs＝0.045Eu/ml以及用样品稀释液稀释的内毒素反应终点浓度λt＝0.06Eu/ml，均在0.03～0.12Eu/ml之间，且λs/λt的值在0.5～2之间，可见样品在该浓度下不干扰试验。
, 百拇医药
3 讨论
清开灵注射液的细菌内毒素限值为1.0Eu/ml，但样品原液及高浓度稀释液对鲎试剂凝胶存在抑制性，必须经过进一步有效稀释，并用更高灵敏度的鲎试剂。本实验探讨了清开灵注射液应用鲎试剂法检测细菌内毒素的有效稀释倍数为16倍，同时需要使用灵敏度为0.06Eu/ml的鲎试剂。该实验方法可作为清开灵注射液热原检测的内控方法。 参考文献
1 中国药典.1995版.二部.1995：附录76
2 黄清泉.药品细菌内毒素检查的实验设计.中国药学杂志，1997，32(2)：72～74
3 Bacterial endotoxins test.USP XXIII.1995:1696～1697
4 邵卫木 梁.鲎法检测茵栀黄注射液热原.中成药，1997，19(2)：17～19
5 中国药典1995年版二部附录《细菌内毒素检查法》修订稿(草案).鲎与鲎试验法论文汇编(四).1997：8～9, 百拇医药
单位：北京中医药大学药厂(100029)
关键词：鲎试剂；细菌内毒素；清开灵注射液
首都医药990230摘要 目的：研究鲎试验法测定清开灵注射液中细菌内毒素的可行性。方法：细菌内毒素检查法。结果：清开灵注射液稀释16倍后，使用灵敏度为0.06Eu/ml的鲎试剂，可检测出其中的细菌内毒素。结论：用细菌内毒素检测清开灵注射液中的热原是可行的。
六十年代美国的Levine和Bang发现革兰阴性菌内毒素可以迅速地引起鲎血细胞裂解液形成凝固，从而开发了灵敏度和特异性都非常高的检测细菌内毒素的方法——鲎试验法。我国95年版药典仅收载了12种药品进行细菌内毒素检查〔1〕，且全部为西药。对中药注射液的鲎试验法检查，目前尚处于摸索阶段。为此，我们对清开灵注射液中细菌内毒素检查进行了探索性研究，认为鲎试验法检测该样品中的细菌内毒素是可行的。
, 百拇医药
1 实验材料
鲎试剂 福建省福州东方鲎试剂厂 厂标灵敏度0.06Eu/ml 批号：971117。厂标灵敏度0.25Eu/ml 批号：970722
细菌内毒素工作标准品 中国药品生物制品检定所 规格60Eu/支 批号 9703
细菌内毒素检查用水 中国药品生物制品检定所 规格10×10ml 批号 97-1S
清开灵注射液 北京中医药大学药厂 规格10ml/支 批号97051502 97093105 97113911 97114110
其它 同细菌内毒素检查法所用材料
2 实验方法和结果
2.1 灵敏度复核 按中国药典95年版二部附录进行〔1〕，结果两种鲎试剂的实测灵敏度均在标示值的0.5λ～2.0λ之间，符合规定。
, http://www.100md.com
2.2 细菌内毒素限值及有效稀释倍数 根据药品内毒素限值L＝K/M〔2〕，K为细菌内毒素的致热阈，为5.0Eu/kg，M为致热原检查剂量，为5.0ml/kg(家兔体重)，计算出清开灵注射液的内毒素限值为1.0Eu/ml。
进行内毒素检查时，不能使用灵敏度高于限值的鲎试剂，故需要对供试品进行稀释，其稀释倍数D＝L/λ〔2〕，λ为鲎试剂的灵敏度标示值(Eu/ml)。
2.3 抑制性试验〔3〕及克服抑制性的稀释倍数〔4〕 将清开灵注射液按等比倍数稀释，照细菌内毒素检查法操作，同时作阳性、阴性对照，可知该样品对鲎试剂凝胶存在抑制性。结果见表1。
表1 清开灵注射液抑制性试验结果 灵敏度
合格
, http://www.100md.com
合格
合格
不合格
(Eu/ml)
稀释倍数
97051502
97093105
97113911
97114110
阳性
阴性
0.25
1----------------
, 百拇医药
++--
0.06----------------
++--
0.25
2----------------
++--
0.06----------------
++--
0.25
4----------------
++--
0.06----------------
, 百拇医药
++--
0.25
8----------------
++--
0.06----------------
++--
0.25
16
-+----------
++++
++--
0.06
, http://www.100md.com
+---
-+--
-+--
++++
++--
0.25
32------------
-+--
++--
0.06
-+----------
+-++
++--
, 百拇医药
由上表可见，克服抑制性的稀释倍数为16倍，根据D＝L/λ，λ＝L/D＝1.0Eu/ml/16＝0.0625Eu/ml，由计算可知必须使用灵敏度高于0.0625Eu/ml的鲎试剂，并将样品稀释16倍时，才可应用此法检出内毒素。
2.4 干扰试验〔1，3〕
由抑制性试验得知，样品液稀释16倍时试验有效，由以下干扰试验加以证实。
将细菌内毒素检查用水及样品的16倍稀释溶液作为稀释液，分别溶解细菌内毒素工作标准品，使成每1ml含细菌内毒素0.12、0.06、0.03、0.015Eu/ml的浓度，参照中国药典95版二部附录修订稿“供试品干扰试验”项下进行检查〔5〕，结果见表2。
表2 清开灵注射液干扰试验结果
, 百拇医药 内毒素浓度(Eu/ml)
样品批号
0.12
0.06
0.03
0.015
阴性
97051502
++++
++++------------
97093105
++++
, 百拇医药 ++++------------
97113911
++++
++++
+-+---------
LAL溶解水
++++
++++
+-+---------
由以上结果，用细菌内毒素检查用水稀释的内毒素反应终点浓度λs＝0.045Eu/ml以及用样品稀释液稀释的内毒素反应终点浓度λt＝0.06Eu/ml，均在0.03～0.12Eu/ml之间，且λs/λt的值在0.5～2之间，可见样品在该浓度下不干扰试验。
, 百拇医药
3 讨论
清开灵注射液的细菌内毒素限值为1.0Eu/ml，但样品原液及高浓度稀释液对鲎试剂凝胶存在抑制性，必须经过进一步有效稀释，并用更高灵敏度的鲎试剂。本实验探讨了清开灵注射液应用鲎试剂法检测细菌内毒素的有效稀释倍数为16倍，同时需要使用灵敏度为0.06Eu/ml的鲎试剂。该实验方法可作为清开灵注射液热原检测的内控方法。 参考文献
1 中国药典.1995版.二部.1995：附录76
2 黄清泉.药品细菌内毒素检查的实验设计.中国药学杂志，1997，32(2)：72～74
3 Bacterial endotoxins test.USP XXIII.1995:1696～1697
4 邵卫木 梁.鲎法检测茵栀黄注射液热原.中成药，1997，19(2)：17～19
5 中国药典1995年版二部附录《细菌内毒素检查法》修订稿(草案).鲎与鲎试验法论文汇编(四).1997：8～9, 百拇医药